GB/T27539-2011
动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
Animalinfluenzadetection-Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionofinfluenzavirusA
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2012-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
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动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法
国家标准 GB/T27539一2011 动物流感检测 A型流感病毒 通用荧光RI-PCR检测方法 Animalinfluenzadetection一Methodofreal-timeRT-PCRfordetectionof influenzavirsA 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27539一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口
本标准起草单位北京出人境检验检疫局、广东出人境检验检疫 局,深圳匹基生物工程有限公司
本标准主要起草人:汪琳、林志雄、周琦、高志强、陈茹、乔彩霞、蒲静、杨伟、梁成珠
GB/T27539一2011 动物流感检测A型流感病毒 通用荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了A型流感病毒通用荧光RTPCR检测的操作方法
本标准适用于活动物及其产品中A型流感病毒的检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T27401实验室质量控制规范动物检疫 sN/T1330进出口生、,熟毛皮检验规程 缩略语 下列缩略语适用于本文件
Ct值每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数(C value DEPC;焦碳酸二乙酯(diethylpyroearbonate PBS,磷酸盐缓冲液配方见附录A)(phosphatebuffersaline' RNA;核糖核酸(ribonucleicacid) RT-PCR;反转录-聚合酶链式反应(re reversetranscriptionpolymerase chainreaction 原理 流感病毒(influenzavirus)属正粘病毒科,根据抗原特性及其基因特性的不同,流感病毒分为甲 (A)、乙(B)、丙(C)型
乙型变异性较弱、丙型抗原性比较稳定仅感染人类;甲(A)型抗原变异性最强
感染人类和其他动物,常引起世界性大流行
编码基质蛋白的M基因是A型流感病毒共有且较保守
采用Taqman技术,针对M基因中特定序列,合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针,探 针的5'端标记报告焚光基团(R),3'端标记淖灭荧光基团(Q)
在PCR退火阶段，一对引物和一条探针 同时与目的基因片段结合,探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到R所发出的 荧光信号;在PCR延伸阶段,Taq酶在引物的引导下沿着模板链合成新链,当链的延伸进行到探针结合 部位时,受到探针的阻碍而无法继续,Taq酶发挥5'--3'外切核酸酶的功能,将探针水解成单核苷酸,标 记在探针上的R基团就游离出来,R所发出的荧光不为Q所吸收而被检测仪所接收,随着PCR反应的 进行,PCR产物量与荧光信号呈现正比关系
GB/T27539一2011 材料与试剂 5.1仪器设备 5.1.1荧光PCR检测仪
5.1.2高速微型离心机(离心速度12000r/min以上). 5.1.3台式高速离心机(离心速度3000r/min以上)
5.2试剂 5.2.1除特别说明以外,本标准所用试剂均为分析纯,实验室用水符合GB/T6682的要求
所有试剂 均用无RNA酶污染的容器(用DEPC水处理后高压灭菌)分装
.2.2DEPC水(见附录B). 5 55 2. Trizol. .3 5 .2.4氯仿
5. .2.5异丙醇;一20C预冷
5 .2.6PBs:(121士2)C,15min高压灭菌冷却后,无菌条件下加人青霉素、链霉素各10000U/mL
5.2.775%乙醇;用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20C预冷
A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测引物、探针序列,反应液体系组成及使用注意事项见 5.2.8 附录B
6 抽样 6.1采样工具 下列采样工具应该经(121士2)C,l5min高压灭菌并烘干: -棉拭子 剪刀; 子; 注射器 1.5mL离心管; 研钵 6.2样品采集 6.2.1活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法如下 -取鼻拭子时将拭子深人鼻腔来回刮2次3次并旋转,取鼻腔分泌液; -取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上飘裂来回刮2次一3次并旋转,取咽喉分泌液 取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便， 将采样后的拭子分别放人盛有1.0mLPBs的1.5mL离心管中,加盖、编号
6.2.2脏器或肌肉组织 用无菌锻子采集待检脏器或肌肉组织,装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号
GB/T27539一2011 6.2.3血清、血浆 用无菌注射器直接吸取至无菌离心管中,编号备用
6.2.4动物皮 采样方法按照sN/T1330,将待检样品装人一次性塑料袋或其他灭菌容器,编号 6.3样品贮运 样品采集后,放人密闭的塑料袋内(一个采样点的样品放一个塑料袋),于保温箱中加冰、密封" 24h内送实验室
样品处理 o 6.4.1拭子 样品在混合器上充分混合后,用灭菌缀子将拭子中的液体挤出,3000r/min离心5min,吸取上清 液1ml转人无菌的1.5ml离心管中备用 6.4.2脏器或肌肉组织 取待检样品2.0g于洁净,灭菌并烘干的研钵中充分研磨,加10mLPBS混匀,4C,取上清液 1ml转人无菌的1.5mL离心管中,编号备用
6.4.3动物皮 先用消毒的锻子,剪刀将动物皮剪成1mm大小的颗粒,称取2.0g于无菌的研钵中,加液氮充分 研磨后,加10mLPBS混匀,4C,3000r/min离心5min,取上清液1mL转人无菌的1.5mL.离心管 中,编号备用
6.5样品存放 制备的样品在2C一8丫条件下保存应不超过24h,若需长期保存应置一70c以下,但应避免反 复冻融(冻融不超过3次. 操作方法 7.1实验室设置标准与生物安全管理 A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测按照GB/T27401,GB19489,GB/T19495.2的规定 7.2样品核酸提取 7.2.1在样品制备区进行
取n个灭菌的1.5ml离心管,其中"为被检样品、阳性对照与阴性对照 的和,编号
7.2.2每管加人600ALTrizol,分别加人被检样品、阴性对照、阳性对照各200L混匀,再加人 200alL氯仿,上下颠倒混匀
于4C,12000r/min离心15min 7.2.3取与7.2.1相同数量灭撇的1.5ml离心管,加人等体积异两脉(一20笔预冷),做标记. 吸取 本标准7.2.2各管中的上清液转移至相应的管中,吸取上清液,不能吸出中间层,颠倒混匀.
GB/T27539一2011 7.2.4于4C、12000r/min离心15min,小心倒去上清,加人60075%乙醇(一20C预冷),颠倒 洗涤
7.2.5于4,12000r/min离心10min,小心倒去上清,晾干
7.2.6加人1lAlLDEPC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用
提 取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增,若需长期保存应放置一70冰箱
7.3检测 7.3.1扩增试剂准备 在反应混合物配制区进行
荧光RT-PCR反应液体系组成见附录B,充分混匀后,转移至样品处理区
7.3.2加样 在样品处理区进行
在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人样品处理7.2.6中制备的RNA溶液各10L,盖紧管盖" 500r/min离心30s
7.3.3荧光RT-PCR反应 在检测区进行
将本标准7.3.2中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内,记录样品摆放顺序
循环条件设置 第一阶段,反转录42,30min.
第二阶段,预少性92C,3nmin 第三阶段,92C、10s,45C,30s,72C、1nmin,5个循环 第四阶段,92、10s,60,30s,40个循环,在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光
试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果
结果判定 8.1结果分析条件设定 直接读取检测结果
囤值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以闵值线刚好超过正常阴性样品 扩增曲线的最高点为准
8 质控标准 .2 8.2.1阴性对照无Ct值并且无扩增曲线
8.2.2阳性对照的Ct值应小于28.0,并出现典型的扩增曲线 8.2.3当8.2.1和8.2.2都成立时,此次试验才有效;否则,此次试验视为无效
88 结果描述及判定 3 8.3.1 阴性 无C值并且无扩增曲线,判为阴性
GB/T27539一2011 8.3.2 阳性 C值小于30,且出现典型的扩增曲线,判为阳性
8.3.3有效原则 Ct值大于30的样品建议重做
重做结果无C值者为阴性,否则为阳性
GB/27539?2011 ?A 淶?? λ?(PBs)? A.1A?(0.2mol/L?? NaH.POH.O27.6g,??,?1000mL A.2B?(0.2mol/L??) NaHPO7H.O53.6g.(NaHPO12H.071.6NaHPO2H.035.6g)? ?,?1000mL A.30.01mol/ILpl7.2λ? 0.2nmol/LA? 14ml 0.2nmol/LB? 36ml NaCl 8.5g ??1000mL
GB/T27539一2011 附 录 B 规范性附录 引物探针序列及RT-CR反应体系组成 B.1引物探针序列 引物探针序列见表B.1
表B.1引物探针序列 序 称 列 5'-GTCTTCTAACCGAGGTCGAAAC-3 上游引物 下游引物 5'-AAGATcTGTGTrcTTTccTGcAAA-3' -3 5'-(FAM)-cccTcAAAGccGAGATcGC(TAMRA). 探针 B.2RT-CR反应液体系组成 10×PCRBuffer 1.25AlL 上游引物(10pmol/) 0.5l 下游引物(104mol/1) 0.5L 探针(10mol/L) 0.4Al MgC(25mmol/L 0.75L dNTPs25mmol/L Al Taq酶 0.25Al RT-P(CR反转录酶颗粒 0.25颗 补H.O(RNase-free)至 15 B.3说明 DEPC水,是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA
B.4使用时的注意事项 在检测过程中,应严防不同样品间的交叉污染
反应液分装时应避免产生气泡.上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
RT-PCR反转录酶颗粒极易吸潮失活,应在室温条件下置于干燥器内保存,使用时取出所需数量 剩余部分立即放回干燥器中
动物流感检测A型流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB/T27539-2011
随着全球化进程的加速以及人类活动范围的扩大，动物和人类之间的接触越来越频繁，因此动物流感的防控越来越受到关注。其中，A型流感病毒是一种常见的动物流感病毒，也是引发公共卫生事件的重要病原体之一。
为了更好地预防和控制动物流感疫情的发生，需要开发出高效、快速、准确的检测方法。目前，针对A型流感病毒的检测方法主要包括传统的病毒分离、血清学检测、分子生物学检测等技术。
通用荧光RT-PCR技术是一种快速、准确、高效的分子生物学检测方法，对于动物流感中A型流感病毒的检测也具有重要的应用价值。GB/T27539-2011标准就制定了适用于动物流感中A型流感病毒的通用荧光RT-PCR检测方法。该标准主要包括样品采集、核酸提取、RT-PCR扩增等步骤，并且对实验条件、仪器设备等方面也进行了详细规定。
通过实验证明，基于通用荧光RT-PCR技术可以快速、准确地检测出动物流感中A型流感病毒，具有较高的检测灵敏度和特异性，可为动物流感疫情的防控提供重要的技术支持。
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