饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱串联质谱法

饲料中硝基咪唑类药物的测定液相色谱串联质谱法

国家标准 GB/T21995一2008 饲料中硝基咪陛类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationofnitroimidazolesinfeeds一 Liequidchromatography-tandemmmassspectroetrymethod 2008-06-17发布 2008-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21995一2008 前 言 本标准的附录A为资料性附录 本标准由农业部提出 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会归口 本标准起草单位:农业大学动物医学院 本标准主要起草人:沈建忠、张素霞、程林丽、肖希龙、李晓薇、曹兴元、王战辉
GB/T21995一2008 饲料中硝基咪陛类药物的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了饲料中硝基咪畦类药物含量的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和预混合饲料中甲硝陛,洛硝哒陛、二甲硝陛和替硝幽含量的 测定 本标准的检测限;饲料中甲硝陛、洛硝哒陛、二甲硝陛和替硝畦均为84g/kg 本标准的定量限;饲料中甲硝陛、洛硝哒陛、二甲硝陛和替硝陛均为254g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqISO3696:1987) GB/T14699.1 饲料采样 GB/T20195动物饲料试样的制备 方法原理 用乙酸乙酯提取试样中的硝基咪幽类药物,浓缩至近干后,溶解于0.1mol/L磷酸中,经正己烧液 液分配和MCx固相萃取柱净化,用液相色谱-串联质谱法测定,以色谱保留时间和质谱碎片离子共同 定性,外标法定量 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和GB/T6682中规定的二级水 甲醇,色谱纯 乙睛色谱纯 4.2 4.3乙酸乙肘 4.4磷酸 4.5正已院 4.6甲酸.色谱纯 4.7Mcx固相拳取柱;规格为60mg 4.8微孔逃膜,规格为0.2pm. 4.9甲硝陛(G ronidazole):纯度>98% met 4 10洛硝哒陛(ronidazole);纯度>98% 4 11 二甲硝陛(dimetridazole);纯度>98% 4.12替硝陛(tinidazole):纯度>98% 4.13磷酸溶液(0.1mol/L):取3.4ml磷酸于1L容量瓶中,用水定容至刻度,混匀 4.14固相萃取柱淋洗液:氨水十水十甲醇=0.2十10十0.2
GB/T21995一2008 4.15固相萃取柱洗脱液:氨水十水十甲醇=0.2十2+8 4 16硝基咪陛类药物混合标准贮备液(10004g/mL);称取甲硝陛(4.9),咯硝哒陛(4.10),二甲硝幽 (4.11)和替硝陛(4.12)各0.1g(精确到0.0001g)于100ml容量瓶中,用乙晴溶解定容 一20C可 保存3个月 4.17硝基咪陛类药物混合标准贮备液(2004g/mL);移取10004g/ml硝基咪幽类药物混合标准贮 备液(4.16)10ml于50mL容量瓶中,用乙晴稀释定容 4C可保存1个月 4.18标准工作液;移取适量2004g/mL硝基咪幽类药物混合标准贮备液(4.17),用乙睛稀释定容,配 制成0.01,0.05,0.1,0.5、1、5、104g/mL的标准工作液 4C可保存1周 仪器和设备 5.1实验室常用仪器、设备 5.2液相色谱-串联质谱联用仪;配电喷雾离子源 55 分析天平;感量为0.01g和0.0001g 3 5.4旋涡混合器 5.5离心机 5.6振荡器 5.7旋转猴发仪 5.8固相萃取装置 采样与试样制备 按GB/T14699.1规定采集试样后,按GB/T20195规定,取有代表性的样品1kg,四分法缩减,取 约200g，经粉碎,全部过0,45mm孔筛,混匀装人磨口瓶中备用 分析步骤 7.1提取 称取2g(精确到0.01g)试样于50mL离心管中,加15mL乙酸乙酯,涡动1min，300r/min振荡 30min ,3800r/min离心10min 取上清液于100ml鸡心瓶中,下层残渣用15ml乙酸乙酯重复提 取一次 合并两次上清液,为样品提取液 7.2净化 将样品提取液于35C浓缩至近干 加300AL乙酸乙酣,涡动10.,再加ml.正己院,涡动30s. 全部转移至10mL离心管中 往鸡心瓶中再加1.5ml磷酸溶液(4.13),涡动1min,全部转移至同一 离心管中 加盖密团,手摇混合,60or/min离心10nmin 吸取下层水相于5ml试管,上层有机相用 1.5mL磷酸溶液(4.13)重复萃取一次,合并两次水相作为固相萃取上样液 将MCX固相萃取柱安装于固相萃取装置上,依次用2ml乙睛、2ml磷酸溶液(4.13)活化 将固 相萃取上样液加载到固相萃取柱上 依次用1mL磷酸溶液(4.13)、2mL固相萃取柱洗涤液(4.14)淋 洗,抽真空1min 用2mL固相萃取柱洗脱液(4.15)洗脱 上样溶液和洗脱液的流速均控制在不超过 往洗脱液中加20L甲酸,混匀 50C氮气吹干后,用2ml乙睛复溶,过0.2wm滤膜,供 1ml/min 液相色谱-串联质谱仪测定 7.3测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱:C 柱,长150mm,内径2.lmm,粒径5Am,或相当者
GB/T21995一2008 流动相:甲醇十水,梯度洗脱,梯度洗脱条件见表1 表1梯度洗脱条件 时间/minm 水/9% 甲醇/% 100 0.0 12 70 30 l6 100 25 l00 流速:0.2nmL/min 柱温;室温 进样量:10aL 7.3.2串联质谱条件 离子化模式;电喷雾电离,正离子扫描(ESI十). 离子部喷雾电压;d.5kv. 离子源温度;8o 脱溶剂温度;300C 毛细管电压3V 碰撞气;氯气 监测模式:多反应监测 4种硝基眯陛类药物的定性离子对,定量离子对、锥孔电压和碰撞能量,见表2. 表24种硝基咪陛类药物的定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量 称 定性离子对(m/z 定量离子对(m/z 锥孔电压/V 碰撞能量/eV 1 201/140 201/140 18 洛硝哒哗 23 201/55 172/128 14 甲硝坐 172/128 22 172/82 23 142/96 16 二甲硝哗 25 142/96 142/81 25 248/120.7 l7 248/120.7 替硝陛 20 248/92.7 1" 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 根据试样溶液中药物的含量,选择峰面积相近的标准工作液和样品溶液等体积参插进样 通过液 相色谱保留时间与质谱选择离子共同定性 样品中待测药物与标准物质的保留时间相对偏差不大于 2.5%,而且其选择离子的相对丰度的差异不大于10% 4种药物的标准溶液选择离子色谱图参见 图A.1 7.3.3.2定量测定 分别取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液作单点校准或多点校准,以色谱峰面积积分值定 量 标准工作液及试样液中药物的响应值均应在仪器检测的线性范围内,试样液进样过程中应参插标 准工作液,以便准确定量
GB/T21995一2008 结果计算 饲料中硝基眯陛类药物的含量X,以质量分数计,数值以毫克每千克(mg/kg)表示,按式(1)计算 c×V×n X= 1 m 式中: 试样液中对应的硝基眯陛类药物的浓度,单位为微克每毫升(ug/mL) 试样液总体积,单位为毫升(mL); 稀释倍数; 试样质量,单位为克(g). m 测定结果用平行测定后的算术平均值表示,保留三位有效数字 精密度 在重复性条件下完成的两个平行测定结果的相对偏差不大于20%
GB/T21995?2008 ?A ?? ????? 9.72 TIC 100 1.97e5 % 10.04 TIC 100 492e4 0.99 Ic 3.90e4 l1.31 TIc 2.78e4 tmin 2.00 4.00 8.00 6.00 10.0012.0014.0016.0018.0020.0022.00 Ψ" B ; C ; ID ? ?A.125ng/mL??????