农药登记毒理学试验方法第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

农药登记毒理学试验方法第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验

国家标准 GB/T15670.19g一2017 农药登记毒理学试验方法 第 19部分:体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验 Iosieologiealtestmethodsforpestieidesregistration- Part19:Invitromammaliancellschromosoeaberrationtest 2017-07-12发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T15670.19一2017 农药登记毒理学试验方法 第19部分:体外哺乳动物细胞染色体 畸变试验 范围 GB/T15670的本部分规定了体外哺乳动物细胞染色体畸变试验的基本原则,方法和要求 本部分适用于为农药登记而进行的体外哺乳动物细胞染色体畸变试验 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 件 GB/T15670.l4一2017农药登记毒理学试验方法第14部分;细菌回复突变试验 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 结构畸变struecturalaberration 在细胞分裂的中期相阶段,用显微镜检出的染色体结构改变,表现为缺失、断片、互换等 结构畸变 可分为染色体型畸变ehromosometypeaberration)和染色单体型畸变(chromatidtypeaberration) 两类 3.2 chrommatid-ty 染色单体型畸变 typeaberration 染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤 3.3 染色体型畸变chromosomctypeaberrationm 染色体结构损伤,表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变 3.4 有丝分裂指数mitoticindex 中期相细胞数与所观察的细胞总数之比值,是一项反映细胞增殖程度的指标 3.5 多倍体polyplody 哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体,在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加,如三倍 体,四倍体等 试验目的 本试验检测受试物是否引起培养的哺乳动物细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性
GB/T15670.19一2017 5 试验概述 在加人和不加人代谢活化系统的条件下,使培养的哺乳动物细胞暴露于受试物中 用中期分裂相 阻断剂(如秋水仙素或秋水仙胺)处理,使细胞停止在中期分裂相,随后收获细胞,制片,染色,分析染色 体畸变 大部分的致突变剂导致染色单体型畸变,偶有染色体型畸变发生 虽然多倍体的增加可能预示着 有染色体数目畸变的可能,但本方法并不适合用于测定染色体的数目畸变 6 试验方法 6. 受试物和试剂 6.1.1受试物的配制 固体受试物需溶解或悬浮于溶剂中,用前稀释至适合浓度;液体受试物可以直接加人试验系统和 或用前稀释至适合浓度 受试物应在使用前新鲜配制,否则就必须证实贮存不影响其稳定性 溶剂必 须是非致突变物不与受试物发生化学反应,不影响细胞存活和s9活性 首选溶剂是培养液(不含血 清)或水,二甲基亚碱(DMsO)也是常用溶剂,使用时浓度不应大于0.5% 6.1.2剂量设计 6.1.2.1最高浓度的选择 决定最高浓度的因素是细胞毒性、受试物在试验系统中的溶解度以及pH或渗透压(osmolality)的 改变 细胞毒性的确定应使用指示细胞完整性和生长情况的指标,在活化系统存在或不存在的两种条件 下确定细胞毒性,例如细胞覆盖程度(degreeofconfluency)、活细胞数(viablecellcounts)或有丝分裂 指数(mitoticindex) 应在预试验中确定细胞毒性和溶解度 6.1.2.2试验剂量 至少应设置3个可供分析的浓度 当有细胞毒性时,其浓度范围应包括从最大毒性至几乎无毒性; 浓度间隔系数通常介于2I之间 在收获细胞时,最高浓度应能明显降低细胞覆盖程度、细胞计数或有丝分裂指数(均应大于50%. 对于相对无细胞毒性的化合物,最高浓度应是54L/mL,5mg/mL或0.01mol/L 对于相对不溶的受试物,在接近不溶解浓度时仍无细胞毒性,则最高剂量应采用染毒结束时的最终 培养液中溶解度限值以上的一个浓度,在某些情况下(如细胞毒性仅发生在高于最低不溶解浓度水平)， 应设一个以上可见沉淀的浓度 6.1.3对照物 6.1.3.1阳性对照物 可根据受试物的性质和结构选择适宜的阳性对照物,阳性对照物应是已知的断裂剂,能引起可检出 的、并可重复的阳性结果 不需要外源性代谢活化系统的阳性物有甲碱酸甲(methylmethanesulom ate， ,MMS)、甲碱酸乙醋(ethylmethanesulfonate,EMS)乙基亚硝基脉(ethylnitrosourea),丝裂霉素C mitomyeinC)、4-硝基咋咻-N-氧化物(4-nitroquin6 noline-N-oxide) 需要外源性代谢活化系统的阳性
GB/T15670.19一2017 物有苯并(a)芪[benzo(a)pyrene],环磷酰胺(cyclophosphamide). 6.1.3.2阴性对照物 应设阴性对照,即仅含和受试物组相同的溶剂,不含受试物,其他处理和受试物组完全相同 如未 能证实所选溶剂不具有致突变性,溶剂对照与本实验室空白对照背景资料有明显差异,还应设空白 对照 6.1.4培养液 采用Eagle氏最低必需培养基(minimalessentialmedium,Eagle),并加人非必需氨基酸和抗菌素 青、链霉素,按100IU/mL),胎牛血清或小牛血清按10%加人 也可选用其他合适的培养液 6.1.5活化系统 通常使用的是S9混合物(S9mix) S9是从经酶诱导剂处理的啃齿动物肝脏获得的 S9的制备 9的使用表度为1%一10%终浓度》s》m这中所加辅助因子的量 见GB/T15670.14一2017的5.7 由各实验室自行决定,但需对s9mix的活性进行鉴定,应能明显活化阳性对照物 也可使用下述配方 S9 0.125ml MgCl.(0.4mol/I 0.02ml KCl(1.65mol/L 0.02ml 葡萄糖-6-磷酸 1.791mg 辅酶I(氧化型,NADPy 3.0615mg 用无血清MEM培养液补足至1mL 6.2试验步骤 6.2.1细胞;可使用已建立的细胞株或细胞系,也可使用原代培养细胞 所使用的细胞应该在生长性 能、染色体数目和核型、自发的染色体畸变率等方面有一定的稳定性 推荐使用仓鼠卵巢(CHO) 细胞株、仓鼠肺(CHL)细胞株、人或其他哺乳动物外周血淋巴细胞 6.2.2试验时,应同时设阳性对照组、阴性对照组和至少3个可供分析的受试物浓度组 6.2.3试验前一天,将一定数量的细胞接种于培养皿(瓶)中,置于cO 培养箱内培养 6.2.4试验需在加人和不加人S9mix的条件下进行 试验时,吸去培养皿(瓶)中的培养液,加人一定 浓度的受试物,S9mix(不加S9mix时,需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液,置于培养箱中 处理3h一6h 结束后,吸去含受试物的培养液,用Hanks液洗细胞3次,加人含10%胎牛血清的培养 液,放回培养箱,于24h内收获细胞 收获前2h一4h,加人细胞分裂中期阻断剂(如用秋水仙素,作用 时间为4h,终浓度为1g/mL) 当难以得出明确结论时,应更换试验条件,如改变代谢活化条件、受试物与试验系统接触时间等重 复试验 6.2.5收获细胞时,用0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞,待细胞脱落后,加人含10%胎牛或小牛血清的培 养液终止胰蛋白酶的作用,混匀,放人离心管以1000r/min1200r/min的速度离心5min~7min 弃去上清液,加人0.075mol/LKCl溶液低渗处理,继而以新配制的甲醉和冰乙酸液(容积比为3:1)进 行固定 空气干燥或火焰干燥法常规制片,用姬姆萨染液(pH值6.8~7.0)染色 6.2.6作染色体分析时,每一处理组分析200个中期分裂相细胞(阳性对照可分析100个中期分裂相细 胞) 在分析时应记录每一观察细胞的染色体数目,对于畸变细胞还应记录显微镜视野的坐标位置及畸 变类型 结果均用百分比表示
GB/T15670.1g一2017 6.3统计处理 对染色体畸变细胞率用X””检验,以评价受试物的致突变性 6.4结果评价 在下列两种情况下可判定受试物在本试验系统中具有致突变性: 受试物引起染色体结构畸变数具有统计学意义的增加,并有剂量相关性; a b)受试物在任何一个剂量条件下,引起染色体结构畸变数具有统计学意义的增加,并有可重复性 在评价时应把生物学意义和统计学意义结合考虑,统计学意义不能作为阳性反应唯一的决定因素 试验报告 试验报告至少应包括以下内容: a)试验名称,试验单位名称和联系方式、报告编号 b 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况 e)试验开始和结束日期试验项目负责人,试验单位技术负责人,签发日期 试验摘要 d) e 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAs号如已知、代码如有)、纯度(或含量、 剂型、生产日期(批号)、外观性状、配制所用溶剂和方法; 细胞株名称 f 试验条件和方法 g 代谢活化系统;制备S9时所用酶的诱导剂、选用的动物品种和来源、S9mix的配方 2) 对照物-阳性对照物名称和选用浓度,阴性(溶剂)对照物名称及使用浓度; 3) 培养液;所用培养液名称、血清类别和使用浓度; 接种时的细胞浓度以及所用培养皿(瓶)的规格 5 中期分裂阻断剂:名称,所用浓度、作用时间; 处理时间:受试物与试验系统的接触时间 6) 7)制片方法、分析的中期分裂相数目、结果评价方法 试验结果 h) 1 受试物最高剂量的确定及试验结果:细胞毒性的测定,溶解情况,对pH和渗透压的影响 如果有影响); 2 各处理组和对照组染色体畸变细胞率 3 本实验室的阳性对照组和阴性对照组(常用溶剂,如DMsO)在本实验室历史上的染色体 畸变率范围,均值和标准差(说明样品数); i 试验结论给出受试物在试验条件下是否引起体外培养的细胞染色体畸变的结论,必要时对有 关问题进行讨论 原始记录保存情况的说明

农药登记毒理学试验方法第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验GB/T15670.19-2017

体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种常用的毒理学试验方法，广泛应用于农药、化学品等领域的安全性评估中。

该试验主要通过给予待测物质不同剂量的细胞培养液，并观察细胞核的形态、数量、染色体数目及结构是否发生异常来判断其致癌和基因毒性。这种试验可以检测出农药对人体健康的潜在影响，为农药登记提供科学依据。

这项试验的标准为GB/T15670.19-2017，《农药登记毒理学试验方法 第19部分：体外哺乳动物细胞染色体畸变试验》。该标准规定了试验所用的实验动物、试验程序、结果判断等方面的具体要求。

需要注意的是，进行体外哺乳动物细胞染色体畸变试验时需要严格遵守实验室操作规范，确保试验过程的准确性和可靠性。同时，实验者应该关注细胞培养液的成分、浓度和温度等因素对实验结果的影响。

总之，体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种常用的毒理学试验方法，可以有效评估农药对人体健康的潜在影响。通过该试验的结果，可以为农药的安全使用提供科学依据。

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