猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T35912一2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 RealtimeRI-CRmethodfordetectionofporeinereproduetive andrespiratorysyndrommevirus 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35912一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:上海出人境检验检疫局、农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局,湖南圣湘生物科技有限公司、检验检疫科学研究院 本标准主要起草人:张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、李树清、花群义、杨忠苹、李国新、王巧全、 王艳、林颖峥、蔡开妹、喻正军、林祥梅、吴绍强
GB/35912一2018 猪繁殖与呼吸综合征病毒 荧光RT-PCR检测方法 范围 本标准规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测的操作方法 本标准适用于猪繁殖与呼吸道综合征病毒美洲型毒株核酸检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 Real-timeRT-PCR:荧光反转录聚合酶链式反应(real-timereversetranscriptpolymerasechainre- action C值;每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数(eyelethreshold) RNA;核糖核酸(ribonueleicacd Ta酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase se TE缓冲液;Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbufer) DEPC:焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate PRRSV:猪繁殖与呼吸综合征病毒(poreinereproductiveandrespiratorysyndromevirus) PBS;磷酸盐缓冲液(phosphatebuferedsolution) 仪器 4.1荧光PCR检测仪 高速台式冷冻离心机.可控温至4亡.离心速度可达1y00r/mn以上 4.2 4.3组织研磨器或者研钵 4.4普通冰箱:2C一8C 4.5超低温冰箱可控温至一70C以下 4.6微量移液器:0.2AL2AL、1AL10L,10ML1004L,20AL200L、100ML1000AL,并 配备与移液器匹配的吸头 4.7高压灭菌锅
GB/T35912一2018 5 耗材 5.11.5ml无RNA酶离心管 5.20,2ml.PCR薄壁管或八联管 6 试剂 除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求 6.1 6.2Trizol,商品化RNA抽提试剂，4C8C保存 6.3氯仿;常温保存 6.4异丙醇;使用前预冷至一20C 6.5无水乙醉;一20C预冷 6.675%乙醇;无水乙醇和双蒸水配制,一20C预冷 6.7DEPC水;配制见A.l,也可购买商品化DEPC水 6.8PBS;配制见A.2 6.9 Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液:Taq酶浓度为5U/L,Taq酶反应缓冲液中Mg浓度 mmol/L 为15 6.10逆转录酶及10倍逆转录酶反应缓冲液:逆转录酶浓度为50U/AL,一20C保存,避兔反复冻融 6.11RNA酶抑制剂(40U/AL);-20C保存,避免反复冻融 6.12dNTPs;含dATP,dG;TP,dcTP,dTTP各10mmol/L,-20c保存,避免反复冻融 6.13引物和TaqMan探针,其序列见附录B 6.14猪繁殖与呼吸道综合征病毒阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照为非感染性体外转录 RNA;阴性对照为健康猪的组织材料 6.15内参照质粒:带有人已珠蛋白基因的质粒 样品采集和处理 7.1采样工具 7.1.1手术刀,剪刀,锻子,经160C干热灭菌2h. 7.1.2注射器 7.1.3 -次性无菌采样拭子 7.1.4组织研磨器或者研钵,经160C干热灭菌2h 7.1.5真空采血管 7.2样品采集 7.2.1血清样品采集;用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5mL,置于无菌离心管内,室温或者 37C倾斜放置自然凝集20min30min,2000r/min3000r/min离心10nmin,吸取上清液到新的离 心管内备用 7.2.2公猪精液;按照GB/T25172的方法采集和保存精液 7.2.3口腔拭子;大猪使用保定器保定,小猪可以双手保定,用采样拭子蘸取口腔分泌物,放人无菌采 样管中 7.2.4肺灌洗液:完整摘取肺脏/肺叶,送实验室进行灌洗
GB/35912一2018 7.2.5组织样品采集;取肺脏、淋巴结,扁桃体,脾脏等组织,置于无菌离心管内备用 7.2.6细胞培养物:细胞培养物反复冻融3次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5ml无RNA酶的 灭菌离心管内,编号备用 7.3样品保存和运输 7.3.1 上述采集的样品可立即用于检测 不能立即检测的样品,在2C一8下保存应不超过24h -20士5下应不超过3个月,一70C以下可长期保存 样品运送采用低温保存进行运输,并在规 定温度下的保存期内送达 7.4样品处理 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取 7.4.2口腔拭子样品:加人500AL无菌PBS,充分涡旋震荡1min,反复挤压拭子,弃去拭子后 3000r/min离心5min,取上清用于后续的核酸提取 7.4.3肺灌洗液;根据肺脏/肺叶的大小,通过肺管加人5ml10ml无菌PBs,反复揉捏,吸取灌洗 液,3000r/min离心5min,取上清用于核酸提取 7.4.4组织样品;取1g组织,剪碎,加人2mlL生理盐水进行研磨,制备组织匀浆,8000r/min离心 5min,取上清用于后续的核酸提取 7.4.5细胞培养物;4000 r/min,4C离心10min,取上清用于后续的核酸提取 荧光RT-PCR操作程序 8.1RNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作 RRNA抽提使用Trizol手工提取,也可以使用等效的商品化试剂盒 8.1.2取n个灭菌的1.5ml无RNA酶离心管,其中"为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个 离心管进行编号 8.1.3每管先加人600ALTiol裂解液,再分别加人被检样品,阳性对照,阴性对照各200L,颠倒 10次混匀,最后加人200AL氧仿,涡旋震荡5s,4C条件下12000r/min离心15min 8.1.4将上层透明液体(约400L)转移到一个新的无RNA酶的离心管中,加人等体积预冷的异丙醇、 每个离心管对应编号 8.1.512000r/min离心15min,弃去上清,沿管壁缓缓加人0.8mL1mL75%乙醇,颠倒36次混 匀,12000r/min离心10min 反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然脉干或用移液器移去 残液 8.1.6加人20ALDEPC水,轻轻混匀,溶解RNA 提取的RNA应尽快进行反转录扩增或放置于 -70C冰箱保存 8.1.7提取过程中要注意交叉污染,移液过程每份样品都需要更换吸头;不同样品离心管倒扣在吸水 纸上的不同位置 8.2荧光CR检测 8.2.1 反应体系的配制 在试剂配制区进行 设实时荧光PCR反应管数为n,n为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按n+1个反应进行配制 配制反应液在冰盒 中进行
GB/T35912一2018 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀,按照每管44.8L分装于0.2mL透明PCR管内,将 PCR管置于96孔板上.按顺序加样并做好标识,转移至核酸提取区 8.2.3加样 在核酸提取区进行 在每个PCR反应管内加人0.2L的内参照质粒,并分别加人8.1制备的核酸 5L RNA溶液,盖上盖子,500r/min1000r/min离心30s 转移至检测区 8.2.4上机检测 8.2.4.1荧光通道设置 在检测区进行 将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,设置探针;5'选择FAM、 HEx和ROX三个荧光通道,3'均选择无(None)荧光 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段,反转录42,30min; 第二阶段,预变性95C,1， mln; 第三阶段.变性95C/15s,退火、延伸、荧光采集60C/30s,40个循环 第四阶段,冷却25,10s 检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和C值判定结果 9 结果判定 9.1阔值设定 闽值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准 9.2质量控制 PRRsV阴性对照.FAM通道无报告C'值或无典型的S型扩增曲线,HEx通道无报告c值或 9.2.1 无典型的s型扩增曲线,ROX通道C值<36且扩增曲线为典型的S型 g.2.2PRRSV阳性对照:FAM通道C值<30,HEX通道C值<30,ROX通道C值<36,且3个通 道的扩增曲线均为典型的s型 9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次实验中同时满足,否则,本次实验无效,需重新进行 g.3结果描述及判定 9.3.1被检样本检测结果中FAM通道C值一38,HEx通道C值二38,且扩增曲线均为典型的s曲 线,报告为PRRSV美洲型变异株核酸阳性;3836,则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验
GB/35912一2018 附 录 A 规范性附录 溶液配制 DEPC水配制 A.1 每升去离子水中加人1mLDEPC,用力摇匀,使DEPC充分混匀在水中,37C放置12h以上,再经 121C、,l5nmin高压灭菌备用 A.2磷酸盐缓冲液(0.01mol/LPBs,pH7.4) 用800ml燕溜水溶解8gNaCI,0.2gKCI,1.44gNaHPO和0.24gKH,PO 用HCl调节溶 液的pH至7.4,加水至1L 分装后经121C、15min高压灭菌后备用
GB/T35912一2018 附 录 B 规范性附录) 引物和探针 引物、探针的名称和序列见表B,1 表B.1引物、探针的名称与序列 名称 序列 5'-TTGCTAGGCCGCAAGTAC3" M-qF MqR '-ACGCCGGACGACAAATGC-3" M-(探针 '-FAM-CTGGCCCCTGCCCACCAC-BHQ1-3" 5'-cAccGcGTAGAAcTGTGACAA-3 NsP2-qEF NSP2-qR 5'-TYATATTcCGTYTGTGAGGAC-3" NSP2-P(探针 5'-HEX-ACGCTGAcGCACCAGGATGAGcCTcT-BHQ1-3' ICF 5'-AAGTGCTcGGTGCCTTTAGTG3 1CR 5'-GTCCCATAGACTCACCCTGAAGT3 [C-P2探针) 5'-ROX-CCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGBHQ2-3 注:引物和探针可由生物公司合成,用TE溶液溶解并稀释至100molL储存浓度，-20C保存备用;根据需要配 制成10mol/L工作液，一20保存供检测使用
GB/35912一2018 录 附 C 规范性附录 荧光RI-CR反应体系 荧光RT-PCR反应体系见表C.1 表c.1荧光RI-CR反应体系 组分 1个检测反应的加人量 5×RT-PCRbuffer 10pl M-MLV反转录酶(200U/pAL) 0.3Al. TaDNA聚合脖(GUAL 1.74l 0.5 RNA酶抑制剂(40U/AL) A dNTPs(100mmol/L 0.4Al M-qF(104mol/L) l4L M-qR(10Mmol/L 1l M-P(10Hmol/I 0.6AL. NSP2-qF(104mol/L) 1Al NsP2 2-qR(10mol/L) 1Al NsP2-P(104mol/L) 0.6Al cC-F(107 0.5AL mol/L) ICR(104mol/L 0.5l ICP2(10Amol/1) 0.5AL DEPC水 25.2Al 合计 44.8Al

猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法GB/T35912-2018

猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）是一种严重危害猪工业的病原体，常导致生猪生长缓慢、死亡率增高等严重后果。因此，对PRRSV的敏感、准确检测显得尤为重要。

近年来，荧光RT-PCR技术在PRRSV的检测中得到广泛应用，其优点是灵敏度高、特异性强、快速、简便。GB/T35912-2018《猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法》是研究者们不断努力下的成果，为PRRSV的检测提供了标准方法。

具体方法如下：

1. 试剂和仪器

（1）RNA提取试剂盒

（2）反转录试剂盒

（3）SYBR Green I荧光定量PCR探针

（4）荧光定量PCR仪

2. 样品处理

（1）样品收集后冷冻保存（-80℃）。

（2）在操作前进行离心，去除样品中的杂质。

（3）将600μL RNA提取试剂加入200μL样品中，混合均匀后离心10min，取上清转移至另一无菌离心管中，加入适量乙醇沉淀。

（4）将离心管中的混合液倒入DNA酶切用离心管中，并按照反转录试剂盒说明书反转录。

3. 荧光RT-PCR检测

将反转录产物作为模板制备PCR混合液，添加SYBR Green I荧光探针，进行PCR扩增。最后通过荧光定量PCR仪分析检测结果。

总之，GB/T35912-2018标准的荧光RT-PCR技术能够快速、准确地检测猪繁殖与呼吸综合征病毒，为猪工业的发展提供了重要保障。

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