牛皮蝇蛆病诊断技术

牛皮蝇蛆病诊断技术

国家标准 GB/T22329一2008 牛皮蝇蛆病诊断技术 Diagnosticteehniquesforbovinehypodermosis 2008-08-22发布 2008-12-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22329一2008 牛皮蝇蛆病诊断技术 范围 本标准规定了牛皮蝇蛆病(bovinehypodermosis)诊断技术的要求,包括临床诊断,动物剖检和酶联 免疫吸附试验(ELISA). 本标准适用于牛皮蝇蛆病的诊断 临床诊断及剖检检查 2.1临床诊断 牛感染皮蝇后，一般不呈现明显的临床症状,但严重感染时,幼畜可表现出消瘦、生长缓慢、贫血,母 牛产乳量下降,役畜的使役能力降低等症状 当皮蝇幼虫钻人脑部时,可引起神经症状,如作后退运动、 突然倒地、麻痹或晕厥等,重者可造成死亡 此外,由于第三期幼虫在皮肤上形成穿孔,细菌感染而引起 化脓,形成痿管,常有脓液和浆液流出,痿管逐渐愈合,形成斑痕 但上述症状只能作为诊断的参考指 标,不能作为确诊的依据 只有当在牛的背部发现瘤肿状隆起和皮下蜂窝组织炎,且可挤出第三期幼虫 时,方能确诊 2.2剖检检查 当对疫区开展流行病学调查时,经常采用此方法 重点检查部位为食道黏膜、背部皮下瘤胃浆膜、 大网膜、食道浆膜等部位,如发现第一期、第二期或第三期任一阶段的幼虫,便可确诊 2.2.1第一期幼虫的形态 mm12mm,宽0.75mm2mm 呈乳白色长3.5 n,前端稍尖 2.2.2第二期幼虫的形态 mm一15mm,宽3mm一6mm 腹面微隆,背面平 外观口钩仅见两个黄褐创 呈浅黄白色,长11 的小圆点,散此分离 2.2.3第三期幼虫的形态 虫体长19mm一25mm,宽8mm一1mm,长宽比例(2.3一2.1):1,背面平,腹面隆起,侧面有拢 状突,色泽因成熟程度不同而异,由淡黄白至谈褐色、黄褐色以至黑色,体具11节(胸部3节、腹部 8节),伪头部具一对头感器,彼此分离 口钩退化为黑色圆点 酶联免疫吸附试验(enzyme-linkelimmunsorhentassay;EL.IsA) 3.1试验材料 3.1.1抗原 制备方法见附录A 3.1.2标准阳性血清 自牛皮蝇蛆病流行区颈静脉采集背部有瘤包牛的血液,分离血清,经国外商品化试剂盒检测为阳性 后,按3:1(3体积血清:1体积甘油)加人甘油,混匀,分装于1.5mL离心管,一20C保存备用 3. 1.3标准阴性血清 自无牛皮蝇蛆病流行的南方省份经颈静脉采集牛的血液,分离血清,经国外商品化试剂盒检测为阴 性后,按3:1(3体积血清:1体积甘油)加人甘油,混匀,分装于1.5mL离心管，一20C保存备用 3.1.4酶标记二抗 辣根过氧化物标记的兔抗牛IgG,自生化试剂公司购买
GB/T22329一2008 3.1.5血清样品的采集和处理 颈静脉采集动物血清,加叠氮化钠(0.01%)或硫柳汞(0.01%)进行防腐,4C冷藏保存 3.1.6溶液配制 自行配制,配置方法见附录B 3.2操作方法 3.2.1抗原包被 用抗原包被液将抗原按使用说明稀释至工作浓度;用加样器加工作浓度抗原至ELISA反应板各孔 内,每孔100ML,加盖后在37C温箱内孵育1h,然后置4C冰箱过夜;将包被液甩净,用洗涤液在洗板 机上按3×300AL程序,或用洗瓶重复洗涤5次 3.2.2封闭 每孔加人封闭液200Al,37C温箱内孵育30min,甩干,按3.2.1方法洗涤 3.2.3血清稀释 用血清稀释液将待检血清和标准血清作1:200稀释 3.2.4加样 按照附录C格式每孔加100L待检血清,试验要同时设空白对照,酶标记二抗对照、标淮阳性血 请对照和标准明性血清对照 空白对照孔(Al,.A2.,,B2)和酶标记二抗对照孔(cl.c2,Dl.,D2)各加 100L血清稀释液,加盖后37C温箱内孵育1h 用3.2.1方法进行洗涤 3.2.5加酶标记二抗 按说明书用洗涤液将酶标记二抗稀释至工作浓度,每孔加人100L,但空白对照孔只加相应稀释 液,加盖后于37C温箱内孵育1h 用3.2.1方法进行洗涤 3.2.6加底物 每孔加人现配制的底物溶液100L,加盖后于37C避光温箱内孵育40min 3.3判定 3.3.1酶联免疫检测仪测定 用空白对照调零,在405nm波长处,测定每孔的光吸收值(OD值),分别计算出每份被检样品孔、 标准阳性孔和标准阴性孔的平均OD值 在P/N值(P为标准阳性血清的平均OD值,N为标准阴性 血清的平均OD值)大于2时,测定结果方为有效 否则,应查明原因,重做 3.3.2结果判定 3.3.2.1当结果有效时,利用式(1)求出OD比值 待检血清样晶平均oD值二标准阴性血请平均OD值 OD比值一 ×100%(1 棕准丽程盖署平窍O崔一棕灌惺血蒂平奇D雀 oD比值小于或等于15%,判定为ELISA法阴性(一);OD比值在16%一20%,判定为 3.3.2.2 ELIsA法疑似(士)oD比值大于或等于21%,判定为ELIsA法用性 疑似者复检一次,仍为疑似者 判为阳性
GB/T22329一2008 附 录A 规范性附录 抗原的制备 A.1取100条新鲜采集或一20C保存的纹皮蝇二期幼虫,置于干净的50mL烧杯中,用剪刀剪碎 A.2加人100mlpH7.2的磷酸盐缓冲液(PBS),4C搅拌过夜 A.3第二天加人15.54g硫酸铵,！C轻摇30min A.410000r/min,4C离心20min,丢弃沉淀,收集上清液 A.5在上清液中加人15.54g硫酸铵,4C轻摇30min,10000r/min,4C离心20min,弃上清,收集 沉淀 A.6将沉淀重溶于20mLpH7.2磷酸盐缓冲液中,装人透析袋,于4C在清水中搅动透析1h,然后换 用pH7.2磷酸盐缓冲液,于4C透析过夜 A.7取出透析产物,l0000r/min,4C离心50min. A.8收集上清,用紫外分光光度计测定蛋白含量,计算出抗原浓度,分装于1.5ml离心管,一20C保 存备用
GB/T22329?2008 ? B 淶?? ? B.1??(pH19.6.0.05mo/L?λ?) 2.93g ?(NaHCO) ?(Na.CO 1.5g ?? 900ml 1mol/LpH?9.6,??1000ml4C汸á B.2??(0.01mol/L,pH7.4PST) B.2.1λ?(pH7.2 40 ?(NaCD g ?(KCD lg (KHPO 1g (NagHPO12HO) 17.9g ?? 4.9L 1mol/L1mol/?pH?7.2,и?5L B.2.2?? λ?(pH7.2) 999.5ml Tween-20 0.5mL B.3? 0.5g 100ml ?? ?0.5g,5mL??,?,??95ml??,? B.4??? 0.5g ?? 100mL ?0.5g,5ml??,?,??95ml??,?± B.5? B.5.1λ?(0.1mo/LpH4.0 10.5 g 3.25g ? 400ml 1mol/pH?4.0,?500mL,4C汸á
GB/T22329?2008 B.5.2?? ABTs 0lg 4.5ml ? ?-20C汸á B.5.3(H.o)??(? 30% 25Ml λ? 725L B.5.4﹤?(?) 15ml λ? (H,O)?? 60L ABTs? 75L
GB/T22329一2008 c 附 录 规范性附录 酶标板使用格式 10 11 12 稀释液 样品样晶样品样品样品样品样品样品样品样品 10 对照 酶标记 样品样品样品样品样品样品样品样品样品样品 二抗对照 1 12 13 14 15 16 17 18 19 20 F 标准阴性 样品 样品 样品样品 样品 样品样品样品样品样品 23 21 22 25 对照 21 24 26 28 29 30 标准阳性 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 样品 对照 31 32 33 34 34 36 37 38 39 40 H 图C.1