饲料中4种巴比妥类药物的测定

饲料中4种巴比妥类药物的测定

国家标准 GB/T23741一2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定 Determinationoffourkindsofbarbituratesinfeeds 2009-05-12发布 2009-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23741一2009 饲料中4种巴比妥类药物的测定 范围 本标准规定了饲料中巴比妥,苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的高效液相色谱测定方法和液相 色谱-串联质谱测定法 本标准适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中4种巴比妥类药物的测定 高效液相色 谱测定方法定量限为1mg/kg,液相色谱-串联质谱方法定量限为0.05mg/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,,IsO3696:1987,MOD GB/T14699.1饲料采样(GB/T14699.1一2005,ISO6497;2002,IDT) GB/T20195动物饲料试样的制备(GB/T20195一2006,ISO6498:1998,IDT 方法原理 试样中的4种巴比妥类药物用三氯甲婉提取,过滤,滤液吹干后溶解过固相萃取小柱净化洗脱液 蒸干后用甲醇水溶解,在高效液相色谱仪上分离、测定,或在高效液相色谱-串联质谱仪上测定,外标法 定量 试剂和材料 除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂,实验室用水符合GB/T6682一级水的规定 甲醇,色谱纯 4.2乙睛;色谱纯 三撒中 我三飘甲说 2%甲醇水溶液;取2mL甲醇与98mL水混合 4 5 甲醇水溶液;1十1 乙睛水溶液30十70 4.8磷酸盐缓冲液:c(NaHPO十NaH,PO2H.o)=0.lnmmol/L.pH=6.0 称取14.2g的无水 磷酸氢二钠(NaHPO),加水定容至1000mL,摇匀;另称取15.6g的磷酸二氢钠(NaH.PO. 2H.O),加水定容至1000mL,摇匀 取上述两种溶液按123877的比例混匀即可 4.9流动相甲醇十水=45十55 4.10巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品:纯度>99.0% 4.11标准贮备液;准确称取巴比妥,苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥标准品各25mg,分别用甲醉 4.1)溶解,定容至25ml,配成浓度为lmg/mL.的标准贮备液 2C8C冷藏保存,有效期三个月 4.12混合标准中间液;准确移取巴比妥,苯巴比妥,异戊巴比妥和司可巴比妥贮备液(4.1l1)各5mL 用甲醇(4.1)定容至50mL,该混合溶液中巴比妥、苯巴比妥、异戊巴比妥和司可巴比妥的浓度均为 1004g/ml 2C8C冷藏保存,有效期一个月
GB/T23741一2009 13固相萃取小柱:亲水亲脂平衡固相萃取柱,3mL(60 4 mg) 4.14滤膜:0.22m 4.15滤纸:快速,12.5 cm 仪器和设备 5.1高效液相色谱仪:配有紫外检测器或二极管阵列检测器 5.2液相色谱-串联质谱仪;配电喷雾离子源 5.3天平;感量为0.0o1g 5.4氮吹仪 5.5涡旋振荡器 固相萃取仪 5.6 试样制备 按GB/T14699.1采样 选取有代表性饲料样品至少500g,按GB/T20195规定，制备通过 045mm实验筛的试样 试样处理 提取 称取试料2g(精确至0.000因)于100ml离心管中准确加人25ml三氧甲烧(4.3).涡旋振荡 2min,过滤 准确移取滤液15mL于具塞试管中,40C氮吹至干,加人磷酸盐缓冲液(4.8)3mL,涡旋 溶解,备用 7.2净化 固相翠取小柱分别用5mL甲醉(A.1).5mL水、5ml磷酸盐缓冲液(4.8)活化 取上述提取液 (7.1)过柱，再分别用5mL磷酸盐缓冲液(4.8)、5mL甲醇水溶液(4.5)淋洗,空气抽干30min,用 10mL二氯甲烧(4.4)洗脱,收集洗脱液,40C氮吹至干,准确移取1ml 甲醇水溶液(4.6)溶解残渣， 过0.22Am滤膜后待测 液相色谱测定 8.1液相色谱条件 色谱柱:C柱长250mm,内径4.6mm,粒径5Am,或其他效果等同的C 柱 柱温:室温 进样量;20L 流动相甲醇十水=45十55 检测器;紫外检测器或二极管阵列检测器 检测波长:215n nm 流速:l.0mL/ min 8 标准曲线的绘制 /ml、 取混合标准中间液(4.12)适量逐步稀释,用甲醇(4.1)定容,配制成浓度分别为0.54g/ I.0pE/ml.5.0E/ml..10.0p8/ml..0.0国/'ml50.0E/mL的混合标准工作液,浓度由低到高进 样,根据峰面积和浓度计算回归方程 4种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱参见图A.1 定量测定 试料溶液(7.2)上机测定,用单点或多点校准法进行定量 多点校准法定量,根据峰面积的响应值 从标准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(ca);单点定量,根据样品峰面积的响应值与标准
GB/T23741一2009 溶液峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(ca) 8.4结果计算 试料中4种巴比妥类药物的含量Xa,以质量分数计,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(1)计算 -xYx" X= 又VXI000 式中: 试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度,单位为微克每毫升(4g/ml); 加人提取液的总体积,单位为毫升(mL); 氮吹至干后游解残渣用甲脖水溶液的体积,单位为毫升(ml)7 V 试料的质量,单位为克(e 71 V 移取滤液的体积,单位为毫升(mL) 计算结果保留三位有效数字 8.5重复性 在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果,相对偏差不大于10%,以两次平行测定 结果的算术平均值为测定结果 液相色谱-串联质谱法(仲裁法 9 液相色谱条件 色谱柱:C柱长100mm,内径2.lnmm,粒径1.7um,或其他效果等同的C柱; 柱温:40C 进样量sL; 流动相:乙睛十水,梯度洗脱,见表1 表1液相色谱-串联质谱流动相梯度洗脱表 时间/minm 水/% 乙/% 0.0 70 30 0.5 70 30 1.o 50 50 4.0 20 80 4.01 70 30 10.0 70 30 流速:0.4mL/min 质谱条件 离子源;电喷雾离子源; 扫描方式负离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM); 毛细管电压:4.0kV; 干燥气温度350C; 干燥气流速:l0I/min; 雾化气压力:0.24lMPa(35psi); 定性离子、定量离子及对应的保留时间、毛细管出口端电压和碰撞能量见表2
GB/T23741一2009 表24种巴比妥类药物的定性、定量离子对及碰撞能量 定性离子对 定量离子对 保留时间 毛细管出口端电压/ 碰撞能量 被测物名称 m/2) m/z》 min 183.2>84.9 20 80 巴比妥 183.2>140.1 0,933 183.2140.1 231.0>84.9 10 80 苯巴比妥 231.0>188.1 1,615 231.0>188.1 225.2>84.9 1o 异戊巴比妥 225.2182.2 3.179 80 1o 225.2>182.2 237.2>84.9 20 237.2>194.2 3.750 司可巴比妥 80 237.2>194.2 巴比妥类药物定性、定量离子对及碰撞能量 9 ！种巴比妥类药物定性、定量离子对及碰撞能量见表2 标准曲线的绘制 9 取混合标准中间液(4 12)适量逐步稀释，用乙睛水(4 7)稀释定容，配制成浓度分别为 4g/ml.0.00pg/ml.0.0754&/ml.0.1o4g/mL.0.20g/ml的混合标准工作 0.01ug/ml、0.025" 液,浓度由低到高进样,根据峰面积和浓度计算回归方程 4种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱条件 下标准样品图谱参见图A.2 9.5试液准备 取7.2项下的待测液,根据药物的浓度用乙嗔水溶液(4.7)适当稀释 定性测定 根据试样中各种化合物的保留时间和特征选择离子定性,试样中待测物质的保留时间与混合标准 品工作液中对应的保留时间偏差在士2.5%之内,且样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度 接近的标准品工作液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较,若相差不超过表3规定的范围,则可 判定为试样中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大相差 >5o >20~50 >10~2o <10 相对离子丰度 允许的最大相差 士15 士20 士25 士30 9 定量测定 以定量离子的色谱峰面积进行单点或多点校正定量 多点校准法定量,根据峰面积的响应值,从标 准曲线中得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(ca;单点定量,根据样品峰面积的响应值与标准溶液 峰面积的响应值比值与标准溶液浓度的乘积得到待测样中4种巴比妥类药物的浓度(ea) 9.8结果计算 试料中4种巴比妥类药物的含量Xa,以质量分数计,单位为毫克每千克(mg/kg),按式(2)计算 caXVxXX1ooo X = 2 m×V×V×1000 式中: 试料中某种巴比妥药物色谱峰面积对应的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); C2 加人提取液的总体积,单位为毫升(mL) 氮吹至干后溶解残渣用甲醉水溶液的体积,单位为毫升(mL). V，
GB/T23741一2009 -吸取7.2项下试液的体积,单位为毫升(mL); V 试料的质量,单位为克(g); V 移取滤液的体积,单位为毫升(mL); -吸取7.2项下试液定容的体积,单位为毫升(mL. 计算结果保留三位有效数字 重复性 在同一实验室、由同一操作人员完成的两个平行测定结果,相对偏差不大于20%,以两次平行测定 结果的算术平均值为测定结果
GB/T23741一2009 附 录A 资料性附录 4种巴比妥类药物标准样品谱图 A.1图A.1给出了4种巴比妥类药物液相色谱图谱 mAg Y60 -5.305 i4 -8.819 -23.259 30.616 5 mn 10 30 图A.14种巴比妥类药物液相色谱条件下标准样品图谱 A.2图A.2给出了4种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱图 xI0'CMRM IRM8.20839 xI0 MRM22000011塑2 XI0 10MRM231.00000>84.90039 xI0MRM(23.00000>188.09961 MRM(225.20000>84.90039) Vo3 x10MRM(225.20000>182.19922) MRM183.20000>84.90039 10 MRM(183.20000>140.09961 ×10 0.51I.522.533.544.555.566.577.588.599.5Io /min 总离子流色谱图 -司可巴比妥定性离子; 司可巴比妥定量离子; 苯巴比妥定性离子 苯巴比妥定量离子 异戊巴比妥定性离子 异戊巴比妥定量离子 巴比妥定性离子; 巴比妥定量离子 图A.24种巴比妥类药物液相色谱-串联质谱图(MRM色谱图)(200ng/mL