国家标准 GB/T27527一2011 禽脑脊髓炎诊断技术 Diagnostietechniquesforavianencephalomyelitis 2011-11-21发布 2012-03-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27527一2011 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由农业部提出本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/TC181)归口本标准起草单位:内蒙古农业大学、内蒙古动物疫病预防控制中心,动物疫病预防控制中心、北京世纪元享动物防疫技术有限公司扬州大学,青岛易邦生物工程有限公司本标准主要起草人:赵振华,赵心力、陈西钊、孙明、王金玲,秦爱建、范根成、李瑞刚、乌日罕
GB/T27527一2011 禽脑脊髓炎诊断技术范围本标准规定了禽脑脊随炎诊断技术包括流行病学,临床症状,组织病理学变化,病毒分离,琼脂免疫扩散试验、中和试验和间接免疫荧光试验本标准适用于禽脑脊髓炎的诊断、检疫和流行病学调查缩略语下列缩略语适用于本文件 AE(V):;禽脑脊髓炎(病毒[avianencephalomyelitis(virus)] uVn AEV-VR;禽脑脊髓炎病毒VanRoekel株AEV标准株)avianencephalomyelitisvirus Roekel EIDa;鸡胚半数感染量(egginfectiousdose sceinisothiocyanate) FITC;异硫氢酸荧光素luores H.E.染色;苏木素-伊红染色(hematoxylin -eosinstaining PBS:磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline 流行病学除鸡易感AEV外,雉鸡、鹌鹑、火鸡和山鸡也可自然感染无本病史和未经免疫的鸡群一旦感染，雏鸡发病率通常为40%~60%、死亡率为10%一80%或更高不同日龄的鸡一年四季均可感染随日龄的增长,鸡对AEV的抵抗力不断增强感染鸡的种蛋可以引起后代鸡胚和雏鸡发病(垂直传播);同时,病鸡的分泌物和排泄物可污染环境、饲料和饮水,引起与其接触的易感鸡发病(水平传播) 自然情况下4周龄以内的雏鸡(幼禽)对AEV最易感;实验室情况下,l日龄雏鸡脑内接种AEV强毒5d7d 后可发病;经胚胎感染的雏鸡出壳后潜伏期1d~7d,口服感染或自然接触一般9d11d后发病临床症状自然感染和人工感染雏鸡的临床症状基本一致,初期精神沉郁,嗜睡,易惊,斜视,呈半蹲姿势,头颈偏向一侧、饮水困难,双腿紧缩、叉开或爪蜷缩,以后可出现站立不稳、进行性运动失调,头颈快速震颤等症状,甚者常因瘫痪,衰竭而死亡成年鸡感染后一般不出现明显症状,有时仅见轻微腹泻,产蛋率下降 10%40%和种蛋孵化率降低 5 组织病理学变化材料准备 5.1.1器材石蜡切片机、染色缸,载玻片,盖玻片,水浴锅,温箱、显微镜等
GB/27527一2011 5.1.2试剂 10%中性福尔马林溶液、酒精、二甲苯,切片石蜡、H.E.染色液、中性树胶等 5.1.3样品临床可疑AE病例的大脑、中脑、小脑,延脑和腰荐部脊髓样品 5.2操作方法分别切取小块(0.5cm'1 cm')大脑、中脑、小脑,延脑和腰荐部脊髓样品置10%中性福尔马林溶液中固定24h一48h 常规制片,H.E.染色、中性树胶封片、,光镜观察病理变化中枢神经系统典型的组织病理学变化为非化脓性脑脊髓炎,主要包括大脑、中脑、小脑、延脑和脊随的变质性变化、血管反应和胶质细胞增生 5.3.2变质性变化表现为神经细胞变性和神经组织出现小软化灶变性的神经细胞肿大、淡染或浓缩,有的呈现中央染色质溶解现象变性严重的神经细胞和局部神经组织可发生坏死、液化,形成小软化灶 5.3.3血管反应表现为血管出现以淋巴细胞为主的围管性细胞浸润,浸润的细胞在血管周围散在或呈多层围绕,形成管套胶质细胞增生表现为增生的胶质细胞可出现在变性神经细胞周围形成卫星现象,或进人坏死的神经细胞中吞噬坏死物形成噬神经原现象在软化灶处有数量不等的胶质细胞增生和聚集形成胶质小结结果判定 5. 4 若5.3.25.3.！同时出现时则为非化脓性脑脊髓炎的典型病变,若主要出现5.3.3,而5.3.2不明显时,可能与免疫反应有关,常见于免疫鸡群通过流行病学、临床症状和组织病理学变化可对AE做出初步诊断,在初步诊断的基础上,进行病毒分离(见第6章) 病毒分离 6.1材料准备 6.1.1器材无菌剪刀、子,平皿、烧杯,玻璃瓶、组织研磨器、注射器,孵化器、离心机、高压灭菌器、冰柜、生物安全柜等 6.1.2试剂生理盐水,青霉索素、链霉素 6.1.3材料 SPF种蛋、SPF雏鸡
GB/T27527一2011 6.1.4病料可疑)AE病雏脑组织(以发病早期为好). 6.2操作方法 6.2.1病料的采集与保存无菌取病雏鸡脑组织后应立即处理(见反.2.2),若暂时不能处理,可于一0C冰柜中保存 6.2.2病料处理将病料无菌称量,研磨,反复冻融3次,用无菌生理盐水溶液作1;5稀释制成悬液,并加双抗(双抗终浓度为1000IU/ml青霉素,1004g/ml链霉素) 样品经4000r/min离心10min,取上清液即为自然病雏脑组织病毒液,冻存、备用雏鸡接种 6.2.3 取6.2.2处理好的病毒液,以0.05mL/羽脑内接种1日龄sPF雏鸡,待出现AE症状后采血致死同上述方法取脑研磨,制备,获得接种病雏脑组织病毒液,冻存、备用 6.2.4鸡胚接种取6.2.3病毒样本,以0.2nmL/胚,经卵黄囊无菌接种6日龄SPF鸡胚,每份样本至少接种5枚胚,于37C孵化箱内孵育至16日龄收毒、观察鸡胚病变(同时设未接种病料的健康对照组) 收毒时首先无菌吸取胚液(尿囊液和羊水),然后观察胚体发育情况;检查胚体、胚脑病变;取胚脑、胃、肠、胰腺称量,研磨,以胚液作1:5稀释,同6.2." 2加人双抗,离心,制成鸡胚组织病毒液,即为AE自然发病雏鸡第1代胚病毒液(AEV E 取AEVE 拨照本条上述方法再接种G日龄sPF鸡胚卵黄囊孵化.收毒,检查鸡胚病变,制备第2代胚病毒液(AEVE) 这样连续传代直至传代鸡胚出现病变时,该代鸡病毒液即可作为病毒鉴定用的AE分离毒病毒液同时可进行病毒某些特性的检测与健康对照组鸡胚相比,发病鸡胚病变为胚体活力减弱、发育不良和肌肉萎缩(胚体重减轻)、腿细爪曲或强直,脑萎缩,皮下,脑、胃肠水肿,出血等病毒分离后,可通过琼脂免疫扩散试验,中和试验和间接免疫荧光试验中的任一种方法进行病毒鉴定见第7章) AE的确诊和病毒鉴定琼脂免疫扩散试验 7.1.1 器材准备 7.1.1.1器材冰箱、天平、90mm直径的平皿、微量加样器、塑料吸头和打孔器(内径4.0nmm、孔间距3.0tmm的 7孔梅花样金属打孔器) 7.1.1.2试剂禽脑脊髓炎琼脂免疫扩散试验冻干抗原(1mL/安瓶)、标准阳性血清和阴性血清、氯化钠、优质琼脂粉,pH7.20.01mol/几LPBs(或生理盐水)、蒸僧水和1%硫柳汞溶液(见附录A》. 7.1.1.3待检血清无菌翅下静脉采血1mL左右,分离血清，-20C冰箱保存备用
GB/27527一2011 7.1.1.4待检抗原 6.2.4AE分离毒抗原和其他待检抗原 7.1.2操作步骤 7.1.2.1琼脂板制备琼脂板的制备按如下步骤进行: 琼脂液配制称取优质琼脂粉1.0g,加燕僧水至100mL 加热溶化后,加人氧化钠18g,充分 a 溶解后,加人1%硫柳汞溶液(终浓度为0.01%),摇匀制板;将琼脂液冷却至47C~70,取洁净、干燥,直径为90mm的灭菌平皿,放置于无菌工 b 作台内,每个平皿加琼脂液18mL,厚度约为3.0 凝固后盖严,把平皿倒置放人4C冰 mm 箱中保存备用(保存期2周. 7.1.2.2打孔从冰箱内取出琼脂板,用7孔一组的梅花形打孔器打孔(中间1孔,外周6孔，见图1),孔径 4.0mm. n,孔距3.0mm 将孔中的琼脂轻轻挑出或吸出,勿伤及孔边缘或使琼脂层脱离平皿底图1平皿中梅花形7孔一组排列示意图 7.1.2.3封底在酒精灯火焰上通过4次6次加热平皿底面,使底部琼脂稍微融化即可 7.1.2.4抗原稀释向1安瓶抗原内加人Ps(或生理盐水)1ml.待溶解呈均匀混悬液时即为可使用的AE琼扩抗原液 7.1.2.5加样根据需要和具体条件,可分别应用血清样品或抗原样品按以下处理方式进行加样检验血清加样结合图2,用微量加样器吸取抗原液加人中央孔,标“”的三孔加标准阳性血 a 清,1,23孔加被检血清,每孔均应加满,但不能溢出每加一个被检样品应换一个吸头图2加样示意图
GB/T27527一2011 b 检验抗原加样:结合图2,用微量加样器吸取标准抗体溶液(AE标准阳性血清)加人中央孔,标 “+”的三孔加标准抗原液,1,2,3孔加待检抗原液,每孔均应加满,但不能溢出每加一个被检样品应换一个吸头 7.1.2.6反应加样完毕,室温静置10min,放人22C26C保湿盒内反应,分别在24h,48h和72h观察并记录结果 7.1.3结果判定 7.1.3.1检验血清结果判定 7.1.3.1.1判定前提将琼脂板置日光灯或侧强光下观察,在抗原与标准阳性血清孔之间出现-一条清晰、致密的沉淀线，抗原与阴性血清孔之间不出现沉淀线,说明对照成立,可进行结果判定 7.1.3.1.2阳性标准抗原孔与被检血清孔之间形成的沉淀线与阳性对照血清形成的沉淀线弯曲环联,判为阳性(见图3). 注标“十”孔为标准阳性血清,12、3孔被检血清呈阳性图3被检血清呈阳性示意图 7.1.3.1.3可疑若标淮抗原与被检血清孔间不出现沉淀线,而抗原与标准阳性血清孔间的沉淀线在被检血清孔位置微向内侧弯曲者(见图4中的1号孔),则被检血清判为可疑反应对该份血清复检,仍为可疑则判为阳性反应注:标“”孔为标准阳性血清,1孔被检血清可疑,2、3孔被检血清阴性图4被检血清呈可疑示意图
GB/27527一2011 7.1.3.1.4非特异性反应若标准抗原孔和被检血清孔间的沉淀线粗且浑浊或与抗原孔和标准阳性血清孔之间的沉淀线交叉并直伸待检血清边缘者,则判为非特异性反应,应重做若仍出现非特异性反应则判为阴性(如图5所示第3孔. 注:标“十"孔为标准阳性血清,1,2、3孔被检血清分别为阳性、阴性和非特异性反应图5被检血清呈非特异性反应示意图 7.1.3.1.5阴性标准抗原孔与被检血清孔之间无沉淀线,抗原孔与标准阳性血清孔间沉淀线直伸延到被检血清孔边缘无弯曲者,则判为阴性(见图6). 注:标“+”孔为标准阳性血清,l、2、3孔被检血清为阴性血清图6被检血清呈阴性示意图 7.1.3.2检验抗原结果判定 7.1.3.2.1判定前提将琼脂板置日光灯或侧强光下观察,在标准抗原与标准阳性血清孔之间出现一条清晰、致密的沉淀线,标准阳性血清孔与阴性抗原孔之间不出现沉淀线,说明对照成立,可进行结果判定 7.1.3.2.2阳性可疑、非特异性反应和阴性结果的判定原理和方法同7.1.3.1 7.2中和试验 7.2.1材料准备 7.2.1.1仪器孵化器等
GB/T27527一2011 7.2.1.2材料 sPF鸡胚、AE标准阳性血清、AE阴性血清、PBs(见附录A. 7.2.1.3病毒样品 6.2.4收获的待检AE分离毒病毒液 7.2.2操作方法 7.2.2.1病毒滴度(EID)测定将待检病毒液作10倍系列稀释至10-110-,分装到两列无菌试管中,第一列8管各加人等量 AE阴性血清对照组),第二列8管各加人等量AE标准阳性血清(试验组),混匀后置371h,然后每管分别卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚各5枚(0.2mL/胚),继续孵化至16日龄,剖检、记录各组病变鸡胚数(感染发稍胚稍变判定标准见6.2.).分别计算两组的EID. 7.2.2.2中和指数计算待检病毒液的中和指数按式(1)计算 X=W/Y 式中中和指数; X 试验组EIDm W 对照组ED y 7.2.3结果判定中和指数小于10判为阴性,10~50为可疑,大于50判为阳性 7.3间接免疫荧光试验 7.3.1材料准备 7.3.1.1器材荧光显微镜和冰冻切片机 7.3.1.2试剂 FITC标记兔抗鸡lgG抗体、标准阳性血清阴性血清(SPF鸡血清、无水乙醇和丙酮 7.3.1.3组织样品 AE雏鸡脑组织样品、健康对照雏鸡(阴性)脑组织样品和待检脑组织样品 7.3.2操作方法 7.3.2.1冰冻组织切片制备取AE脑组织样品,阴性脑组织样品和待检禽脑组织样品或十二指肠样品,分别覆以冷冻固定剂，一70C固定过夜次日,取出,经冰冻切片机切片,将组织切片置载玻片上,用一20C预冷的丙酮乙醉 110min 3;2)固定液室温固定5min"
GB/27527一2011 7.3.2.2间接免疫荧光检测将固定好的组织切片,PBS洗3次,加上标准阳性血清,SPF鸡血清各100L/块组织,于37温育30min后用PBS洗涤3次,加人FITc标记兔抗鸡lgG抗体,置37C温育30min,经PBS洗涤3次后在荧光显微镜下观察 7.3.3结果判定 7.3.3.1判定前提 AE脑组织切片与阳性血清作用,出现明亮绿色荧光,而AE脑组织切片与阴性血清作用以及阴性脑组织切片与阳性血清作用均无亮绿色荧光,则对照成立,结果可以判定 7.3.3.2判定标准被检组织的细胞浆中出现亮绿色荧光者,判为阳性,否则判为阴性
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禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011

一、什么是禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011？

禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011是指按照国家标准GB/T27527-2011《禽脑脊髓炎诊断技术》进行禽脑脊髓炎诊断的方法，该标准包括了病原学检测、临床诊断和免疫学诊断等多个方面。

二、禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011的优势

相比传统的禽脑脊髓炎诊断方法，禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011具有以下几个优势：

综合评估：该技术能够综合考虑多种诊断手段的结果，对病情进行全面评估。
准确性高：该技术采用了多种检测手段，能够提高诊断结果的准确性。
操作简便：该技术的操作流程简单易懂，不需要特殊的仪器和设备。

三、禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011的应用

禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011广泛应用于禽类疫情的监测和控制中，尤其是在禽类养殖业上，可以帮助相关单位及时掌握疫情动态，采取有效的防控措施。此外，该技术还可以用于病原学研究、药物筛选等领域。

四、总结

禽脑脊髓炎诊断技术GB/T27527-2011是一种可靠、快速的疾病诊断技术，具有准确性高、综合评估能力强等优势，在禽类养殖业和疾控实践中得到广泛应用和推广。