GB/T36390-2018
工具酶溶菌酶
Reagentenzyme—Lysozyme
- 中国标准分类号（CCS）C27
- 国际标准分类号（ICS）07.080
- 实施日期2019-01-01
- 文件格式PDF
- 文本页数8页
- 文件大小518.02KB
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工具酶溶菌酶
国家标准 GB/T36390一2018 工具酶溶菌酶 Reagentenzyme一LyS0zyme 2018-06-07发布 2019-01-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36390一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口
本标准起草单位;福建华灿制药有限公司、,福建南生科技有限公司、北京化工大学、山东大学、安琪 酵母股份有限公司、苏州海狸生物医学工程有限公司、计量科学研究院计量与分析科学研究所
本标准主要起草人;詹学雄、赵晶、郑登忠,黄发灿,章丽丽、陈劲春、陈秀兰、姚鹃、任辉、全灿
GB/T36390一2018 引 言 溶菌酶又称细胞壁溶解酶,是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,能够水解N-乙酰胞壁酸和 N-乙酰氨基葡糖之间的31,4糖苷键
制定溶菌酶国家标准,对于推动该类工具酶的产业化具有重要 意义
GB/36390一2018 工具酶溶菌酶 范围 本标准规定了溶菌酶的技术要求、检验方法,包装,运输、贮存和保质期
本标准适用于从生物材料中提取的溶菌酶
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T191包装储运图示标志 GB/T30990溶菌酶活性检测方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 溶菌酶lysozyme 细胞壁溶解 -种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,能够水解N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的-1,4 糖苷键
3.2 溶菌酶活性单位activityumitoflys0zyme 以溶壁微球菌为底物,0.1nmol/L磷酸盐缓冲液(pH6.2)为缓冲体系,在25C,2.5mL
菌悬液和 0.5ml酶反应,于450nm波长处测量吸光度,每分钟使吸光度值下降0.001时所需的酶量,为1个活 性单位(U)
技术要求 4.1产品外观 白色或类白色的冻干块状物或粉末
4.2溶菌酶活力 >2000U/mg
4.3杂质 不应含核酸外切酶和核酸内切酶
GB/T36390一2018 5 检验方法 5.1外观 直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察
5.2溶菌酶活力 依据GB/T30990的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1核酸外切酶 依据附录A的方法进行检测
5.3.2核酸内切酶 依据附录B的方法进行检测
o 包装、运输及贮存 6.1包装 内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏
外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定
6.2运输 产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨、防晒设施,运输过程中应做好防 护措施避免倒置及破损
不宜与有毒、有害、有异味物品混运
6.3贮存 包装后的产品应在一20C的条件下储存
保质期 在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为3年;超过保质期,使用前应检测 酶活
GB/36390一2018 附 录 A 规范性附录) 核酸外切酶检测 A.1原理 由于BamHI切开DNA双链产生一对黏性末端,其各有五个碱基失去互补碱基形成突出单链,它 易受核酸外切酶作用丢失若干个碱基乃至形成平末端;如果将此DNA连接后再用BamHI酶切,结果 是无法切开
如果该位点是在外显子区或编码区,即意味其对应的氨基酸序列发生变化,乃至某些生物 性状发生改变
例如质粒pBR322所含BamH1识别位点是在其抗四环素基因上,如果使用被核酸外 切酶污染的样品BamHI过量长时程酶切割pBR322.然后再连接闭环后重新转化受体菌,该菌在含四 环素培养基上无法生长,而没有这样酶切的pBR322转化菌能够生长
又如质粒pUc19所含BamH1 位点居于编码L.ac乙的a互补肽上,若发生前述状况,就会导致该肽链的氨基酸序列变化,最终在含 PTG和X-al的LB培养基上由原本是蓝斑变成白斑
如果白斑数目占到总菌斑数的10%以上,就判 定该样品已有核酸外切酶污染 A.2仪器和设备 A.2.1恒温水浴槽
A.2.2台式离心机
A.2.3超净工作台
A.2.4恒温培养箱
A.3材料 A.3.1高纯cCCpUC19DNA
A.3.2T4DNNA连接酶
A.3.310×T4DNA连接酶缓冲液:500mmol/LTris-HCl缓冲液(pH7.8),100nmmol/IMg 10nmmol/1ATP,100mmol/IDTT
A.3.4LB培养液
A.3.5氧仿-异戊醇(24+1)
A.3.6大肠杆菌DH.《感受态》. LB平板(含Xgal,IPTG,氨节青霉素》. A.3.7 A.4实验步骤 A.4.1长时程过量酶切 取10g高纯ccCpUC19DNA置于一只微量离心管,加人20AL10×BamH1缓冲液和150L 水,充分混匀后平均分成A和B两管;A管加人5ALBamHI(50U~100U)和5AL水,达总体积 100AL;B管加人5AlL
BamHI(50U~100U)和5AL溶菌酶(1g/"L)
混匀后置于37C水浴槽，
GB/T36390一2018 1h后各取出40L,其中20L(标记Al号和B1号)待电泳检测,另20L(标记A2号和B2号)待连 接及蓝白斑计数;所剩60L继续酶切达10以上,又将它们各均分为3管,分别标记A3,IB3,A4,B4、 A5,B5号
A.4.2电泳 A.4.2.1取出A1,B1、A3,B3号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测
A.4.2.21.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当嗅酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取出凝 胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照
A.4.3连接 A.4.3.1回收DNA 取出A2.B2,A4,B4、A5.B5号管,各加人20L氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真 空干燥样品 A.4.3.2连接反应 向经A.士.3.1处理的A2.,B2.A,BH4.A5,B5号管,各加人2L10×T！DNA连接酶缓冲液,2u T4DNA连接酶,加人水达总体积20L,混匀后置于15C水浴槽8h
A.4.3.3转化与铺板 向经A.4.3.2处理的A2,B2,A4、,B4、A5,B5号管,各加人感受态菌液,轻混,置于4C冰浴 A.4.3.3.1 槽0.5h以上
A4.3.3.2将经A4.3.3.1处理的A2.2.A4,.BH,A,5号管,移到42C水浴中热击2min,取出再置 于4C冰浴槽0.5h以上
A.4.3.3.3向经A.4.3.3.2处理的A2、B2、A4、,BH4、A5、5号管,各加人1mLLB培养液,轻混,置于 37C水浴槽1h
A.4.3.3.4将18块固态LB板,分别标上A2,B2,A4、,B4、A5,5号,每号均有3块板;在超净工作台铺 板,每板加人相应编号的经A.4.3.3.3处理的A2、B2、A4、B4、A5、B5号管菌液200L;待板上菌液不会 流动时,翻转平板,置于37C恒温培养箱8h以上
A.4.3.3.5计算每块板蓝白斑数量,再算出每号管对应的每个处理的蓝白斑总数及百分比
A.5结果判定 在电泳板上,A1,B1,A3,B3号的谱带没有明显差异;说明长时程过量酶处理对DNA没有造成额 外的切割
B2、B4、B5号和A2、A4、A5号的白斑总数与其蓝斑总数相比
若比值小于1/9,则判定样品不含 核酸外切酶;若比值大于或等于1/9,则判定样品含有核酸外切酶
GB/36390一2018 附录 B 规范性附录 核酸内切酶检测 B.1原理 pUC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致
B.2仪器 B.2.1电泳仪,备电泳槽
B.2.2分析天平(万分之 B.2.3紫外透光分析仪
B.3实验步骤 B.3.1 pUc19质粒反应 B.3.1.1在测试管里先后加人4AL.pUC19质粒DNA(14g/L),14AL.水、2AlL酶,振荡器混匀,水浴 1h B.3.1.2 在对照管里先后加人4AL.pUC19质粒DNA(14g/wL)、16ML纯化水,振荡器混匀,水浴 h B.3.2电泳 1%~1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/em10V/cm， ,当澳酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照
B,4结果判定 在电泳板上,肉眼观察
若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含有内切酶;若不一致,则 判定样品中含有内切酶
工具酶溶菌酶GB/T36390-2018的应用和发展趋势
工具酶是一类广泛应用于分子生物学领域的酶类，在DNA或RNA分子的操作中起到极为重要的作用。其中，溶菌酶是一种被广泛使用的工具酶之一，主要作用是在细胞壁中水解肽聚糖骨架，从而实现对细菌的破壁。
工具酶溶菌酶GB/T36390-2018的制定背景
随着工具酶应用领域的不断扩大，对其质量和规范性的要求越来越高。GB/T36390-2018是在此背景下制定的技术规范，旨在提高实验结果的可靠性和准确性。
GB/T36390-2018的主要内容
GB/T36390-2018主要包括以下内容：
- 溶菌酶的分类与命名
- 溶菌酶的物理化学性质
- 溶菌酶的分离纯化和检测方法
- 溶菌酶的应用及其影响因素
工具酶溶菌酶的主要应用
工具酶溶菌酶在细胞壁破碎、基因克隆、蛋白表达等方面扮演着重要的角色。其中，细胞壁破碎是溶菌酶最为常见和广泛的应用之一。
在基因克隆中，溶菌酶可以作为破菌壁剂，帮助DNA从细菌中提取出来。在蛋白表达领域，溶菌酶则可以作为裂解剂，将表达的蛋白快速高效地纯化出来。
工具酶溶菌酶的发展趋势
随着生物技术的不断发展，工具酶溶菌酶的应用也在不断拓展和深化。目前，一些新型的溶菌酶已经被研发出来，并被广泛应用于生物医药等领域。
未来，工具酶溶菌酶的发展趋势将会更加多样化和个性化。同时，在质量优化和标准化方面，GB/T36390-2018将继续发挥重要作用，推动工具酶溶菌酶行业的良性发展。
结语
工具酶溶菌酶GB/T36390-2018的规范化标准对于提高实验结果的可靠性和准确性具有重要意义。在实际操作中，我们需要严格按照标准操作，以保证实验结果的有效性和可靠性。未来，随着工具酶溶菌酶技术的不断提高和发展，相信它将会在更广泛的领域发挥出更重要的作用。
