牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法

牛肌肉、肝、肾中的α-群勃龙、β-群勃龙残留量的测定液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20760一2006 牛肌肉、肝、肾中的c-群勃龙、卜-群勃龙残 留量的测定液相色谱-紫外检测法和 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationofc-trenboloe，卜-trenbolone residuesinbowinemuscle，liverandkidney LC-UVmethodandLC-MS-MISmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20760一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、河北出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳、郭春海、王风池、艾连峰 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20760一2006 牛肌肉、肝、肾中的w-群勃龙、卜-群勃龙残留量的测定 液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛肌肉肝、肾中a-群勃龙、8群勃龙残留量的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联 质谱测定方法 本标准适用于牛肌肉肝、肾中a-群勃龙、}群勃龙残留量的测定 本标准的方法检出限:a-群勃龙、}群勃龙的液相色谱-紫外检测法和液相色谱-串联质谱法的检出 限均为24g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2一2004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682-1992,neqISo3696;1987)y 原理 试样在pH=5.0条件下加酶水解,用乙酸乙酯提取群勃龙残留,经凝胶色谱净化仪(GrPC)和硅胶 柱净化,用配有紫外检测器的液相色谱仪或用液相色谱-串联质谐测定,外标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇:色谱纯 4.2乙酸;色谱纯 4.3乙睛:色谱纯 4.4乙酸乙酯 4.5环己炕 4.6丙酮 4.7正已婉 4.8日-葡萄糖昔酸酶和芳基硫酸酯(仔glu" ucuronidaseandarylsulfatase):100000unit/mL 4.9乙酸乙酯十环己婉50+50. 4.10丙酮+正己烧:l0十90. 丙酮正己婉:30十70. 4.12乙酸钠缓冲液:0.02mol/L,pH=5.0 称取无水乙酸钠0.82g溶于500ml.水中,用乙酸调节 pH=5.0.
GB/T20760一2006 4.13a-群勃龙、-群勃龙标准物质:纯度>98% 4.14标准储备溶液;分别精确称取a-群勃龙、群勃龙标准物质(4.13)各0.0100g,用乙睛(4.3)溶 解并定容至100mL.配制成1004(/ml的标准储备溶液 此溶液一18C冷冻保存,可使用六个月 4.15混合标准工作溶液;取标准储备溶液(4.14)各5ml至50ml容量瓶中,用乙腊定容至刻度,配 制成混合标准工作溶液,浓度为104g/mL,此溶液一18C冷冻保存,可使用三个月 4.16硅胶固相萃取柱;500mg,3ml;使用前用5ml丙酮十正己烧(4.10)预处理,保持柱体湿润 4.170,45amm滤膜 仪器和设备 5.1液相色谱仪配有紫外检测器 5.2液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(EsD) 5.3凝胶色谱仪 5.4均质器 .5旋转蒸发仪 5.6 旋涡混合器 5.7离心机最大转速5000r/min 5.8氮气浓缩仪 5.9恒温水浴摇床 试样的制备与保存 6.1试样的制备 牛肌肉,、肝、肾组织用组织捣碎机绞碎,分出0.5kg作为试样备用 6.2试样保存 制备好的试样置于一18C冰柜中避光保存 测定步骤 混合基质标准校准溶液的制备 试样的称取 称取5个阴性样品,每个样晶为5g(精确到0.01g),置于50mL具塞离心管中,再分别加人不同 量混合标准工作溶液(4.15),使各被测组分的浓度均为2.5ng/ml.Sng/ml..0ng/'ml..50ng/ml. 00ng/m 7.1.2提取 向上述盛有5个阴性样品的50mL具塞离心管中,加人5nml乙酸钠缓冲液(4.12)和20L卜葡 萄糖苷酸酶和芳基硫酸酯(4.8),摇匀后盖好塞子置于恒温水浴摇床(5.9)上,37C振荡水解过夜 >5h) 待水解液冷却至室温后,加人20ml乙酸乙酯,在均质器(5.4)上以10000r/min的速度均质 提取1min后,3000r/min离心(5.7)10min,将上清液过滤至鸡心瓶中 再用20ml乙酸乙酯重复提 取一次,合并上清液于同一鸡心瓶中 7.1.3净化 7.1.3.1凝胶色谱仪(GC)条件 净化柱;22gsX3io-Beads填料,200目一400目,200mm×25mmm(内径)或相当者 a e b)流动相:乙酸乙醋十环己烧(50十50),流速5.0mL/min
GB/T20760一2006 定量环:5mL; ce d)净化程序;0min10.5min弃去洗脱液,10.5min~15.5min收集洗脱液,15.5min~18nmin 弃去洗脱液 7.1.3.2GPC及硅胶固相萃取净化 将提取液在45C下蒸至近干,用乙酸乙酯十环已烧(4.9)定容至10mL的玻璃试管中,按7.1.3.1 中GPC条件净化 净化后将收集的洗脱液蒸干,用3mL丙酮十正已婉(4.10)旋涡振荡(5.6)溶解残 渣,将溶液转移到预洗过的硅胶固相萃取柱(4.16)上的贮液器中,然后再用3mL丙酮十正己婉 10十90)溶解一次,将合并的溶解液过硅胶固相萃取柱,接着用3mL丙酮十正已烧(10十90)淋洗硅胶 柱,最后用5mL丙酮十正已炕(4.11)洗脱分析物并收集 洗脱液用氮气浓缩仪(5.8)在60C水浴中吹 干,用1mL流动相旋涡振荡溶解,过0.45m滤膜(4.17)供液相色谐-紫外检测和液相色谱-串联质谱 测定 试样溶液的制备 称取待测样品5g(精确到0.01g)于50mL带塞离心管中,按7.1.2和7.1.3操作 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确到0.01g)于50m带塞离心管中,按7.1.2和7.1.3操作 液相色谱法测定 液相色谱条件 色谱柱;DiamonslCa.5Am,.l50mmX4.6mm(内径)或相当者 a b)流动相;0.1%乙酸水溶液-乙腊-甲醉(50十20十30); 流速:1.0mL/min; c 检测波长;345 d nm; 柱温:40C; e fD 进样量:50L 7.4.2色谱测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准校准溶液进样,以峰面积为纵坐标,基质混合校准溶液浓 度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪 器测定的线性范围内 在上述色谱条件下,仔群勃龙、Q-群勃龙的保留时间分别约为11.2min和 3.4min，标准物质的液相色谱图参见图A.1 本方法的添加回收率数据参见表B,1 7.5液相色谱-串联质谱法测定 7.5.1液相色谱条件 色谱柱:InertsilC，5am,150mm×2.lmm内径)或相当者; a b)流动相:0.1%乙酸水溶液十乙晴(62十38); 流速;0.3mL./min3 C 色谱柱温度35C d 进样量;20 e Al6 质谱条件 离子源Es1,正模式 a b)雾化喷嘴压力:0.24MPa; 干燥气流量.9.0L" min d 干燥气温度;350Cn 毛细管电压、去集簇电压、碰撞电压等电压值应优化至最优灵敏度 检测离子对见表1
GB/T20760一2006 表1被测物的保留时间母离子和子离子 被测物名称 保留时间/min 母离子(m/: 子离子(m/: 群勃龙 6.5 271 253" 199 在群勃龙 199 7.2 271 253" 定量离子 7.5.3定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质的保留时间， 与基质混合标准校准溶液中对应的保留时间偏差在土2.5%之内;且样品谱图中各组分定性离子的相对 丰度与浓度接近的基质混合标准校准溶液谱图中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超过 表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许误差 相对离子丰度 -50 >2050 >10~20 <1o 允许的相对误差 士20 士25 士30 士50 7.5.4定量测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准校准溶液进样,以峰面积为纵坐标,基质混合校准溶液浓 度为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应在仪 器测定的线性范围内 上述色谱和质谱条件下,标准选择离子流图参见图A.2 本方法的添加回收率数据参见表B.1 7.6平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 回收率试验 吸取适量混合标准工作溶液,得到相应浓度的混合标准溶液 用空白基质溶液(7.3)稀释成所需浓 度的标准校准溶液 阴性样品中添加标准溶液,按7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 试样中被测组分残留量利用数据处理系统计算或按式(1)计算 x=cxY×I0O 式中 -试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(ug/kg); X 从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 样品溶液最终定容体积,单位为毫升(mL) m -样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 9.1重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围及重 复性方程见表3
GB/T20760一2006 表3两种群勃龙的含量范围及重复性和再现性方程 被测物名称 含量范围/(ug/kg 重复性限r" 再现性限R -群勃龙 240 lgr=0.4376lgm-0.7122 lgR=0.6430lgm-0.5267 e群勃龙 lgr=0.4990lgm-0.7543 lgR=0.8253lgm-0.720" 240 注"为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9.2再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围及再 现性方程见表3
GB/T20760一2006 附 录 A 资料性附录 标准物质液相色谱图 A.1-群勃龙、3-群勃龙标准物质的色谱图,见图A.1 3.0 2.5 2.0 1.5 a-群勃龙 昌 日-群勃龙 1.0 0.5 0.0 -0.5 10 12 13 14 15 16 1/minm 图A.1a-群勃龙、卜群勃龙标准物质的色谱图 A.2a-群勃龙、B群勃龙标准物质的选择离子lC-MS-MS图,见图A.2. imten ×10 2.0 "-群勃龙 1.5 1.0 -群物龙 0.5- 0.0 10 1/min 图A.2a-群勃龙、,卜群勃龙标准物质的选择离子Lc-MIs-\Ms图
GB/T20760一2006 附录 B 资料性附录 收率 群勃龙的添加浓度及其平均回收率的试验数据,见表B.1 表B.1群勃龙的添加浓度及其平均回收率的试验数据(n=10 平均回收率/% 被测物名称 添加水平/4g/kg) 牛 肉 牛 肝 肾 80.7 79.5 80,8 B群勃龙 82.l 84.0 83.2 10 81.3 80.3 80.3 81.o 82.7 78，5 a群勃龙 82.4 81 2 81.5 10 83.2 80.3 80.8