GB/T15670.16-2017
农药登记毒理学试验方法第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
Toxicologicaltestmethodsforpesticidesregistration—Part16:Invivomammalianbonemarrowcellchromosomeaberrationtest
- 中国标准分类号（CCS）B17
- 国际标准分类号（ICS）65.100
- 实施日期2018-02-01
- 文件格式PDF
- 文本页数9页
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农药登记毒理学试验方法第16部分：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
国家标准 GB/T15670.16一2017 部分代替GB/T15670-1995 农药登记毒理学试验方法 第 16部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体 畸变试验 Iosieologiealtestmethodsforpestieidesregistration一 Part16:Invivomammmalianbonemarrowcellchrom0someaberrationtest 2017-07-12发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T15670.16一2017 修改了染毒方式内容(见6.4,1995年版的14.5.3); -修改了阅片的内容(见6.7,1995年版的14.5.5)
本部分由农业部提出并归口
本部分起草单位;农业部农药检定所
本部分主要起草人:肖杭、环飞、张丽英、陶传江
本部分所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T156701995
GB/T15670.16一2017 农药登记毒理学试验方法 第16部分:体内哺乳动物骨髓细胞染色体 畸变试验 范围 GB/T15670的本部分规定了体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验的基本原则、方法和要求
本部分适用于为农药登记而进行的体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注目期的引用文件,仅注目期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB14925实验动物环境及设施 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 染色单体型畸变 chromatid-ypeaberratiom 染色体结构损伤,表现为染色单体断裂或染色单体断裂重组的损伤
3.2 染色体型畸变chromsome-typeaberration 染色体结构损伤,表现为在两个染色单体的相同位点均出现断裂或断裂重组的改变
3.3 内复制endoreduplieationm 在DNA复制的s期后,细胞核并不进人有丝分裂期,而开始另一个s期的过程
其结果是染色体 含4,8,16个染色单体
3.4 裂隙ap 染色体或染色单体损伤的长度小于一个染色单体的宽度,为染色单体的最小的错误排列 3.5 染色体数目畸变chromosomalnumericalaberration 染色体数目改变,不同于所用细胞染色体的正常数目
3.6 多倍体poyoidy 哺乳动物细胞染色体数目正常为二倍体,在化学诱变剂的作用下染色体数目成倍地增加,如三倍 体、四倍体等
GB/T15670.16一2017 3.7 染色体结构畸变 chromosomalstrctureaherration 通过显微镜观察到的细胞分裂中期相的结构改变,如染色体缺失、染色体互换和内交换等
试验目的 检测受试物是否引起哺乳动物骨髓细胞染色体畸变,以评价受试物致突变的可能性
5 试验概述 染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体,当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时 诱发染色体型畸变,而作用于G2期时则诱发染色单体型畸变
给试验的大、小鼠腹腔注人秋水仙素 抑制细胞分裂时纺锤丝的形成,以增加中期分裂相细胞的比例,并使染色体丝缩短、分散、轮廓清晰
在 显微镜下观察染色体数目和形态
本方法特别适用于需考虑体内代谢活化后的染色体畸变分析
若有 证据表明受试物或其代谢产物不能到达骨髓,则不适用于本方法
6 试验方法 6.1受试物和仪器试剂 6.1.1受试物 首选蒸馏水作溶剂,如受试物不溶于水,可用食用油、食用淀粉、0.5%翔甲基纤维素钠配成乳浊液 或悬浊液
受试物应于灌胃前新鲜配制,除非有资料表明以溶液(或乳浊液、悬浊液)保存具有稳定性
如不是常用溶剂,应有参考资料并说明其成分及选做溶剂的原因
6.1.2仪器及试剂 6.1.2.1 仪器;生物显微镜,恒温水浴箱等
6.1.2.20.1%秋水仙素:置于棕色瓶中,4C冰箱保存
6.1.2.3姬姆萨(Giemsa)染液: 姬姆萨(Giemsa)染料 3.8g 375mL 甲醇 125mL 甘油 配制:将姬姆萨(Giemsa)染料和少量甲醇置于研钵里仔细研磨,再加人甲醇至375mL,待完全溶 解后,再加人125ml甘油,混合均匀
置37C恒温箱中保温48h
保温期间振摇数次,促使染料充分 溶解
取出过滤,两周后使用
6.1.2.4磷酸盐缓冲液(pH6.8). 1/15mol/几L磷酸氢二钠溶液;称取NaeHPO9.47g溶于1000ml蒸僧水中; 1/15mol/儿磷酸二氢钾溶液称取KH,PO9.07g溶于1000ml蒸水中 将磷酸氢二钠溶液50ml与磷酸二氢钾溶液50ml混合,用pH计测定并调节至pH6.8
6.1.2.5姬姆萨(Giemsa)应用液:取1份姬姆萨(Giemsa)染液与9份磷酸盐缓冲液(pH6.8)混合而 成,临用时配制
6.1.2.6固定液甲醇(分析纯)与冰乙酸(分析纯)以3:1混合,临用时现配
6.1.2.72.2%柠檬酸钠溶液或0.9%生理盐水
GB/T15670.16一2017 6.1.2.80.075mol/L氧化钾溶液
6.2实验动物 6.2.1动物选择 推荐使用大鼠、小鼠和仓鼠,其他合适的哺乳动物也可选用
应使用健康初成年动物,如使用 小鼠,周龄7周12周为最好
在试验开始时,动物体重差异应不超过同性别平均体重的士20%
动 物要随机分配到对照组和受试物处理组,每个剂量组、每种性别、每个采样时间点至少5只动物能用于 分析
如果有资料证明两性别间毒性作用无差别,则可只用一种性别的动物做试验
6.2.2饲养环境 试验前,动物应在饲养环境中检疫,适应3d~5d
实验动物饲养环境应符合GB14925的有关 规定
6.3剂量与分组 6.3.1剂量设计原则 如果没有适当的资料,应进行预试验来确定剂量范围
预试验所在的实验室、所用动物种属、品系 性别以及染毒方式应与正式试验相同
如果受试物存在毒性,应在第一个采样时间点设3个剂量,剂量 范围应包括从最大毒性至最小毒性或无毒性剂量
第二个采样时间点仅需设置高剂量
高剂量是能使 受试动物出现严重中毒反应的剂量,高于此剂量将会引起动物死亡
低剂量不应出现毒性反应
中,低 剂量按等比级数设置，一般高、中、低剂量可分别采用1/2LD.、1/4LD..、1/8LD..
对有特异生物学活性的受试物(如激索和促细胞分裂剂)可应用其他剂量设置原则
高剂量也可采 用能在骨髓中产生明显毒性的剂量(如抑制骨髓细胞有丝分裂指数达50%以上).
6.3.2限量试验 如果单次染毒(或同一天2次染毒)剂量在2000mg/kg体重以上,仍不产生可观察到的毒性效应 并且根据结构相关化合物的资料预期无遗传毒性,则不需要进行3个剂量水平的试验
染毒时间在 14d内的,剂量设为2000nmg/kg体重;染毒时间长于14d的,剂量设为1000mg/kg体重
如果人类 的可能(期望)暴露量过大,限量试验应以5000mg/kg体重剂量水平进行或选择更高的剂量
6.3.3对照组设定 6.3.3.1每次试验每一性别都应设置相应的阳性和阴性对照(溶剂/载体),除不用受试物染毒之外,对 照组动物应与染毒组动物以相同方式进行操作 6.3.3.2阳性对照组应预期可检测到超过本底值的体内染色体结构畸变的增加,以证实试验系统敏感 性
阳性对照的染毒途径可不同于受试物染毒途径,并且仅于单个时间点采样
最好使用与受试物化 学结构相关的阳性对照,常用阳性对照物参见附录A
6.3.3.3阴性对照为溶剂对照
依据动物间的变异和染色体畸变细胞频率的本底对照资料,判断是否 在每个采样时间点均设置阴性对照组,并与染毒组同样的方式处置
如果阴性对照采用单次采样,则最 适宜采样时间为首次采样时间
如果没有历史对照资料证明所用溶剂无细胞毒性或无致突变作用,则 应增设空白对照
6.4染毒方式 6.4.1常采用灌胃法染毒,阳性对照组也可采用腹腔注射的方法
推荐受试物1次染毒
给样量较大
GB/T15670.16一2017 的受试物,也可分次染毒,如在同一天中间隔不超过6h,2次染毒
首次采集样品时间推荐在末次染毒 后12h18h(正常细胞周期的1.5倍),第二次采集样品时间推荐为第一次采样时间后24h
6.4.2其他的染毒方式应说明理由
如果染毒超过一天,可采取末次染毒后12h~18h(正常细胞周期 的1.5倍)一次采样
6.5染色体制备 6.5.1大鼠在处死前4h,腹腔注射秋水仙素(4mg/kg体重)
小鼠约间隔3h5h,仓鼠约间隔 4h5h. 6.5.2处死动物,迅速取出股骨,剔去肌肉,去除血污,剪去两端的骨惭,用带针头的注射器吸取生理盐 水或2.2%柠檬酸钠溶液,插人骨髓腔内,将骨髓冲洗人10ml离心管,然后用吸管吹打骨髓团块使其 均匀,以1000r/min速度离心10 h,用滴管吸去上清液
m1n 6.5.3 低渗;加人0.075mol/几氯化钾溶液9mL用滴管将细胞轻轻地混匀,37低渗20nmin. 6.5.4预固定;立即加人固定液(甲醉:冰乙酸=3:1)1ml,混匀,以1000r/min速度离心10min 用滴管吸去上清液
6.5.5固定:加人7mL固定液,混匀,固定10min,以1000r/min速度离心10min,用滴管吸去上清 液
用同法再固定2次
6.5.6加人0.lmL~0.5ml新鲜固定液,用细口滴管充分混匀
6.5.7在洁净的冷冻玻片上方3em5cm处滴3滴一4滴细胞悬液于玻片上,轻吹细胞悬液扩散平铺 于玻片上,将玻片在酒精灯上微热烘烤,空气中自然干燥
每个标本制2张一3张
6.6染色 用新鲜配制的姬姆萨(Giemsa)应用液染色10min~15min,立即用磷酸盐缓冲液冲洗,晾干,写好 标签,阴凉干燥处保存
6.7阅片 6.7.1确定有丝分裂指数;包括所有染毒组,阴性对照组和阳性对照组(每只动物分析1000个细胞 以确定细胞毒性
6.7.2每个动物应至少分析100个分散良好的中期分裂相细胞.如畸变率很高,观察细胞数可减少 由于制片方法常导致有染色体丢失的中期相的比例改变,所计数的细胞含染色体数应控制在2n士2
6.7.3观察项目包括 染色体数目的改变;非整倍体,多倍体、内复制 a b)染色体结构的改变;断裂、微小体、有着丝点环、无着丝点环、单体互换,双微小体,非特定性型 变化如粉碎化、着丝点细长化、粘着)等
试验结果和评价 7.1试验结果 以表格表示各个动物的资料
试验单位是每只动物,对每只动物应评价计数的细胞数,每个细胞的 畸变数和有染色体结构畸变的细胞百分率
应列表给出在染毒组和对照组不同类型的染色体结构畸变 数目和频率
应另外计数并报告裂隙,但一般不计人总畸变频率
如果没有性别差异的证据,雌雄动物 的数据可合并进行统计学分析
统计学处理可用X检验,也可采用Fisher检验等统计方法
GB/T15670.16一2017 7.2试验结果的评价 7.2.1判断阳性结果的标准为:染毒组与阴性对照组相比,染色体畸变率增加有统计学意义并有明显 的剂量-反应关系时,即可确认为阳性结果
若统计学差异有显著性,但无剂量-反应关系,则应进行重 复试验,差异能重复者可确定为阳性
评价时应从生物学意义与统计学意义两方面进行分析
7.2.2结果不符合上述标准的受试物可认为在本试验系统中为阴性结果
7.2.3多倍体增加表明受试物可诱导染色体数目畸变
内复制增加表明受试物可抑制细胞周期进展 试验报告 试验报告应至少包括下列内容 试验名称、试验单位名称和联系方式、报告编号 a 试验委托单位名称和联系方式、样品受理日期和封样情况 b 、试验单位技术负责人、签发日期; 试验开始和结束日期,试验项目负责人 c d 试验摘要; 受试物名称、有效成分美国化学文摘登录号(CAs号(如已知),代码(如有),纯度(或含量 剂型、生产日期(批号),理化性质、配制所用溶剂和方法 实验动物种属,品系、级别,数量、体重,性别,来源(供应商名称、实验动物质量合格证号,实验 动物生产许可证号).检疫、适应情况,实验动物饲养环境,包括温度、相对湿度、饲料、单笼饲养 或样饲、实验动物设施使用许可证号; 剂量和组别,包括选择剂量的原则或依据、剂量和组别、动物分组方式和每组每种性别动物数 g 试验条件和方法,包括主要仪器设备、染毒途径、染毒方案、标本制备方法等; h 试验结果;以文字描述和表格逐项进行汇总,包括各组中毒表现,有丝分裂指数、各组的染色体 畸变类型和数量及其均数和标准差,各组数据的计算方法及统计学分析,剂量-反应关系等; 试验结论;给出受试物在试验条件下是否有致突变作用的结论,必要时对有关问题进行讨论 原始记录保存情况的说明
k
GB/T15670.16一2017 附 录 A 资料性附录) 常用阳性对照物 表A.1常用阳性对照物 阳性对照物 CAS号 参考剂量与途径 三亚乙基喘胺triethylenemelamine 51-18-3 1.0mg/kg体重(ip 甲碱酸乙酯(ethylmethanesulfonate) 62-50-O 60mg/kg体重(ip 759-73-9 乙基亚硝基脉(ethylnitrosourea 50-07-7" 丝裂霉素c(mitomyeinc 1.5mg/kg体重~2.0mg/kg体重(ip 40mg/kg体重(ig 环磷酰胺(cycophosphamide 50-18-0 或30mg/kg体重(ip)
农药登记毒理学试验方法：体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验
一、什么是体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验？
体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验是一种常用于评估化学物质致突变性的标准试验方法，也是农药登记毒理学试验的必要内容之一。
二、试验原理
本试验通过观察染色体畸变情况来评价化学物质对遗传物质的损害程度。一般来说，正常细胞的染色体数量和形态是相对稳定的，但在受到化学物质诱导后，染色体可能发生断裂、缺失、重排等不同程度的畸变，从而导致遗传物质的不稳定性增加。
三、试验步骤
1.将待测化学物质按照一定浓度进行处理，使小鼠摄入一定剂量的化学物质；
2.接种小鼠并观察其行为是否异常；
3.在一定时间内采集小鼠的骨髓细胞，并制备成染色体悬液；
4.使用显微镜观察染色体畸变情况，统计染色体数目和畸变率。
四、注意事项
1.试验前需要进行实验动物的饲养和管理。
2.试验过程中需要严格控制温度、湿度和光照等环境因素。
3.试验结束后需要对实验动物进行处置。
五、总结
体内哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验是一种常用的化学物质致突变性评价方法，也是农药登记毒理学试验的必要内容之一。通过该试验可以评估化学物质对遗传物质的损害程度，为保障农产品生产与使用安全提供科学依据。
