国家标准 GB/T31792一2015 向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofDiaporthehelianthiMuntanola-Cvetkovie MihaljcevicetPetrov 2015-07-03发布 2015-11-27实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31792一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;检验检疫科学研究院、合格评定国家认可中心、新疆出人境检验检疫局本标淮主要起草人;吴品珊、杜洪忠、蔡露敏、张祥林、严进
GB/T31792?2015 ???? Χ ?涨????? ????????? ? 2.1 ???,??(1/1000g>),?,?PCR ??PCR???????? 2.2? ?,?????????????,??? ????,????(0?,1. mm) ? 3.1? ,,,?,.0%(Naco),?,TieHcl,MaCl,Hc,.EDTA.NaoH NaOAc,KcI,Tis.cTAB.TAE,?(Ethanol),(Chloroform),(Iopropamol), ?(Iso oamylalecohol),SYBRGreenI?,?K,TaqDNA??,dNTP,?ITS5 ITS4,???PCRDH-F,DHR?DH-Pr 3.2 ?(PDA),ù?(SPDA)?μ ?A ? 4.1?? ??????,?紦??á???? ?????,?A?? ??,??ù,???мд?,? ,?? 4.2 mm10mm ?????????紦?5n С,
GB/I31792一2015 1%次氯酸钠表面消毒5min10nmin,灭菌水冲洗3次,用灭菌滤纸将水吸干后,置于含链霉素的 SPDA培养基平皿中,25C,8h光照/16h黑暗条件下培养,3d~5d后开始观察将种子样品用1%次氯酸钠表面消毒5min10min,灭菌水冲洗3次,保持无菌状态,在室温25C 下放置24h,再在一20下冷冻24h,然后转至含链霉素的sPDA培养基平皿中,25,8h光照/16h 黑暗条件下培养,3d5d后开始观察有种衣剂的种子,先将种衣剂洗掉(参见附录A),再进行上述操作 4.3生物学鉴定如在SPDA培养基上观察到真菌菌落,转接到PDA培养基平皿上纯化培养，5d7d后开始观察记录病菌的培养性状,显微镜下观察记录分生袍子和分生袍子器的形态和大小 4.4分子生物学检测 4.4.1DNA提取收集分离到的真菌菌丝,采用cTAB方法提取DNA(参见附录B) 4.4.2实时荧光CR检测实时荧光PCR引物序列为DH-F:5'-CGCTTATcTcTTACAcCAAAACcCT-3'，DH-R 5'-GCAGCTATTGAAACAGCTCATCTG-3',TagMan探针DH-Pr:5'-FAM-ATGCACCCACCGCA CTccTGC-BHQ-1-3' 探针5'端标记的荧光报告基团为FAM,3'端标记的荧光猝灭基团为BHQ-1 反应体系(25AL):样品DNA1AL.10×PCR缓冲液2.5Al,25mmol/LMgCl2Al.2.5mnmol/L dNTP2l,10mol/1Primer、各1AL,10mol/1探针DH-Pr1.5L5U/alTaqDNA聚合酶 0.3AL,ddH.O13.7AL 以无菌双蒸水作空白对照,阳性对照以向日葵茎溃疡病菌DNA为模板,阴性对照以向日类上其他真菌DNA为模板反应循环为,94c10min;94C15s、56C60s,40个循环 4.4.3IIs基因检测和序列比对可以选择利用真菌通用引物PCR扩增后测序比对的分子方法可利用真菌通用引物ITS5(5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3'和ITS45'-TcCTC CGCTTATTGATATGC-3')进行扩增 25L反应体系(25L)样品DNA1AL1ng一50ng),10XPCR缓冲液2.5l.25mmolL AL.10 mol/1Primers各0.5L5U/LTag DNA聚合酶 MgCI2AL,2.5mmol/LdNTP、2 0.2L,ddH.O16.3l 同时设置阴性对照,以Tris-EDTA缓冲液代替DNA样品 PCR反应条件为;94c4min;95C1min,56C30s、,72C45s,35个循环;72C10 ;4g min;4 保存 PCR产物的检测在1×TAE电泳缓冲液中,l.5%琼脂糖(含SYBRGreenI核酸染料)凝胶电泳， 5V/cm,凝胶成像仪分析结果如有500bp左有大小的条带出现,将扩增产物进行序列测定将测序后的序列与NCB网站GenBank中公开发表的Diaorhehelianthi的序列进行BLAsT 分析鉴定特征 5.1培养性状向日葵茎溃疡病菌在PDA培养基上生长,菌落初期为白色,菌丝体较密集,两周后渐渐变为褐色
GB/T31792一2015 至深褐色,其间形成暗褐色分生抱子器,菌落形态图参见附录C 5.2病菌形态向日葵茎溃疡病菌的菌丝分隔,分生袍子器聚生或散生,浅褐色、褐色至黑色,球形或扁球形,直径 120 一450 m,含有a和3两种类型的分生袍子《分生袍子无色、单胞,纺锤形或椭圆形,常有 Am 2 m×1.7 5.5 2个4个油滴,大小为(8m 5Am);B分生袍子无色、单胞,丝状线形,一端常 Amm Amm 为钩状,无油球,大小(16m一42m)×(0.5m~6.9m). 450 病菌在植物残体上形成有性器官子囊壳直径350Am Am,有喙状突起长350Am 600 67丝m)×7.5 m;子囊无色,大小(44Mm~67Mm 一12.54m),含8个子囊袍子;子囊抱子双胞、无色、 5Am nm)x(2.8pm~ 17.5 椭圆形,大小(12.5pm一19 9Mm 5Am 问日费禁遗疡稍岚的型分生袍子,寻型分生抱子的形态图参见附录c. 5.3实时荧光PCR检测在阳性对照.、阴性对照和空白对照结果均正常的情况下 -c小成等于38,判定阳性" Ct值大于或等于40,判定阴性; Ct值在36一40之间,应重做实时荧光PCR,再次扩增后如C值小于或等于36,或者C值大于或等于40,判定同上 5.4IIs序列比对经BLAsT分析,PCR扩增到的ITs基因序列与NCB网站GenBank中登录号为FJ841862.1的 Diaorthehelianhi的序列同源性为99%100%,则判定为阳性结果判定病菌的培养性状和形态特征与5.1和5.2的描述一致,且实时荧光PCR检测结果呈阳性,或ITs序列比对99%~100%同源,可判定为向日葵茎溃扬病菌样品保存与处理样品经登记和经手人签字后妥善保存对检出向日葵茎溃疡病菌的样品应保存于4C冰箱中,以备复核该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为向日葵茎溃疡病菌的菌株,应妥善保存将菌株接种于PDA培养基斜面上,20C培养5d,4C8C黑暗条件下保存,定期(60d)转接,至少保存6个月必要时用病菌的分生抱子作冻干菌种保存保存期满后高压灭菌灭活处理结果记录与资料保存完整的实验记录包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点、方法和结果等,并要有实验人员和审核人员签字
GB/I31792一2015 附录 A 资料性附录) 向日葵茎溃疡病菌的其他信息 A.1背景资料 A.1.1病菌基本信息 cankerofsunflower,stalkrotofsunflower 英文名;stem 学名:DiaporthehelianthiMuntanola-CvetkovicMihaljcevicetPetrov 无性态:Phomosishelianthi 分类地位;真菌界Fungi),子囊菌门Ascomycota),粪壳菌纲(Sordariomycetes s),间座壳目 Diaporthales),间座壳科(Diaporthaceae) 传播途径:向日葵茎溃疡病菌近距离传播主要是病菌抱子借助雨水飞溅、病残体以及农事操作工具传播,远距离传播主要通过种子和种子中夹带的病残体传播 A.1.2方法原理根据向日葵茎溃疡病菌的菌落性状,形态学特征和目标片段的序列特征为鉴定依据 A.2寄主范围向日葵Helianth4sannuus A.3病害症状茎杆和叶柄结合处枯黄色至淡褐色大型病斑,病斑可溃疡,边缘呈日烧状;发病严重时,病斑逐步扩展并包围茎杆,导致茎杆上部干枯,易折断,茎杆和叶柄的髓部腐烂坏死叶片病斑棕色或褐色,可整叶萎、干枯变黑花盘受害后发育不良,不能形成成熟的种子,或干枯败育发病严重时可导致整个植株死亡注引自M.Desanlis 图A.1向日葵茎溃疡症状
GB/T31792一2015 A.4地理分布波黑,克罗地亚,塞尔维亚、法国匈牙利意大利、摩尔多瓦、罗马尼亚、俄罗斯、斯洛伐克、西班牙、乌克兰、,巴基斯坦,摩洛哥、美国(明尼苏达州、俄亥俄州、德克萨斯州),墨西哥、阿根廷和委内瑞拉 A.5培养基马铃薯葡萄糖培养基(PDA);去皮马铃薯200g,切碎,加适量蒸憎水煮沸20min左有,双层纱布过滤,在滤汁中加人葡萄糖20g、琼脂18g,继续煮至琼脂完全溶化后,加蒸馏水补足1000ml,121C高压灭菌20min 链霉素马铃薯葡萄糖培养基(SPDA);去皮马铃薯200g,切碎,加适量燕憎水煮沸20min左有,双层纱布过滤,在滤汁中加人葡萄糖20g,琼脂18已.继续煮至琼脂完全溶化后,加蒸僧水补足1000ml. 21C高压灭菌20min 当培养基冷却至0笔左有时,无菌操作下加人I00m区链霉素,并用85%乳酸调节pH至4.5一5.0,摇匀,倒m,待平皿中的培养基凝固后备用 A.6种衣剂洗涤方法将种子放人样晶筛(10目或1.7mm)中,然后将样晶筛置于一个盛有灭菌水的小盆中浸泡3次一 5次,每一次浸泡20min一30min,期间缓慢摇晃样品筛3次一5次,以洗去向日葵种子表面的种衣剂
GB/I31792一2015 附录 B 资料性附录 DNA提取方法刮取菌落上的菌丝体,将收集的菌丝放人1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾碎待用离心管加人300nL500alLcTAB缓冲液(其中含0.1只蛋白酶K)混匀,65C水浴1h;13000" 离心5min10min,保留上清液;加500al三氯甲烧:异戊醇(体积比为24:1)混匀.13000离心 5min~10min,保留上清液;再加500l三氯甲炕:异戊醇(体积比为241)混匀,13000片离心 5min~10min,保留上清液;加人1mL异丙醉混匀,一70C下放置1h,或一20C过夜;13000片离心 30min,可见DNA沉淀;70%乙醇洗DNA沉淀,室温干燥;用30l一50lTris-EDTA缓冲液溶解 DNA,待用
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GB/I31792一2015 图c.3向日葵茎溃疡病菌B型分生抱子
GB/T31792一2015 参考文献 CABinternational Cr Protection igord. UK [1的 Compendium2007Edition walin rop CABInternational. [2]HerrL.J.，LippsP E.，wattersBL.Diaporthestemcankerofsunflower.PlantDiseease 1983，67(8:911-913. HuszarJ.，OccurrenceofSclerotiniasclerotiorun1LibdeBaryandDiaporthePho1op [3] sishelianthiMunt.Cvet.etal onlv.ranhifoliaNutt.inSlovakRepubie，PlantProtectSdi. 2011,47:52-54 [4]MuntanolaCvelkovieM.，MlhaljevieM.，PetroM..ontheidentityofthecausatie agentofaseriousPhoosis-Diaorthediseaseinsunflowerplants NovaHedwigia，1981，34(3/4): 417-435. [[5 SavotikovYu F.，SmetnikA.I.，Manualofthepests，diseasesandweedsofquarantine significancefortheterritoryoftheRussianFederationNizhniNovgorod，Russia:Arnika，1995 143-145. [6Slyusare.l，AntonovaT.S.，BochkarevN.I.，1998.OnthespreadofPhoopsi、infection onsunflower.ZashchitaiKarantinRasteni，No.1:;33-35. SmetnikA.I.，Aleksandrov.N.,SkripkaO.V.，lzmalkovaA.G.，1998.Sunflowerseedsas awayofpreservationofPhonopsisinfectionZashchitaiKarantinRasteni，No.l:35-36. [8 YangS M.，BerryR.W.，VongKaysoneT.，ANewSunflowerDiseaseinTexasCausedby Diaporthehelianthi.PlantDisease，1984，68:254-255

向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法GB/T31792-2015

向日葵茎溃疡病是一种常见的植物病害，会导致向日葵凋萎、死亡。为防止该病传播，需要对携带茎溃疡病菌的材料进行检疫鉴定。下面将介绍GB/T31792-2015标准中规定的向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法。

样品处理

样品应从疑似感染的向日葵株或其它植物器材中采集，每个样品重量不应少于100g。在采集过程中，应选择健康、无斑点和病损的部位作为样品。

分离鉴定

将样品表面消毒后，取样品1g，加入10mL生理盐水中，振荡25分钟。倒出液体，留下细菌沉淀，加入5mL无菌蒸馏水再次振荡25分钟，制备10倍稀释液。将100μL的10倍稀释液均匀涂布在PCA（Potato Carrot Agar）平板上，培养37℃存放24小时。

鉴定结果根据病菌形态、生理特性和分子生物学鉴定等方面确定。其中，向日葵茎溃疡病菌为黄色农杆菌属杆菌，培养基上呈圆形、直径1-3mm、黄色至橘黄色的小半透明菌落。产生琥珀酸反应、可利用葡萄糖和麦芽糖为碳源，而不能利用乳糖和蔗糖等特点。

检测限

本方法对向日葵茎溃疡病菌的最低检测限为10 CFU/ml。

结论

GB/T31792-2015标准中规定的向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法可以有效地检测到该病害，并为防止其传播提供了可靠的科学依据。