GB/T36824-2018
松针红斑病菌检疫鉴定方法
DetectionandidentificationofMycosphaerellapiniE.Rostrup
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数13页
- 文件大小11.29M
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松针红斑病菌检疫鉴定方法
国家标准 GB/T36824一2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法 DeteetionanlidentifieationofMycosphaerellapiniE.Rostrup 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36824一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/Tc271)提出并归口
本标准起草单位:安徽出人境检验检疫局
本标准主要起草人:李云飞、宗凯、姚剑,孙娟娟,华陈意、郑海松,余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满 谢超
GB/36824一2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了松属(Pius),其他寄主植物及植物材料中松针红斑病菌检疫和鉴定方法
本标准适用于松属及相关种属苗木、枝叶中松针红斑病菌的检疫和鉴定
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sN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 松针红斑病菌基本信息 中文名;松针红斑病菌
学名;MyeosphaerellapiniE.RostrupapudMunk(Envans,1984). 异名:EruptiopiniRostr.M
E.Barr & ScirrhiapiniFunk A.K.Parker rinaseptosporaG.Doroguine WODO septosporaG.Dorog.Sacc. marginalwmSacce 田 Thyr G.Shaw Var
sebtosborar，lineare" Thyr&.C.G.Shaw kenienseM.H.Ivory setosboruumvarkenienseM
.H.Iory inisensuauct.NZ G.Dor M.Morelet Drog. DothistromaseptosorumG.Dorog.M.Moreletvar
sebtosorum Sebtoria G.Dorog,Arx septospora 分类地位;真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota),座囊菌纲(Dothideomycetes),煤贪目(Capno diales),球腔菌科(My rcosphaerellaceae),球腔菌属(Mycosphaerella)
无性型为Dothisxt tronasepto sorum(Dorog.Morelet
松针红斑病菌的其他信息参见附录A
方法原理 本方法以松针红斑病菌的为害症状,形态特征,培养性状及分子生物学特征作为检疫鉴定的主要依 据,寄主及地理分布作为辅助鉴定依据
器材和试剂 5.1器材 透视显微镜,超净工作台,电子天平,培养箱、高压灭菌锅、恒温水浴锅,纯水仪,涡旋振荡器、高速冷
GB/T36824一2018 冻离心机,荧光定量PCR仪,可调移液器(1000L,200L,20AL,10L,2.5L)、培养皿、烧杯,三角 瓶、锻子、手术刀,剪刀、载玻片、盖玻片、量筒、吸管、酒精灯,移植环,研钵、液氮罐、标签等
5.2试剂 无水乙醇、次氯酸钠、CTAB缓冲液、酚、三氧甲烧、异戊醇、异丙醇、液氮、实时荧光PCR预混液、引 物和探针,麦芽浸膏琼脂培养基(MEA);2%麦芽浸膏、2%琼脂pH值为5士0.2
抽样方法 按sN/T2122进行抽样
现场查验 检查幼苗、针叶是否有浅绿色、黄色至红褐色的病斑,针叶是否坏死、脱落
观察坏死针叶是否为针 叶尖端坏死、病斑上是否有红褐色斑点、段斑以及黑色斑点(参见附录B)
将疑似感病样品或无症样品 标识清晰后带回实验室做进一步检验
8 实验室检验 8.1切片检验 选取疑似感病样品,剪取带有黑色斑点或凸起裂口的针叶组织(约5mm),用刀片对有黑点或裂口 组织块进行徒手切片,用移植环将切薄的组织片移至载玻片中央的水滴中,在显微镜下观察子囊座、子 囊抱子或分生抱子盘、分生袍子等病原菌相关特征
如针叶病斑上未发现黑点或裂口,可将有病针叶在 20C条件下保湿培养约20d,观察是否长出黑点或裂口,若长出则进行切片镜检
如针叶病斑组织切 片中的子囊座或分生袍子盘尚未见成熟的抱子,可将有病针叶在20C下保湿培养1d2d,待袍子成 熟后再做切片镜检
8.2分离培养 在典型病斑中切取小块感病组织或无症针叶组织(约5mm),将该组织在1%次氯酸钠中浸泡 0min
用无菌水冲洗3次后置于麦芽浸膏琼脂平板上,20C恒温光照(16h光照,8h黑暗)培养 2周一4周后镜检
期间要仔细观察菌落的生长状态并做记录
8.3形态观察 从菌落中挑取少许培养物,以水作浮载剂,制成玻片,在显微镜下观察
8.4实时荧光PCR检测 松针红斑病菌的实时荧光PCR检测方法见附录C 病菌形态特征 9.1有性阶段 子囊座在落叶上形成,通常位于红斑区,最初埋生于表皮下,成熟后不规则地或通过1个2个沿 针叶轴向的裂缝突出于表皮(参见附录B)
子囊座黑色,大小为(4004m10004m)×300 1m
GB/36824一2018 400pm)，具单或多腔
子囊为囊状至圆杜状,双囊壁,大小约为(G35m一55wm)x(Gm一》m),内 有8个子囊袍子,子囊袍子呈透明椭圆形,具圆形先端,具1个分隔,通常有4个油滴状斑点,大小 (10Mm15Mm×(3m44m).
9.2无性阶段 病菌不规则地分布于坏死区,部分死亡针叶组织上,有时会聚集于红斑处
分生抱子盘最初埋生于 针叶表皮下,呈腔室状,成熟时呈椭圃形,平行于针叶长轴排列
分生抱子盘黑色,大小为(300" 丛m一 650m)x(1504mm~300m),基座由厚壁的假薄壁细胞组织组成
成熟的分生袍子盘在潮湿条件下 会分泌白色透明的分生袍子黏液,分生抱子透明、薄壁、光滑、直或略弯,梭型至棍棒型,1个5个分隔 多数为2个~3个分隔,具有圆形先端和截型基部,(12m48Mm)×(24m~3m) g.3培养性状 松针红斑病菌在MEA平板上生长速度较慢(相对于松针褐枯病和松针褐斑病),最初产生灰白色 气生菌丝,逐渐变为灰褐色至黑色,菌落凸起呈爆裂状,在MEA平板上形成轻微的红褐色色斑
在 mm2.0mm 20C下菌丝每周生长1.5 1,菌丝生长最适温度为20C一25C,菌丝生长最适pHH值为 5
与近似种的区别 9.4 松针红斑病菌与近似种的区别见表1
表1松针红斑病菌与近似种的区别 松针红斑病菌 松针褐斑病菌 松针褐枯病菌 名称 Mycoshaerellaini Mycosphaerelladearnessi Mycoshaerellagibsoni 无色，壁薄、光滑
大小为茶褐色或烟褐色,壁厚、上布黑色淡黄褐色,壁薄,光滑
分生抱子大 12m一48m)×(2mn犹状突起
分生袍子大小为小为(20pmm一684m)×(2.5mm- 分生抱子 3Hm 1l14m64m×(14m6m)4.54m 在MEA培养基上生长缓慢，在MEA培养基上生长速度略 20C下菌落直径每周生长 快,20C下菌落直径每周生长 在MEA培养基生长速度最快,菌 培养性状 菌落呈灰2.5mm一3mm
菌落呈绿色至 1.5mm2mm
落呈灰色毛绒状 色、棕色至黑色
平板上形成黑色,有橄榄绿色的抱子黏液
轻微的红褐色色斑 平板上产生黄色色斑 松针上病斑浅绿色、黄色至红 松针上病斑褐色 松针上病斑浅绿色、黄褐色至灰色 症状 褐色 0结果判定 如果样品具有该病的典型症状,且切片或分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符,即可判定 为检出松针红斑病菌;如果分离培养的病菌形态特征与第9章的描述相符,且实时荧光PCR检测为阳 性,亦可判定为检出松针红斑病菌
11 样品菌种保藏 分离菌转接在MEA培养基斜面上,待斜面表面长满菌丝后,置于4C保存,定期转接,有条件可进 行冷冻干燥保存
检出病菌的样品标识清晰后妥善保存6个月,保存期满灭活处理
GB/T36824一2018 附 录 A 资料性附录 松针红斑病菌的其他信息 为害症状 A.1 感病针叶首先出现黄色斑点,之后逐渐变大具有明显界限的环绕针叶轴向的条带,最终导致针叶先 端死亡
该病的典型症状是褐色条带周围有一环绕针叶轴向的砖红色区域,然而该症状的出现取决于 寄主植物及感病位置,有些情况下并不出现
有时,砖红色色素会缩减为小红点分布于子实体结构周 围
感病针叶一般呈先端死亡、具有环带状患病部或坏死区,且具有绿色基底
严重感病的针叶会整体 变褐色,过早落叶,老叶先落;轻度感病的叶片,落叶病症会延迟12年出现
严重感病松树的典型症 状是只有当年生针叶,反复感染会导致枝条或整株树的死亡
A.2寄主 樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)、红松(P.koraiensi)、油松(P.tabulaeformis)、长白松(P.sy estriformis),偃松(P.pumila、云南松(P.ywnanensis)、湿地松(P.elliotti),火炬松P
taeda Linn、奥地利黑松(P.nigravar.austriaca、 南欧黑松(P.nigravar.oiretian、西黄松(P.onderosa) 白皮松(P
Bungeana、欧洲黑松(P.nigra ,辐射松(尸,radiata),扭叶松(尸.comorta)海岸松(P.pi naster)、加勒比松(P.caribaea,加那利松(P.caariensis)、地中海松(P.haleensis)、大叶松(P.en gelmannin),卡西亚松(P.kesiya),山松(P.montezumae)卵果松(P.oocarpn),北美乔松(P.strobus) ,柔松(P.jlerilis),欧洲山松 加州山松(P.monticola ,加州沼松(P. ),、糖松(P .ricata .lanberrtia1 尸.mugo)、辛松P.pungens)、多脂松尸.resinosa 、拟北美乔松P.pseudosrobws)、岛松P insularis)、长叶松(P.palustri)、意大利松(Pbinea、辐射松(P
raadiate)、瑞士五叶松(P.cembra) 及欧洲落叶松(L.arirdeidua),西特喀云杉(Piceasitchensis),北美黄杉(Pseudotsugamensiesii)等 植物
A.3地理分布 欧洲奥地利、比利时、法国、德国希腊、意大利、罗马尼亚、西班牙,瑞典、英国、前南斯拉夫、俄罗 斯,芬兰,波兰、捷克、丹麦,立陶宛、挪威、乌克兰、瑞士,葡萄牙
亚洲:文莱达鲁萨兰国、格鲁吉亚、印度(查诙和喀什米尔北方邦,泰米尔纳德邦、日本(北海道,本 州)、朝鲜、韩国、巴基斯坦、尼泊尔、菲律宾,斯里兰卡,(黑龙江,内蒙古)
非洲:肯尼亚、马拉维、南非,坦桑尼亚、乌干达、赞比亚、津巴布韦
北美洲;加拿大(不列颠哥伦比亚省,萨斯喀彻温省、纽芬兰,美国(加利福尼亚、佛罗里达州,夏威 夷、爱荷华,爱达荷州、马里兰州、伊利诺斯明尼苏达、蒙大纳、俄亥俄州、内布拉斯加州、奥克拉荷马、俄 勒冈,弗吉尼亚州,华盛棚》 中美洲和加勒比海地区;哥斯达黎加瓜地马拉、洪都拉斯、,牙买加,尼加拉瓜
南美洲:阿根廷,巴西巴拉那,圣保罗),智利,哥伦比亚、厄瓜多尔、乌拉丰
大祥洲;澳大利亚(新南威尔士州、昆士兰、塔斯马尼亚、维多利亚),新西兰
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GB/T36824?2018 ??(Pponderosa ??(Pponderosa h ????(Pnigra ????(Pnigra g iD ????(P.conlorla ?a),b),e)d)E:PpPo/CABL.MyphaerlladresiandMyoslaerellaini[R]BuletinoEPP EPPOBullitin38,349-362.e)Robertl.James.)SusanK.Hagle.g)A.StevenMunson.h) AndreKunrea.i)UsDAForestserviee,NorthermandIntermountainRegion. ?B.1(
GB/36824一2018 子实体凸出针叶表皮 子实体凸出针叶表皮 a b 图B.2松针红斑病菌(Myeosphaerellapini)子实体凸出针叶表皮(放大镜下可见红色素》 图B3潮湿条件下松针红斑病菌(Dothistru romaseptospora 分生抱子盘在针叶上产生透明分生抱子黏液
GB/T36824?2018 10um b 2 ? rellapin?? ?B4?Mycosphaer 25m ? b) ?B.5?Dothistromasepospora?? ?:?B,2?B,5EPPO/CABL.MycoshaerelladearnessiiandNMycosphaerellapimi[R]Bulletin(OEPP/EP POBulitin38,349-362
GB/36824一2018 附录 C 规范性附录) 松针红斑病菌的实时荧光PCR检测方法 c.1DNA提取 c.1.1将分离培养物置于研钵用液氮冷冻后磨碎,称取50mg100mg于1.5mL的灭菌离心管中,加 人700ALCTAB缓冲液,振荡混匀,置于65笔温浴60min~90min,期间不断混匀
C.1.2加人700!L酚:三氯甲烧:异戊醇(25:24:l),振荡均匀,12000r/min, n,离心15min. C.1.3取上清液放人另一1.5ml新管中,加人等体积的异丙醉,轻轻颠倒3次5次,室温下放置1h C.1.412000r r/min离心10min,弃去上清液
c.1.5加人400A70%乙醇溶液洗涤,12000r/min离心1min,弃上请液将离心管室退下干燥 15nmin. C.1.6加人50L一100LTE或dHO,充分溶解后置于一20C冰箱保存备用
注:也可使用试剂盒进行DNA提取,具体方法按照试剂盒说明书操作 C.2实时荧光PCR检测 C.2.1引物探针序列 松针红斑病菌实时荧光PCR方法鉴定引物探针序列见表C.1
表c.1引物序列 引物和探针名称 序列 MPF 5'-cCG;cCAGTGCTTCAACAcCT-3" MPR 5'-TGGGAGGCAGGATGAc(GAT-3' MP-P 5'-FAM-TGCCGGCATCCACGCAGC-TAMRA-3 C.2.2检测体系 按照表C.2配置反应体系,混合均匀后放人荧光定量PCR仪扩增
每个样品设置两个平行,以松 针红斑病菌DNA为阳性对照,其他真菌DNA为阴性对照,ddH.o为空白对照
表C.2检测体系 试剂名称 加人PCR反应体系的体积/pl 10 实时荧光PCR预混液(2× 正向引物(10mol/1 反向引物(10Hmol/L 探针(104mol/I) 0.5
GB/T36824一2018 表C.2(续 加人PCR反应体系的体积/ 试剂名称 DNA模板 ddH.O 5.5 总计 20 注，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整
C.2.3反应条件 9530s;95C15s,6025s,共40个循环
C.3 结果判定 C.3.1 对照结果 阳性对照;检测c'值小于或等于35 阴性对照;检测C'值大于或等于40; 空白对照;检测Ct值大于或等于40; 上述指标有一项不符合,应重做实时荧光CR扩增 c.3.2检测结果的判定 样品Ct值大于35,判定该样品为阴性
样品Ct值小于或等于35,判定该样品为阳性
0
GB/36824一2018 参考文献 [1]林业部野生动物和森林植物保护司和林业部森林病虫害防治总站.森林植物检疫对象 [[M].北京:林业出版社,1996,l19-129. [2]严进,吴品珊
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松针红斑病菌检疫鉴定方法GB/T36824-2018
松针红斑病菌是一种危害严重的植物病原菌，主要寄生于松树等多种针叶树上，给林业生产带来了很大的损失。为了及时发现和控制该病菌的传播，GB/T36824-2018《松针红斑病菌检疫鉴定方法》正式出台。
该标准主要适用于对进口或出口松木、松针等松科植物及其制品进行检疫鉴定，以确定是否存在松针红斑病菌。标准规定了样品的采集、保存、运输等基本要求，同时还对松针红斑病菌的形态特征、生长习性、毒力等多个指标进行检测和评定。
标准还规定了松针红斑病菌样品的检验方法和技术要求。其中，检验方法包括显微镜检查法、培养法、生物学测定法等多种方法，每种方法都有详细的操作流程和标准要求。而技术要求则包括松针红斑病菌样品的采集、保存、运输等方面。
总之，GB/T36824-2018标准的出台，为松针红斑病菌的及时发现和控制提供了基础性的技术规范和检测手段，可以有效保障林业生产的健康发展。
