水质急性毒性的测定发光细菌法

水质急性毒性的测定发光细菌法

国家标准 GB/T15441一1995 水质急性毒性的测定发光细菌法 waterquality一Determinationoftheacutetoxieity Luminescentbacteriatest 1995-03-25发布 1995-08-01实施 护 发布 豪 霭案 然 冒 " 督国家标准
国家标准 GB/15441一1995 水质急性毒性的测定发光细菌法 waterquality--Determinatonoftheacute toxieity -Luminescentbacteriatest 主题内容与适用范围 1.1主题内容 本标准规定了测定水环境急性毒性的发光细菌法 1.2适用范围 本标准适用于工业废水、纳污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测 方法提要 基于发光细菌相对发光度与水样毒性组分总浓度呈显著负相关(P<0.05),因而可通过生物发光 光度计测定水样的相对发光度,以此表示其急性毒性水平 水质急性毒性水平按8所述条件选用相当的参比毒物氧化汞浓度(以mg/儿L为单位)来表征,或选 用EC值(半数有效浓度以样品液百分浓度为单位)来表征 试剂和材料 本标准所用试剂除另有说明外,均应为符合国家标准的分析纯试剂、燕溜水或同等纯度的水 3.1氯化汞HigCl 3.2氯化钠NaCl,化学纯 3.3明亮发光杆菌T,小种(PhocobacteiumphosphaeumT,pp.)冻干粉,安瓶瓶包装,每瓶0.5g,在 2~5c冰箱内有效保存期为6个月 新制备的发光细荫休眼细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细 胞;当按6.2.4步骤将冻干粉复苏2min后即发光(可在暗室内检验,肉眼应见微光),稀释成工作液后 每毫升菌液不低于1.6万个细胞(Sml测试管)或2万个细胞(2ml测试管(均为稀释平板法测定) 在 毒性测试仪上测出的初始发光量应在600~1900mv之间,低于600mV允许将倍率调至“x2”挡,高 于1900mv 允许将信率渊至"x."档 仍达不到标准者,更换冻干粉. 34氧化悄溶液3:/100叫l. 氧化钠3g于玻璃容器内,用量筒加燕僧水100ml. 3.5 氧化钠溶液;2&/A00l. 氧化钠2g,加蒸懈水100ml,于试剂瓶内,2~5C保存 3.6参比毒物氯化汞标准溶液 0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20,0.22,0.24mg/L 3.7氯化秉母液p=2000mg/儿L. 万分之一分析天平精称峦封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000g入50ml容量瓶,用3g/100ml 氧化钠溶液稀释至刻度,置25c冰箱备用,保存期6个月 国家环境保护局1995-03-25批准 1995-08-01实施
GB/T15441一1g95 3.8氧化柔工作液,p=2mg/儿 用移液管吸氯化秉2000mg/儿母液10ml入1000ml容量瓶,用3s/100ml氯化钠溶液定容 再 用移液管吸取飘化汞20mg/儿液25ml入250ml容量瓶,用3g/100ml氯化钠溶液定容,将此液倒人 配有半微量滴定瞥的试液瓶,然后,用3g/100m氯化钠溶液将氧化汞2mg/儿溶液按表1稀释成系列 浓度(一律采用50ml容量瓶) 这些氯化汞稀释液保存期不超过24h,超过者务必重配 表1氧化汞工作溶液稀释配制系列在50ml容量瓶中) 加氧化汞(?mg/L)数,ml 0.5 2.5 4.0 3.5 4.5 5.0 5.5 6.6 稀释定容后氧化汞浓度,mg/Ll0.020.040.060.080.100.120.140.160.180.200.220.24 仪器 4.1生物发光光度计 配置2或5ml测试管 当氧化汞标准溶液浓度为Q.10mg/儿时,发光细菌的相对发光度为50%,其误差不超过土10% 2m或5m测试样品管(具标准磨口塞,为制造比色管的骏璃料制作,由专业玻璃仪器厂制造) 4.2 分别适用于相应型号的生物发光光度计 4.3微量注射器,10A. 4.4注射器,1ml 4.5定量加液瓶5ml 46吸管;2.0.ml. 47试剂瓶.Oal. 4.8量筒,100.,.500ml. 4.9棕色容量瓶;50、250、1000ml. 4 10半微量滴定管(配磨口试液瓶,全套仪器均为棕色10ml 样品 样品的采集和保存 5 采样瓶使用带有聚四氟乙希衬垫的玻璃瓶,务必清洁、干燥 采集水样时,瓶内应充满水样不留 空气 采样后,用塑胶带将瓶口密封 毒性测定应在采样后6h内进行 否则应在25c下保存样品,但不得超过24h.报告中应写 明水样采集时间和测定时间 对于含固体悬浮物的样品须离心或过滤去除,以免干扰测定 5.2样品液的稀释 5.2.1样品液测定前稀释的条件 样品液预试验取事先加氧化钠至3g/100ml浓度的样品母液2ml装入样品管,并设一支 CK管(氧化钠3g/100m溶液),按6所述测定相对发光度 5.21.2按5.2.1.1测得的样品,相对发光度低于50%乃至零,欲以C表达结果,则须稀释 5.21.3按5.2.1.】测得的样品,相对发光度在1%以上,欲以与相对发光度相当的氯化求浓度表达 结果,则不须稀释 5.2.2样品液的稀释液 样品液的稀释液一律用燕溜水,在定容前一律按构成氧化销3/400ml浓度裤加飘化悄或浓溶液 (母液只能加固体) 5.2.3样品液稀释浓度的选择
GB/T15441一1995 5.2.3.1探测试验 按对数系列将样品液稀释成5个浓度100%、10%、1%,0.1%,0.01%它们的对数依次为0,-1. -2,一3,一4),按6所述粗测一遍视1%~100%相对发光度落在哪一浓度范围 5.2.3.2试验 在1%~100%相对发光度所落在的浓度范围内再增配6一9个浓度(例如,若落在0.1%~10%之 间,则应稀释成0.1%0.25%,0.5%、Q.75%、1%,2.5%、5%、7.5%,10%,;若落在1%~10%之间,则 应稀释成1%.2%.4%.6%,8%.10%),按6所述再测一遍;这6一9个浓度,也可通过查对数表,按等 对数间距原则自行确定(例如,若落在1%10%之间,则应稀释成10%6.31%,3.98%、2.51% 1.58%1.00%,它们的对数相应为1.00,.0.80,0.80,0.40,D.20.0.00,对数间距均为0.2). 测定 6.1测定条件 6.1.1室温 室温2025C 同一批样品在测定过程中要求温度波动不超过士1C 且所有测试器皿及试剂、溶液测前1h均置 于控温的测试室内 6.1.2pH 若须测定包括pH影响在内的急性毒性,不应调节水样pH 若须测定排除pH影响在内的急性毒性,须将水样和CK(氧化钠3g/100ml)pH测前调至下值:主 要含Cu水样为4.5,主要含其他金属水样为5.4,主要含有机化合物水样为7.0. 6.1.3溶解氧 本法只能测定包括溶解氧影响在内的急性毒性 6.2测定步骤 6.2.1试管的排列 于塑料或铁制试管架上按以下二种情况排列测试管 6.2.1.1按5.2.1.3所述,样品母液相对发光度为1%以上者,如下排列 左侧放参比毒物氯化汞系列浓度溶液管,右侧放样品管 前排放氯化汞溶液和样品管,后一排放对 照(CK)管,后二排放CK预试验管 每管氯化秉或样品液均配一管CK氯化钠3g/100ml蒸憎水溶 液) 设3次重复 每测一批样品,均须同时配置测定系列浓度氯化汞标准溶液 表2试瞥在试管架上的排列 后 二排cKn的cKee 后一排 CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK CK o.24样1样1样1样2样2样2 0.020.020.020.040.040.04 样n 管 群 样 叙化汞(mg/L 品 6.2.1.2按5.2.1.2所述,样品母液相对发光度为50%以下乃至零者,如下排列 左侧仅放氧化汞0.10mg/几溶液管(作为检验发光细菌活性是否正常的参考毒物浓度,它反应 15min的相对发光度应在50%左右),右侧放样品稀释液管(从低浓度到高浓度依次排列) 其他同 6.2.1.1.每测一批样品,均须同时配测氧化汞0.10mg/儿L溶液 6.2.2加3g/100ml氧化钠溶液 用5ml的定量加液瓶给每支CK管加2或5ml氯化钠3g/100ml(据仪器型号而定). 6.2.3加样品液
GB/T15441一1995 用2或5ml吸管给每支样品管加2或5m样品液(据6.2.2而定) 每个样品号换一支吸管 6.2.4发光细菌冻干菌剂复苏 从冰箱2~5C室取出含有0.5g发光细菌冻干粉的安瓶瓶和氧化钠溶液,投入置有冰块的小号 (1~1.5L)保温瓶,用1ml注射器吸取0.5m冷的氧化钠2g/100ml(适用于5ml测试管)或1ml冷 的氯化钠2.5%适用于2ml测试管)注入已开口的冻干粉安瓶瓶,务必充分混匀 2min后菌即复苏发 光(可在暗室内检验,肉眼应见微光) 备用 6.2.5仪器的预热和调零 打开生物发光光度计电源,预热15min,调零,备用 6.2.6仪器检验复苏发光细菌冻干粉质量 另取一空2或5ml测试管,加2或5ml氧化钠3g/100ml(据6.2.2而定),加10H复苏发光菌 液,盖上瓶塞,用手颠倒5次以达均匀 拔去瓶塞,将该管放入各自型号仪器测试舱内,若发光址立即显 示(或经过5~10min上升到)600mV以上,此瓶冻千粉可用于测试,低于者按3.1.4处理，菌液发光量 先缓慢上升,约持续5一15 nmin,后缓慢下降,约持续4h 满4h的CK发光量应不低于400mV,低于者 更换冻干粉 6.2.7给各测试管加复苏菌液 在发光菌液复苏稳定(约半小时)后,按6.2所述,从左到右,按氧化汞或样品管(前)-CK管后 -氧化秉或样品管(前)-CK管(后)顺序,用10川微量注射器(勿用定加液器以减少误差)准确 吸取10叫复苏菌液,逐一加入各管,盖上瓶塞,用手颠倒5次,拔去瓶塞,敢回原位(每管加菌液间隔时 间勿短于30s.每管在加菌液的当时务必精确计时,记录到秒,即为样品与发光菌反应起始时间.立即将 此时间加15min,记作各管反应终止(也即应该读发光量)的时间 6.2.8发光细菌与样品反应达到终止时间的读数 按各管原来加菌液的先后顺序,当某臂达到记录的反应终止时间,在不加瓶塞的情况下,立即将测 试管放入仪器测试舱,读出其发光量(以光信号转化的电信号电压mv数表示》. 6.2.9有色样品测定干扰的校正 拿掉仪器祥品舱上的黑色塑料管口 a. 取一2m测试管(直径12mm),加氧化钠3g/100叫溶液2ml,将该管放进一装有少量氧化 b 钠3g/100ml溶液的5ml管(直径20mm)内,要使外管与内管的飘化销3g/100m叫l液面平齐.此作CK 管; c. 另取一2m测试管,加氨化钠3g/100ml亲液2ml,敢入另一装有少量有色待测样品液的 5ml管内,要使外管与内瞥的氧化钠3g/100ml液面平齐 此作CK管; d.于CK和CKc二管的内中同时加复苏发光菌液10l注意;必须是本批样品测定所用同 瓶复苏菌液),立即记时到秒,等反应满15min,迅即放入仪器测试舱,测定二只带有内管的5ml测试管 的发光量 分别记下发光量L,(CK臂)和L,(CKc管) 计算因颜色引起的发光量(mV)校正值AL=L一Le 按6.2.7和6.2.8所述常规步骤测试带色样品瞥及其CK管(氧化钠3g/100ml溶液)的发光 量(mV) 所有CK管测得之发光量(mV)均须减去校正值AL(mV)后才能作为CK发光量(mV).
GB/T15441-1995 /1oaNwa十前成 3g 3g/100mlNaCi 带也渊试液 2ml瞥 5ml管 CK CK 发光度L 发光度L 图1有色样品溶液测定干扰的校正 测试结果的表达 7.1计算样品相对发光度(%),并算出平均值 相对发光度(%)-氢化委虽管发光Y ×100 管发光WW 重复%土重复2)%土重复6 2 相对发光度(%)平均值= 7.2符合5.2.1.3条件者,建立并检验氧化汞浓度(C)与其相对发光度(T)%均值的相关方程,也可以 绘制关系曲线 求出一元一次线性回归方程的a(截距),b(斜率、回归系数)和r(相关系数),列出方程: T”=a十C 3 长化来" 查相关系数显著水平(P”值)表,检验所求，值的显著水平 若P<0.01,且Eca滚化买= ，=0.l10 士a.02mg/L,则所求相关方程成立;反之,不能成立,须重测系列氧化秉浓度的发光量 氧化秉溶液配 制过夜者,须重配后再测定 也可以据建立的上述方程绘制关系曲线 即指定发光度为10%和90%,代入上式,求出相应的 二个氯化秉浓度,在常数坐标纸上,定出二点,画一直线,即为符合该方程的氯化秉浓度与相对发光度的 关系曲线 7.3符合5.2.1.2条件者,建立并检验样品稀释浓度(C)与其相对发光度(T)%均值的相关方程,绘制 关系曲线 按7.2所述方法建立相关方程T=a十C样,并检验相关系数，显著水平(P值).若P<0.05,则所 求相关方程成立;反之,不能成立,须重测样品稀释系列浓度的发光量 根据测试结果表达样品急性毒性 8.1用氯化汞浓度表达样品毒性 8.1.1适用的条件 符合5.2.1.3条件(样品母液相对发光度大于1%)并按7.2建立了合格(P<0.Q1,EC =0.10 s0氧化秋 士a.02mg/L)的氧化柔浓度与其相对发光度相关方程着 8.1.2表达方法
GB/T15441一1995 将测得的样品相对发光度,代入7.2的相关方程,求出与样品急性毒性相当的氯化秉浓度( 般用mg/几表示); 测试结果报告同时列举样品相对发光度及其相当的氧化柔浓度值 b. &.13适用性 适用于相对发光度在1%以上、特别是50%以上(即不可能出现ECm值)但低于100%(即仍有中 低水平毒性)的样品毒性测定 8.2用EC,值表达样品毒性 8.2.1适用的条件 符合5.2.1.2条件(样品母液相对发光度低于50%乃至零)并按7.1建立了合格(P<0.05)的样品 稀释液浓度与其相对发光度相关方程者 8.2.2表达方法 将T=50代入7.3建立的相关方程,求出样品的EC值 这里的EC值以样品的稀释浓度(一 般用百分浓度)表示， 测试结果报告列举样品的EC值 8.2.3适用性 适用于相对发光度在50%以下、特别是零(即毒性水平较高或很高)的样品毒性测定,后者无法以 相当的氯化汞浓度表达毒性 8.3测定记录格式(见表3 表3样品急性毒性发光细菌测定法实验记录 测定日期 测定人 提取方式 加菌液时间 测定时间 发光量相对发光度L,% 抑制发光率,% 均值 份析号 备注 反应开始,读到秒》反应分钟,读到秒mv(样品/CcKx100%) 1L=100-L L=a十C, 回归方程 P<
GB/T15441--1995 8.4 测定结果报告内容 实验室室温; 采样地点、日期、时间， b 氧化汞浓度或样品稀释百分浓度与相对发光度的相关方程 T=a十C P mg/L Ec 样品EC.值(稀释百分浓度)或相对发光度(%)及其相当的化汞浓度(mg/L); 测定人及所在单位 方法的精密度 样品3次重复测定结果的相对偏差应不大于15% 附加说明 本标准由国家环境保护局科技标准司提出 本标准由科学院南京土壤研究所负责起草 本标准起草人顾宗廉、谢思琴、周德智乔鸿泽 本标准委托环境监测总站负责解释