葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T40140一2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法 Deteetionandidentifieationofgrapespilcstalkbrownspot 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/40140一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本文件起草单位;检验检疫科学研究院、宁波海关 本文件主要起草人:吴品珊、段维军、雷荣、徐晗
GB/40140一2021 葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法 范围 本文件规定了葡萄轴枯病菌的分离培养、,形态学鉴定、分子生物学鉴定方法 本文件适用于葡萄上葡萄轴枯病菌的检疫和鉴定 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 葡萄轴枯病菌的分类信息 中文名;葡萄轴枯病菌 英文名;grapespilkcstalkbrownspot 病原学名及中文名;Aeruriaallernala(Fr.Keissler,链格抱 异名;Alterariaallernatavar.rosicolaV.G.Rao,AlernariafasciculataCooke& EIlis)L.R JJones Grout、AternariarugosaMcAlpine、AlternariatenuisNees、Alternariatenuisf.chalaroides Sacc.、Aternariatenuisf.genuinaUnamuno、Aternariatenuisf.trichosanthisD.Sacc.、Aternaria &. EIlis、Torula . & tenuisvar naliMarchal Marchal、MacrosoriufasciculatumCooke allernataFr. 分类地位;真菌界Fungi,子囊菌门Ascomycota,座囊菌纲Dothideomycetes,格抱腔菌目Pleospo rales,格袍腔菌科Pleosporaceae 葡萄轴枯病菌的其他信息见附录A 5 方法原理 依据病害症状,分离菌的形态特征和分子生物学特性,根据该真菌DNA保守区的特异性进行常规 PCR或实时荧光PCR检测,通过电泳条带大小或扩增曲线的变化,对病菌进行综合检疫鉴定 试剂、材料和培养基 6.1试剂和材料 除有特殊说明外,所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂 试剂包括;次氯酸钠溶液(活性叙>10%,琼脂粉、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、CTAB提取缓冲 液、Tris饱和酚、三氧甲炕、异戊醉、异丙醇,无水乙醇,RNaseA、液氮,苯酚、氯仿、蛋白酶K、TaqDNA
GB/T40140一2021 聚合酶,dNTP,TaManMasterMix、核酸染料,DNA分子质量标准物等 材料包括;植物基因组提取试剂盒、普通PCR反应试剂盒、TagMan荧光PCR反应试剂盒、50× TAE电泳缓冲液 6.2培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA、马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA),具体配方的信息见附录B 仪器和用具 7.1仪器 生物显微镜放大倍数400倍以上,体视显微镜、二次纯水仪、光照培养箱、高压灭菌锅、超净工作 台、制冰机、离心机、PCR仪、实时荧光PCR仪、凝胶成像系统、电泳仪、电子天平(感量0.01g)、冰箱 7.2用具 可调移液器(2.5L、104L、20l,100L、1000AL),吸头,离心管,Eppendorf管(0,2ml,0.5ml、 11.5nml),塑料研杵,液氮罐 8 检疫鉴定方法 8.1 症状检查与病害症状 观察葡萄果穗分枝穗轴部位是否有变褐干枯,果粒是否失水萎,表皮是否有褐斑或霉状物 病害症状主要在幼穗的分枝穗轴上,初期有褐色水浸状斑点,后向主穗轴扩展形成褐色病斑,穗轴 变褐坏死,不久失水干枯,花穗易在分枝处折断,严重时,整个穗轴及其果柄全部变褐坏死,花蕾或花儿 乎全部落光 幼小果粒发病表皮上有圆形深褐色小斑,果粒膨大,病斑表面呈疮痂状,病痂癫脱落,果穗也 萎缩干枯 湿度大时病斑上可见黑色霉层,即病菌菌丝、分生抱子梗,分生袍子链和分生弛子 病害症 状见图A.1 8.2分离培养 将葡萄穗轴用流水冲洗干净，在穗轴的病健交界处切取0.5cm一1.0cm左有的小段,用1%次氯酸 钠消毒5min,无菌水冲洗3次,置于灭菌滤纸上吸去表面水分,放置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基 PDA)或带三层无菌湿滤纸的培养皿上,在25C下,两支40w灯管(色温4200K)12h光照、12h黑 暗交替培养3d4d,灯管距离培养物约40cm. 有疑似菌落的培养皿置于体视显微镜50×下观察,用解剖针挑取具有典型产抱结构的单根抱子链 上的单个抱子,转接于马铃薯胡萝卜琼脂培养基(PCA)上,在22C下,两支40w灯管(色温4200K) 8h照射和16h黑暗交替进行培养,灯管距离培养物约40cm,培养物面向上,1周后观察 8.3形态学鉴定 8.3.1培养物观察与测量 将上述培养物在体视显微镜50×下观察分生抱子梗产生的分生抱子和分生袍子链的特征(产抱表 型),显微镜下测量分生袍子大小包括长、宽、喙长、横纵(斜)隔膜数,抱子颜色,抱子表面有无突起等,测 量分生袍子和喙胞的大小各30个
GB/40140一2021 8.3.2病菌形态学特征 葡萄轴枯病菌菌落深灰色至暗青褐色,菌丝密集,褐色,分隔,多分枝 分生抱子梗单生或簇生,直 立或弯曲,有分隔,在其上部形成具短分枝的分生袍子链 分生袍子单生或短链生,近椭圆形、卵形或倒 棍棒状,呈淡褐色至暗褐色,表面光滑或具微刺;成熟时具2个8个横隔膜,1个4个纵、斜隔膜;分 140.0" )×5.0" 生袍子一般2个8个串生在一起,单生较少,大小(17.5Mm 12.5m),平均 从m 丛m 5.0 26.5Am×9.1m,短喙圆柱形或锥形,褐色大小(2.5m12.5m)×(2.5 4m),部分转变为 Am 产袍细胞,可二次分枝或产袍 形态图见附录A中A.4 8.4分子生物学鉴定 8.4.1DNA提取 将分离的疑似病菌收集,放人浸在液氮里的1.5ml离心管中,用一次性塑料杵碾碎,按照CTAB 法或植物基因组提取试剂盒提取DNA DNA提取方法按照附录C操作 8.4.2常规PCR检测 采用特异性引物AaltFor/AaltRev,按照附录D进行常规PCR检测 8.4.3实时荧光CR检测 采用实时荧光PCR特异性引物oPAF/R和TaqMan探针oPAP,按照附录E进行实时荧光PCR 检测 结果判定 病害症状和分离物的形态特征与8.1和8.3描述的一致,且常规PCR特异性引物扩增结果符合附 录D为阳性或实时荧光PCR检测结果符合附录E为阳性,可判定为检出葡萄轴枯病菌 10 样品和档案保存 10.1样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存 检出葡萄轴枯病的样品经登记签字,保存于4C冰箱中,至 少 少保存6个月以备复核,保存期满后应经高压灭菌后方可处理 对不需要长期保存的染病材料应及时 高压灭菌处理 10.2结果记录与资料保存 完整的实验记录包括;样品的来源、种类,时间,实验的时间,地点、方法和结果等,并要有实验人员 和审核人员签字
GB/T40140一2021 附 录 A 资料性) 葡萄轴枯病的其他信息 危害情况 A.1 葡萄轴枯病也叫葡萄穗轴褐枯病,发病一般在开花前后 主要危害葡萄幼嫩的穗轴,使穗轴变褐枯 死,危害严重 传播途径;病菌以分生抱子在葡萄枝蔓表皮以及在病残体越冬,为翌年初侵染来源 葡萄开花前至 开花期为病菌的主要侵染时期,以分生袍子通过伤口或自然孔口侵人幼穗穗轴的表皮组织 病菌近距 离传播主要靠染病穗轴上的分生抱子和农事操作,远距离传播主要靠葡萄贸易 葡萄轴枯病在我国一些葡萄产区有分布,多雨或空气湿度大的地区和年份发生较多 严重时,发病 穗率可达20%40%,导致减产10%30%,严重的减产40%以上 该病害是新西兰和澳大利亚进口 鲜食葡萄上关注的有害生物 病原菌情况 引起葡萄轴枯病的致病病原菌一直存有争议,最早国内认为葡生交链袍菌(Alerariauitioda)是 致病菌,国外研究认为是由链格抱菌(Aernariaalernata)引起 近年经广泛搜集资料和采集样本," 发 现引起国内葡萄轴枯病的致病菌非以往报道的葡生交链袍菌(Aernariaviticola),而主要是链格抱菌 Alternariaalternata. A.3病害症状 葡萄轴枯病菌病害症状见图A.1 图A.1葡萄轴枯病菌病害症状 A.4病菌形态特征 葡萄轴枯病菌分生袍子链和分生袍子见图A.2
GB/40140一2021 分生抱子链 b)分生抱子 注引自woudenbergJ.H.C.等,2013 图A.2葡萄轴枯病菌分生抱子链和分生抱子图中标尺为10Hm
GB/T40140?2021 ? B ) ? ?(PDA) B.1 ???200g,?,?20min,??,?м 20g,?17g,??1000mL,121C?20min B.2??(CA) ???20g,?20g,?,?20min,??,? ?17g,?1000mL,121C?20min.
GB/40140一2021 录 附 C 规范性 DNA提取 c.1试剂 c.1.1十六烧基三甲基澳化胺(cIAB)DNA提取缓冲液 十六烧基三甲基澳化胺(CTAB)4g,乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O,0.5mol/L)8mL,氯 化钠(NaCD)16.4段,1nmol/L三羚基甲基氨基甲婉-盐酸(Tris-HCI)20mL,颈基乙醇(cH,Os)4mL 加蒸馏水定容至200mL,调pH至8.0,121C高压灭菌30min C.1.2蛋白沉淀液 蛋白沉淀液由Tris饱和酚:三氧甲婉:异戊醇三种溶液以25:24:1的体积比进行配制,置于 4C保存 C.2DNA提取步骤 挑取菌丝约0.1lg,用灭菌滤纸吸干水分,放人1.5mL浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾醉待用 或将病组织0.1g一0.2g,在灭菌研钵中,加人液氮研磨后,放人1.5mL离心管中,待用 离心管中加人300L~500MLCTABDNA提取缓冲液和0.1g蛋白酶K,混匀,65C水浴1h 12000r/min离心5min,保留上清液 取上清液于1.5mL离心管中,加500L的Tis饱和酚:三氯甲烧:异戊醉(体积比为25:24:1)混 匀,12000r/min离心5min. 再取上清液于1.5m离心管中,加500AL的Tis饱和酚:三氯甲烧:异戊醉(体积比为25:24:1) 轻摇混匀,12000r/min离心5min. 取上清液,加人1ml异丙醇混匀,一70C下放置1h,或一20C过夜;12000r/min离心30 min， 可见DNA沉淀 弃去上清液,70%乙醉洗DNA沉淀2次,室温干燥后,用30AL50ALTris-EDTA缓冲液溶解 DNA,待用 用微量分光光度计测量DNA浓度,A/A比值应接近1.8 注:或者按照等效DNA提取试剂盒进行操作
GB/T40140一2021 附 录 D 规范性) 常规PCR检测方法 D.1引物序列 引物系列见表D.1 表D.1CR引物序列 引物名称 引物序列(5'-3' 扩增片段长度 AaltFor GTGCCTTCCCCCAAGGTCTCCG 184bp AaltRev CGGAAACGAGGTGGT'TCAGGTC D.2PCR扩增 0.2mLPCR管中,包含2×TaqPCRMasterMix12.5L,引物各1.0L(10mol/L),DNA模板 2L.20ng/L),ddH,O8.5L 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应条件为94C3min;9 ;94C30s,72C60s,35个循环;725min,4C保存 D.3琼脂糖凝胶电泳检测 在1×TAE电泳缓冲液中,2%琼脂糖凝胶电泳,5V/cm,0.5%核酸染料染色20min,凝胶成像仪 分析结果 D4结果判定 如果阳性对照及检测样品出现约184bp的条带,阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定 样品为葡萄轴枯病菌阳性 如果阳性对照出现约184bp的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现特异性条带,可判定样 品为葡萄轴枯病菌阴性
GB/40140一2021 录 附 E 规范性) 实时荧光CR检测方法 E.1引物和探针序列 引物和探针序列见表E.1 表E.1实时荧光CR引物序列和探针 引物和探针 引物序列(5'-3' OPAF TCACTACAGACCAAATCCCTT OPAR CCTACATCTCAAATGCCAAA oPAP TATcTTcTcAcGTcGGGccccTGN E.2实时荧光PCR反应体系 反应体系为0.2mL离心管中加人2×TaqManUnmversalPCRMasterMix10HL.oPAF 10Amol/L),OPAR(104mol/L)各0.5AL,探针OPAP(10mol/L)0.5L,DNA模板2AL,补水至 20AL 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 将反应体系混合均匀后置于荧光PCR仪中进行反应 反应程序;95C10min;94C15s60C60s,共40个循环 注:PCR反应体系中各试剂的量可根据具体情况进行适当调整,也可采用等效试剂盒 E.3结果判定 在空白对照及阴性对照无Ct值且无扩增曲线、阳性对照Ct值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的Ct值<35时,判定葡萄轴枯病菌阳性 待测样品的Ct值>40时,判定葡萄轴枯病菌阴性; 待测样品的35GB/T40140?2021 [1],,,÷,,,,.??о ????,2004,41(5):353-354 [[2],,,,?,.???PCR??.??? 2013,34(20):170-173. [3]?,?,κ,,,?,?,?.?? ????.??,2017,43(3):129-135. [[4],?,?.??о?.???,2014,42(4):1006,1008. [5 BaslmE.,BaslmH.,AbdulaiM.,BakiD.,OzturkN.Identificationandcharacterizationof Alernaria.alerataeausingleafspotofolivetreeOMeaeuroaeainTurkey[].CropProteeion 2017,92,79-88. KantR.,JoshiP.,BhandariM.,PandeyA.,PandeyS.IdentificationandpathogenicityofAl ternariaalernatacausingleafspotandbightdiseaseofAilanthusercesinIndia[].ForestPatholo gy,2020,D(OI:10.11l1/efp.12584. KonstantinovaP.,BonantsP.J.M.,vanGent-PelzerM.P.E.,vanderZouwenP.,vanden BulkR.DevelopmentofspecificprimersfordetectionandidentificationofAlternariaspp.incarrotma terialbyPCRandcomparisonwithblotterandplatingassays[].Mycological-research,2002,106(1) 23-33. [8]KordalewskaM.,Brillowska-DabrowskaA..JagielskiT.,Dworecka-KaszakB.PCRandreal timePCRassaystodetectfungiofAernariaalernatespeeesC].ActaioehinmPol,2015,62(4) 707-712. [9]woudenberg,J.H.C.,Groenewald,J.Z.,Binder,M.,Crous,P,w.Alernariaredefined.Studies inMycology,2013,75;171-212. 0

葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法GB/T40140-2021

一、背景

葡萄轴枯病菌是影响葡萄生产的重要病原菌之一，其主要危害是导致葡萄根系和干部坏死。因此，在葡萄繁殖材料的进出口、贸易和移植等方面，对葡萄轴枯病菌的检疫工作显得尤为重要。

现有的葡萄轴枯病菌检测方法大多基于分子生物学和传统的病菌鉴定技术，但这些方法存在一些缺陷，如操作复杂、耗时长、成本高等。因此，发展一种简单、快速、有效的葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法具有重要意义。

二、原理

GB/T40140-2021标准是基于病原菌培养和生物学特性的检测方法。该方法通过样品处理、菌种分离、形态观察和生物学鉴定等步骤，最终确定葡萄植株是否感染了轴枯病菌。

三、流程

GB/T40140-2021标准的检测流程主要包括以下几个步骤：

1. 样品采集：从葡萄株中取样，送检机构进行检测。
2. 样品处理：将样品经过表面消毒后，剪取根部、茎段或叶片等组织，分装于含有适宜培养基的试管中。
3. 菌种分离：将样品培养在适宜培养条件下，待病原菌生长出来后进行分离。
4. 形态观察：观察病原菌的生长形态、菌株特征和产孢情况等。
5. 生物学鉴定：通过对病原菌进行生化试验、酶谱分析和分子鉴定等方法，最终确定葡萄植株是否感染了轴枯病菌。

四、应用领域

GB/T40140-2021标准的检测方法可以应用于葡萄种质资源的筛选、繁殖材料的检测、葡萄产品的出口和进口等领域。该方法具有操作简单、结果可靠、成本低廉等优点，能够为葡萄生产和贸易提供强有力的技术保障。

同时，GB/T40140-2021标准的发布也为相关企业和机构提供了统一的检测标准和指导，有助于加强对葡萄轴枯病菌的防控和管理。

五、结论

GB/T40140-2021标准是一种简单、快速、有效的葡萄轴枯病菌检疫鉴定方法。该方法依托生物学基础，整合了样品处理、菌种分离、形态观察和生物学鉴定等步骤，能够快速准确地检测出葡萄植株是否感染了轴枯病菌。该方法的发布和应用，将为葡萄产业的健康发展和国际贸易提供可靠的保障。

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