十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36844一2018 十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 Deteetonandidentifieation ofPseudomonassyringaepv maculicola McCuloehYoungetal. 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36844一2018 前 言 本标准按照GB1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/Tc271)提出并归口 本标准主要起草单位:湖南出人境检验检疫局、上海出人境检验检 疫局 本标准主要起草人:唐连飞、周慧平,莫瑾、易建平、朱金国,黄迎波、谭建锡
GB/36844一2018 十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了十字花科细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法 本标准适用于十字花科蔬菜及其种子等植物材料中细菌性黑斑病菌的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T3543.2农作物种子检验规程托样 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样方法 十字花科细菌性黑斑病菌基本信息 中文名;十字花科细曲性黑斑病菌 学名;Pseudomomassyringaepv.maculicolaMcCulloeh)Youngetal. 英文名:cruciferbacterialblackspot 分类地位:十字花科细菌性黑斑病菌属假单胞菌科Pseudonmonaceae)，假单胞菌属 (Pseudooas),丁香假单胞菌(Pseudomonassyringae),斑点致病变种 其他信息参见附录A 方法原理 根据发病特征,病菌生物学和生理生化特性、分子生物学技术以及致病性等进行检疫鉴定 仪器和用具 S 生物显微镜、恒温培养箱、电子天平(千分之一)、植物恒温光照培养箱、冰箱、离心机、超净工作台、 PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪、可调移液器等 试剂和培养基 6.1试剂 除另有规定外所有试剂均为分析纯或生化试剂 6.2培养基 见附录B
GB/T36844一2018 检疫鉴定方法 7.1现场检疫 叶片出现近圆形或不规则形病斑,直径1 nmm5mm,初期水浸状,后期呈褐色至黑色,边缘较深 叶脉病变呈褐色水浸状等症状(参见附录A) 对现场发现上述类似症状的植株进行取样,进行实验室分离鉴定 取样方法见SN/T2122 蔬菜种子取样进行实验室分离鉴定 取样方法见GB/T3543.2 7.2病原菌分离 实验室用水满足GB/T6682要求 选择较新鲜的发病组织,切取病健交界部位,用无菌水冲洗掉泥沙后置75%乙醇中浸泡2min,用 无菌水清洗3次 在灭菌研钵中研碎,加几滴灭菌生理盐水浸泡15min一20nmin 用接种环蘸取划线 接种于营养琼脂(NA)平板,接种3个以 ！ 从种子检测样品中随机抽取50g种子灭菌水洗3次后加人灭菌水100mL浸泡0.5h;0.5%次氯 酸钠表面消毒10nmin,灭菌水洗3次,加人100ml 生理盐水,4C浸泡过夜;4层纱布过滤,滤液 10000r/min高心15min,lml灭菌水悬浮沉淀沉淀悬浮液10倍系列稀释,分别取10倍,100倍和 1000倍各100AL用于金氏B(KB)平板涂布分离,每个稀释度涂布10个平皿 将接种平板置28C士1C培养3d一4d,观察在平面上岗落光滑有光泽,白色至灰白色,边缘初圆 形光滑,质地均匀,后具皱耀,紫外线(254nm)照射产生黄绿色荧光 选取产生扩散性炎光的茵落用 NA纯化培养做进一步鉴定 7.3生化鉴定 7.3.1I.oPAT试验 蔗糖形成果聚糖、氧化酶反应、马铃薯软腐试验、精氨酸双水解反应和烟草过敏反应，按附录B 进行 LOPAT试验结果为;蔗糖形成果聚糖试验(十、氧化酶反应(一,马铃薯软腐试验(一)、精氨酸双 水解反应(一),烟草过敏反应(+) 7.3.2GATTa试验 明胶液化试验、七叶苷水解试验、酪氨酸酶活性试验、利用酒石酸盐试验,按附录B进行 GATTa的试验结果为;明胶液化试验(一或缓慢)、七叶苷水解试验(十)、酪氨酸酶活性试验(一、 利用酒石酸盐试验(十 7.3.3Bioog微生物鉴定方法 也可采用iolog生化鉴定方法进行鉴定 7.4PCR检测 7.4.1常规定性CR 从分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板,进行PCR检测和电泳分析 检测步骤和条件见附 录C,用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有十字花科细菌性黑斑 病菌的十字花科组织或种子基因组DNA为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行PCR扩增,将扩增产
GB/36844一2018 物进行琼脂糖电泳分析 待测样品扩增产物的电泳结果与阳性对照一致,阴性对照和空白对照未出现 条带,则判断为阳性,未出现与阳性对照一致的条带则判断为阴性 7.4.2实时荧光定性CR 以分离培养的细菌菌株中提取DNA作为模板,进行实时荧光CR检测 检测步骤和条件见附录 C,用十字花科细菌性黑斑病菌标准菌株基因组DNA作为阳性对照,用不含有十字花科细菌性黑斑病 菌的十字花科组织或种子基因组DNA为阴性对照,用双蒸水作空白对照,进行实时荧光PCR扩增 在阳性对照,阴性对照和空白对照均成立的情况下,样品出现阳性信号则判断为阳性,未出现阳性信号 则判断为阴性 7.5致病性检测 必要时,可进行致病性测定 将纯化的岚株在KB平板培养生长24h一8h后,用无菌牙签挑菌接种于KB液体培养基中 摇菌培养 h，离心收集沉淀，再用无菌水将菌体沉淀配成 26C士1,220r/min 12h24 1×10CFU/mll×10CFU/ml的菌悬液,采用针刺接种分离物分别接种油菜、花椰菜和番茄幼苗叶 片,种后放置于28C光照培养箱中90%的湿度条件下培养7d后观察是否有症状产生 接种油菜后 油菜叶片初期产生针尖大小斑点,后变为褐色坏死状病斑,病斑周围伴随着大量黄绿色晕圈,后期病斑 融合成不规则的大坏死斑 接种花椰菜叶片7d后,叶片产生针尖大小的黑褐色小斑点,斑点周围伴随 黄绿色晕圈 接种番茄叶片后,7d后观察叶片也产生黑褐色斑点,但斑点直径较大,症状较油菜和花 椰菜明显,斑点周围也伴随黄绿色晕圈(参见附录D) 从接种发病的油菜,花椰菜和番茄幼苗叶片重新 分离病菌,均可得到与接种物同样的分离物 结果判定 8.1分离的菌株符合7.2特征,生化特征符合7.3.1和7.3.2或符合7.3.3,且7.5致病性阳性时,判为检 出十字花科细菌性黑斑病菌 否则判定为未检出十字花科细菌性黑斑病菌 8.2分离的菌株符合7.2特征,常规PCR检测结果为阳性且7.5致病性阳性时判为检出十字花科细菌 性黑斑病菌;分离的菌株符合7.2特征,荧光PCR检测结果阳性时.判为检出十字花科细菌性黑斑病 菌 否则判定为未检出十字花科细菌性黑斑病菌 样品保存 9 检出十字花科细菌性黑斑病菌的样品经登记和经手人签字后妥善保存6个月以上 保存期满后应 经高压灭菌后方可处理 10 菌种保存 分离并最终鉴定为十字花科细菌性黑斑病菌的菌株转接到NA培养基试管斜面上,登记和经手人 签字后置于4C冰箱中保存,30d转接一次 也可将菌株冻干保存
GB/T36844一2018 附 录 A 资料性附录) 十字花科细菌性黑斑病菌相关资料 A.1分布 国外分布于保加利亚、捷克、丹麦、芬兰、德国,意大利、荷兰、挪威、俄罗斯、乌克兰、英国;日本、韩 国、土耳其;阿尔及利亚、毛里求斯、莫桑比克、南非、津巴布韦;阿根廷、巴西;加拿大、古巴、萨尔瓦多、波 多黎各,美国;新西兰、斐济等国;国内主要分布于浙江,湖北、湖南,云南、广东等省 A.2宿主 rassicacehinensisIinn. MakinoetNe 自然寄主:白菜(Br emoto)、萝卜(Raphanus sati var.olei/era vuusLinn.var sativws)、甘蓝(Br 3rassicaoleraceaLinnaeusvar.capitalaLinnaeus)花椰菜(Br 3rassica 、芜菁(Br brassicanaobrassicaMi.)、芥菜[B7r oleraceaIinnaeusvar bolrytisIinnaeus) Brassicajuncea zemajew、油菜(Brassica.camestrisL.)等多种十字花科植物 linnaeus)Cz6 A.3发病特征 该病菌在种子上或土壤及病残体上越冬,借风雨、灌溉水传播 由气孔或伤口侵人 病菌喜高温高 湿条件,发病适温25C27C,发病要求叶片有水滴存在,一般暴雨后极易发病,而且病情重 在田间 有明显的发病中心,在多雨潮湿的环境条件病害能迅速流行,株发病率100% 病斑初起出现在叶片背 面,初生不规则形,水浸状或油浸状绿色至淡褐色小斑点,直径很小,后变为具有光泽的褐色或黑褐色不 规则形或多边形病斑,薄纸状,不突破叶脉;开始时在外叶发生多,后延及内叶,叶片正面初起为与叶背 对应的青色斑块,当坏死斑融合后形成大的不整齐的坏死斑,可达2c 以上,后变为淡褐,黑褐 cm一4cm 色焦枯状;病菌还可危害叶脉,致使叶片生长变缓,叶面皱缩,开始外叶发生多,后波及内叶;发病严重 时,全株叶片表现为白色灼状斑块,后变为淡褐色焦枯状,导致植株枯黄而死亡 茎及花梗上病斑椭圆 形至线形.,水遗状,褐色或黑褐色.有光泽.斑点部分凹陷 角果上产生圆形或不规则形黑褐色,偶成条 斑,稍凹陷 根头部初生暗色病斑后变深,渐成黑色,或不规则圆形斑纹 A.4病菌生物学特性 曲体短杆状或链状,两端圆形,无芽袍，具1根一示根极生鞭毛.大小(as" Mm0.9m× 1.54m一2.5um),革兰氏染色阴性,好气性 在NA平面上菌落光滑有光泽,白色至灰白色,边缘初圆 形光滑,质地均匀,后具皱褶 在肉汁陈培养液中呈云雾状,没有菌膜 在KB培养基上产生扩散性蓝 绿色荧光 在0C一32均可生长,以25C27C最适,致死温度50C10min;酸碱度适应范围为 pH6.18.8,最适为pH7.0
GB/36844一2018 附录B 规范性附录) 培养基配制及试验方法 KB培养基 B.1 B.1.1kKB液体培养基 脉际蛋白陈20.0g,磷酸氢二钾(K,HPO.1.5g,硫酸镁(MgSO7H.O)1.5g,甘油10nml,蒸僧 水定容至1000mL(pH=7.0一7.2) 121C灭菌15min. B.1.2KB平板 在1000mlKB液体培养基中加人琼脂粉17.0g,l21C灭菌15min 制备平板 B.2NA培养基 牛肉浸膏3.0g,蛋白陈5.0g,氯化钠(NaCI5.0g,琼脂15.0只蒸僧水定容至1000mlL(pH=7.3 士0.1) 121C灭菌15min B.3LOPAT试验 蔗糖形成果聚糖试验 B.3.1 B.3.1.1培养基配制 蔗糖培养基;蛋白陈10.0g,氯化钠(NaCl)5.0g,蔗糖50.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000mL 121C灭菌15min 制备平板 B.3.1.2试验方法 用1×10CFU/ml~1×10'CFU/ml的细菌悬液同时在蔗糖培养基和葡萄糖培养基平板上分别 划线 于26C士1下培养3d~7d,期间不断观察菌落的形态 如果在蔗糖培养基上形成白色黏稠 隆起的菌落,表示可产生果聚糖,为阳性反应 B.3.2氧化酶反应 在培养皿或玻璃平板上放一张滤纸,滴加1%对-氨基二甲基苯胺盐酸盐2滴3滴,使滤纸湿润 用牙签挑生长24h的菌落涂在滤纸上,若在30s内变成紫色,则为阳性反应,否则为阴性 B.3.3马铃薯软腐试验 将新鲜健康的马铃薯洗净,用消毒酒精擦洗并火烧消毒去皮,用无菌刀切成7mm一8mm厚度的 薯片 将薯片置于灭菌的培养皿中,并加人3mm4mm深的无菌水 用无菌刀在薯片中部刻出 小凹穴,然后接种一环纯培养物,26C士1C培养24h,用接种环检测接菌处外侧马铃薯是否腐烂,如腐 烂,则为阳性
GB/T36844一2018 B.3.4精氨酸双水解酶试验 B.3.4.1培养基配制 蛋白陈1.0g,氧化钠(NaCl)5.0g,磷酸氢二钾(K.HPO0.3g,酚红0.01g,L-精氨酸盐酸盐 0.0g,琼脂15.0g,蒸水1000mL,pH7.2 121灭菌15min. B.3.4.2试验方法 每试管装培养基3ml4ml,冷却后针刺接种细菌纯培养物,直至培养基底部,立即用3ml灭菌 的15%琼脂封管,26C士1C培养7d 如果7d之内培养基呈深红色(或比原培养基颜色明显加深) 为精氨酸双水解酶阳性,颜色不变则为阴性 设不接种的培养基作对照 B.3.5烟叶过敏反应 配制1×10'CFU/ml1×10'CFU/ml的纯细菌悬液,用注射器将细菌菌液从烟叶下表皮注人 叶肉细胞间 选用未开花的烟草植株叶片 用无菌水作阴性对照,用标准菌株做阳性对照 接种后在 26,相对湿度85%、日照16h条件下,24h48h表现枯斑的为阳性反应,3d左右出现黄斑的为阴 性反应 B.4 GATTa试验 B.4.1明胶液化试验 B.4.1.1培养基配制 冷却前分装试管,每 牛肉浸膏3.0g,蛋白陈5.0g,明胶120g,水1000ml 121C灭菌15min 支4mL10mL B.4.1.2试验方法 穿刺接种纯化细菌,放在26C培养3d、7d和14d,将试管取出放在4C冰箱中15min,然后观察 明胶是否因分解而液化 以未接种细菌的明胶试管为对照 3d内液化的为阳性,7d14d液化的为 缓慢液化,l4d后不液化的为阴性 B.4.2七叶苷水解试验 B,4.2.1培养基配制 蛋白陈5.0g,酵母膏1.0g七叶灵1.0g,蔗糖5.0g,柠檬酸铁0.5g,琼脂粉15.0g,蒸僧水定溶至 1000mL(pH=7.0) 121C灭菌15nmin 制备平板 B.4.2.2试验方法 用牙签挑取新鲜供试菌株在七叶灵培养基平板上穿刺接种,26C培养2d~5d 培养基接菌处若 出现黑色或棕红色则说明产生了8糖苷酶,记为阳性 B.4.3酪氨酸酶活性试验 B.4.3.1培养基配制 甘油5.0mL,水解酪蛋白10.0g,磷酸氢二钾(K,HPO)0.5g,硫酸镁(MgsO7HO)0.25g,L
GB/36844一2018 酪氨酸1.0g,琼脂粉15.0g,蒸僧水定容至1000mL(pH=7.2) 121C灭菌15min 制备平板 B4.3.2试验方法 用牙签挑取新鲜菌落在酪氨酸培养基平板上穿刺接种,26C培养2d5d 接种处若有红色扩散 性色素产生,记为阳性 B.44利用酒石酸盐试验 B.4.4.1培养基配制 酒石酸钠盐2.0g,硫酸镁(MgsO 7H.(O)0.2g,氯化钠(NaCl)5.0g,磷酸二氢铵(NH,HPO 1.0g,磷酸氢二钾(K.HPo))1.0g,澳百里酚蓝(用乙醉配制的1.5%浴液)10mL用40%氢氧化钠 NaOH)调节pH至7.2,琼脂粉15.0g,蒸憎水定容至1000ml 121C灭菌15min 制备平板 B.44.2试验方法 用牙签挑取细菌在酒石酸盐培养基平板上穿刺接种,26C培养2d14d 在此培养基上能够生 长者记为阳性
GB/T36844一2018 附 录 C 规范性附录) 十字花科细菌性黑斑病菌的CR检测方法 C.1 试剂 C.1.1Tris-EDTATE)缓冲液 0mmol/儿Tris-Hcl(pH8.0) mmol/LEDTA(pH8.0 c.1.2TAE电泳缓冲液(p8.5)(50x) Tris 242g 冰乙酸 57.1ml 37.5g EDTA二钠盐(NaEDTA2H.O) 蒸水定容至1000ml,调pH至8.5 C.1.310×电泳上样缓冲液(pH8.5) 20%聚蔗糖-400 0.1mol/IEDTA二钠盐(NaEDTA)pH8.0 1.9%十二烧基硫酸钠(SDS 0.25%溴酚蓝 C.2引物信息 根据GenBank中十字花科细菌性黑斑病菌的Flie基因序列设计特异引物和探针,见表C.1 表C.1检测十字花科细菌性黑斑病菌的PCR引物和探针 引物名称 引物序列 探针序列 PR产物大小 PMn 5'-GcGAAAcGACAGcAAcAG;TG;-3” 5'-FAM-GCGCCACTTCCGAGGCTGCTT 307bp PM3 5'-CGAGTcGATAGCGGCAAC3 Temra3 C.3 细菌DNA的提取 将制备好的菌悬液移至一干净灭菌的离心管中,12000r/min离心15min,弃上清液 在沉淀中加 TE缓冲液5ml,l0%SDS溶液300AL,20mg/ml蛋白酶K30AL,混匀,37C水浴孵育1h 加人 等体积的三氯甲炕-异戊醇(24:1),混匀 10000r/min离心5min,将上清液移至一个新离心管中 加人等体积酚-三氯甲烧-异戊醉(25:24:1),混匀,10000r/min离心5min,将上清液移至一新离心 管 加人0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,l0000r/min离心5min,弃上清液,管中加人70%乙醉洗涤 沉淀,晾干,加人50LTE缓冲液溶解DNA沉淀，-20C长期保存
GB/36844一2018 采用商品化DNA提取试剂盒时,按试剂盒操作说明进行 C.4PCR检测 C.4.1PCR反应体系 检测十字花科细菌性黑斑病菌采用的PCR反应体系见表C.2 表c.2检测十字花科细菌性黑斑病菌的CR反应体系 组成 加样体积/l 2×PCR预混液 0.0 正向引物(10pmol/"L l.0 反向引物(10pmol/"l l.0 模板DNA(Ing/l10ng/pL 双蒸水 3.0 20 总体积 C.4.2PCR反应循环参数 94C预变性3min;94C30s,63C:30s,72C:30s,进行35个循环;72C延伸5min;4C保存 C.4.3PCR扩增产物的检测 用TAE电泳缓冲液制备2%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR产物,将混有上样 缓冲液的PCR扩增产物加至样品孔中,用DNAMarker做分子量的标记,进行电泳分析,电泳结束后 在凝胶成像分析仪下观察是否扩增出预期的特异性DNA电泳带,拍摄并记录实验结果 C.5实时荧光CR检测 C.5.1反应体系 实时荧光定性PCR反应体系见表C.3 每个样品进行实时荧光定性PCR检测时应设置2个平行 表c.3实时荧光定性CR反应体系 组成 加样体积/l 2×CR预混液 10.0 正向引物(10pmol/L 1.0 反向引物(10pmol/AL l.0 探针(10pmol/l 1.0 模板DNA1ng/l10ng/AL) 双蒸水 2.0 20 总体积
GB/T36844一2018 C.5.2反应条件 实时荧光定性PCR反应循环参数见表C.4 使用不同荧光PCR仪,可对参数作适当调整 表C.4实时荧光定性PCR反应循环参数 作用 时间/s 温度/C 活化DNA合成酶和预变性 600 96 PCR(40个循环 变性 15 96 延伸 60 60 设置荧光PCR反应管荧光信号收集条件,应与探针标记的报告基团一致 具体设置方法可参照仪 器使用说明书 C.5.3结果判断 待测样品荧光PCR检测结果两个平行样C>40时,同时各组实验对照结果正常,可判断检测结果 为阴性 待测样品荧光PCR检测结果至少1个平行样3540,同时各种实验对照结果正常,可判断检测结果为阴性 待测样品2个平行样PCR检测结果Ct<35并出现典型的扩增曲线,同时各组实验对照结果正常， 可判断检测结果为阳性 0
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GB/T36844一2018 参 考 文 献 [1]任欣正.植物病原细菌的分类和鉴定[M].北京;农业出版社,1994 [2]LelliottR.A.，EveBilling，HaywardA.C.ADeterminativeSchemefortheFluorescent Plant PathogenicPeudomoad:[门.JounalofAppliedMierobology1966,29(3):470-489. [3]B.A Latorre，A.L.Jones.Pseudomonasmorsprunorum，theCauseofBacterialCankerof SourCheryinMichigan，anditsEpiphyticAssotiationwithPsyringae[] Phytopathology,1979. 69:335-339.

了解GB/T36844-2018：十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法

一、引言

十字花科是一类重要的蔬菜作物，在全球范围内广泛种植。其中，甘蓝属是十字花科中最重要的属，其种植面积和产量均占据十字花科总产量的很大比例。然而，由于细菌性黑斑病菌的侵染，甘蓝属的产量和品质受到严重威胁。

因此，为了保护我国蔬菜作物的生产安全，GB/T36844-2018标准提出了一套科学规范的十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法。

二、GB/T36844-2018标准概述

GB/T36844-2018是我国针对十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法制定的最新标准。该标准主要包括以下内容：

• 术语和定义：规范了涉及到的各种专业术语，以便统一理解。
• 样品采集和处理：明确了样品采集和处理的具体方法，以保证样品的质量。
• 病原学检测：详细介绍了从样品中分离、培养、鉴定细菌性黑斑病菌的方法。
• 分子生物学检测：简述了PCR技术在细菌性黑斑病菌检测中的应用。
• 检疫鉴定：阐明了如何根据检测结果进行细菌性黑斑病菌的鉴定。
• 检测报告：规定了检测报告所需包含的信息，以及如何编写检测报告。

三、GB/T36844-2018标准的应用

GB/T36844-2018标准适用于十字花科蔬菜及其种子、土壤、水样等物质中细菌性黑斑病菌的检疫鉴定，旨在保障蔬菜生产和国际贸易安全。

该标准可被广泛应用于农业生产、检验检疫机构、科研院所和大专院校等领域。

四、结论

GB/T36844-2018标准提供了一套科学规范的十字花科细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法，对于保护我国蔬菜作物的生产安全具有重要意义。各相关行业应认真贯彻执行该标准，提高检测技术的同时，加强对十字花科细菌性黑斑病菌的防治措施，进一步提高我国蔬菜作物生产的安全性和可持续性。

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2022/8/12 4:20:47 现行