T4DNA连接酶

T4DNA连接酶

国家标准 GB/T36389一2018 T4DNA连接酶嗨 T4DNAligase 2018-06-07发布 2019-01-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/36389一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国工具酶标准化工作组(SAC/SwG1l)归口 本标准起草单位;福建南生科技有限公司、福建华灿制药有限公司、苏州海狸生物医学工程有限公 司、厦门致善生物科技股份有限公司、厦门大学,安琪酵母股份有限公司 本标准主要起草人;郑登忠、詹学雄,黄发灿、任辉,赵晶,章丽丽,宋娜杰张永有、姚鹃
GB/T36389一2018 引 言 T4DNA连接酶来源于重组基因工程菌,催化相邻DNA链的5'-P末端和3'-OH末端以磷酸二酯 键结合的反应,促使黏性末端之间或平末端之间的连接 制订T4DNA连接酶国家标准,用以推动该 类工具酶的产业化具有重要的意义
GB/36389一2018 T4DNA连接酶 范围 本标准规定了T4DNA连接酶的技术要求、检验方法,包装、运输、贮存和保质期 本标准适用于从重组基因工程菌分离纯化的T4DNA连接酶 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 YY/T0087 电泳装置 YY/T0657医用离心机 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 T4DNA连接酶T4DNAligase -种核酸连接酶,能催化相邻DNA链的5'-P末端和3'-oH末端以磷酸二酯键结合的反应,促使 黏性末端之间或平末端之间的连接 3.2 T4DNA连接酶活性单位aetivityunitofT4DNAligase 在20AL1×T4DNA连接酶反应缓冲液中,16C反应条件下,30min能使50%的经Hind消化 的入DNA片段[5'端浓度为0.12mol/L(300g/mL]连接所需的酶量定义为1个活性单位(U). 技术要求 4.1外观 澄清透明的液体,无沉淀 4.2T4DNA连接酶活力 >8000U/ml 4.3杂质 不应含有核酸外切酶和核酸内切酶
GB/T36389一2018 5 检验方法 5.1外观 直接或将样品倒人无色透明试管中,在自然光条件下,肉眼观察 5.2T4DNA连接酶活力 依据附录A的方法进行检测 5.3杂质 5.3.1核酸外切酶 依据附录B的方法进行检测 5.3.2核酸内切酶 依据附录C的方法进行检测 o 包装、运输及贮存 6.1包装 内包装材料应洁净无污染,封口应严密,无泄漏 外包装箱储运图示标志应符合GB/T191的 规定 6.2运输 产品应在冷冻条件下运输,运输工具应清洁卫生、干燥,并有防雨、防晒设施,运输过程中应做好防 护措施避免倒置及破损 不宜与有毒、有害、有异味物品混运 6.3贮存 应在温度低于一20C的条件下储存 保质期 在符合本标准规定的条件下,包装完好未启封的产品保质期为3年;超过保质期,使用前应检测酶 活力
GB/36389一2018 附 录 A 规范性附录 T4DNA连接酶酶活力检测 A.1仪器设备 A.1.1紫外分光光度计 A.1.2电泳系统,应符合YY/T0087的要求 A.1.3冷冻离心机;可以在4C下进行离心,离心转速10000r/min以上,应符合YY/T0657的要求 A.2试剂 A.2.1总则 除非另有规定,本方法所用的试剂应为不含DNA和DNase的分析纯试剂,所有试剂溶液宜大体积 配制、小体积分装后经高压灭菌后使用,不宜高压灭菌的试剂应用0.22um过滤器过滤除菌;酶缓冲液 应避免反复冻融;水为GB/T6682规定的一级水 A.2.2溶剂配制 A.2.2.1TE缓冲液:10mmol/几Tris-HCl(pH8.0),lmmol/L乙二胺四乙酸(EDTA),使用HCI或 Na(OH调节pH A.2.2.210×T4DNA连接酶缓冲液;400mmol/儿Tris-HCI,100mmol/LMgCl,,100mmol/L二碗 苏糖醇(DTT),5mmol/LATP(pH7.8 A.2.2.350×TAE缓冲液;称取484gTis,量取114.2ml冰乙酸,200ml.0.5mol/LEDTA(pH8.0). 溶于水中,定容至2L A.2.2.410×凝胶加样缓冲液;含0.25%澳酚蓝,0.25%二甲苯青FF,30%甘油水(体积分数)溶液 试验步骤 A.3.1入DNA-Hind皿底物制备 A.3.1.1按表A.1配制酶切反应体系 表A.1酶切反应体系 体积V/L 试剂 40 10×Buffer ADNAo.3/A 60 10 Hind(20U/AL 水 290 总体积 400 注加孵之前将反应混合物混匀(可以用移液枪吸取混匀吸取混合或轻弹管壁,切忌振荡混匀;轻轻混匀,短暂 离心
GB/T36389一2018 A.3.1.237C反应4h 反应结束后向样品管中加人等体积的酚-氧仿-异戊醉(25十24十1),轻轻摇 匀;12000r/min离心8min 小心地将上清转移到新的微量离心管中,不要吸到下面有机相里的液体 A.3.1.3加人等体积的氯仿-异戊醇(24+1),轻轻摇匀;12000r/min离心8min 小心地将上清转移 到新EP管中 A.3.1.4加人1/10体积的3mol/1醋酸钠颠倒混匀,再加2倍以上体积的无水乙醇,颠倒充分混匀后 室温放置沉淀 A.3.1.5用适量75%80%乙醇清洗白色沉淀2次 A.3.1.6放于超净台轻风将残余乙醇吹干,也可以室温蒸发 A.3.1.7用适量的TE缓冲液溶解DNA . A.3.1.8紫外分光光度计和琼脂糖电泳检测DNA浓度和纯度(电泳检测结果条带清晰明亮,无杂带， 范围分布在23130bp125bp之间 紫外可见分光光度计测定产物的A/A在1.8~1.9之间 A2o/A0>2) A.3.2T4DNA连接酶活力检测 按表A.2顺序配制20uL连接反应体系,每个梯度设置3个平行 表A.2酶活力测定反应体系 试剂 加人量 10×T4DNAligase缓冲液 2ALl 底物DNA(一般用入DNA-Hind片段 1Hg 参照酶/待测酶 分别加人0.0L,0.5AlL,l.0L,1.5l,2.0 水 补齐至20l weiss=200U. 注1待测酶用贮存溶液稀释至约lU/AlL;参照酶根据标示量用贮存溶液精确稀释至1U/L(lw 注2;本标准暂采用NEBT4DNA酶为参照酶,待有市售T4DNA连接酶标准物质时,可直接替换采用标准物质 作对照 注3构建连接酶的阳性对照组和无酶阴性对照组 注4:加酶之前将反应混合物混匀(可以用移液枪吸到混匀或轻弹管壁,切忌振荡混匀);轻轻混匀,短暂快速离 在最适温度下(一般为16C),反应30min. 心， A.3.3电泳 称取0.8g琼脂糖,于100mlTE缓冲液中加热,充分溶解,加人澳化乙锭(10mg/mL)稀释至终 浓度为0.5g/mL,制胶 在电泳槽中加人TE缓冲液,使液面刚刚没过凝胶 将5AL8pL酶连接 产物分别和适量10×凝胶加样缓冲液混合,点样 9V/cm恒压电泳,直至澳酚蓝指示剂迁移至凝胶中 部 紫外检测仪下观察电泳结果并记录 A.4酶活力计算 A.4.1观察电泳结果,取待测酶和参照酶电泳图谱条带最一致的进行比较计算 A.4.2酶活力计算[见式(A.1)]
GB/36389?2018 D U= (A.1 xU ? ???; D D. ???; =200U): u ??(1weiss= U ??
GB/T36389一2018 附 录 B 规范性附录) 核酸外切酶检测 B.1原理 cCCpUC19所含经BamHI位点居于编码L.ac乙的a互补肽上,CCCpUC19经BamH】酶切后 由环形DNA结构形成稳定的具有至黏性末端的双链DNA,其末端突出部分由五个碱基形成单链,极 易受核酸外切酶作用 若样品存在核酸外切酶时,黏性末端易受外切酶切割,再经T4DNA连接酶连 接,其电泳条带位置不一致 B.2仪器和设备 B.2.1恒温水浴槽 B.2.2台式离心机 B.2.3超净工作台 B.2.4电泳仪 B.3材料 B.3.1高纯CCCpUC19DNA B.3.2T4DNA连接酶 B.3.3氯仿-异戊醇(24+1) B.3.4琼脂糖 B.4实验步骤 B.4.1长时程过量酶切 分别称取54g高纯CCCpUC19DNA置于两只微量离心管,分别标记阴性对照和测试管,在阴性 对照管里加人10AL10×BamHI缓冲液,2AL限制性内切酶BamHI10U20U),加水至 100AL;在测试管里加人10AL.10XBaH1缓冲液,2L限制性内切酶BamH1(10U一20U) 5ALT4DNA连接酶样品(50U~100U),加水至100Al 混匀,37C水浴10h,各取出20AL,分别 标记为1号、2号,待电泳检测;再各取20L,分别标记3号、4号 B.4.2电泳 B.4.2.1取出1号和2号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 B.4.2.21%~1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cnm~10V/cem,当澳酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照
GB/36389一2018 B.4.3连接 B.4.3.1回收NA 取出3号和4号管,各加人20L氯仿-异戊醇先脱去杂蛋白,再沉淀出DNA,并真空干燥样品 B.4.3.2连接反应 每管加人2AL10×T4DNA连接酶缓冲液,2UT4DNA连接酶,加水至20L,混匀,15笔水浴 8h B.4.3.3电泳 B.4.3.3.1取出3号和4号管,加人载样缓冲液,准备电泳检测 B4.3.3.21%1.5%琼脂糖,电泳电压5V/cm10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳， 取出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 B.5结果判定 在电泳板上,肉眼观察 若1号和2号的谱带一致.3号和4号的谱带一致,则判定样品中不含楼 酸外切酶;若1号和2号的谱带不一致或(和)3号和4号的谱带不一致,则判定样品中含核酸外切酶
GB/T3638g一2018 附 录 C 规范性附录) 核酸内切酶检测 c.1原理 pC19质粒为环状结构,核酸内切酶能破坏环状结构,两者电泳谱带不一致 c.2仪器 c.2.1电泳仪,备电泳槽 C.2.2分析天平(万分之 C.2.3紫外透光分析仪 c3实验步骤 C.3.1pUc19质粒反应 C.3.1.1在测试管里先后加人4LpUC19质粒DNA(1g/L)、l4L水、2L酶,振荡器混匀,水浴 1h. C.3.1.2在对照管里先后加人4LpUC19质粒DNA(1g/pL)、16AL水,振荡器混匀,水浴1h C.3.2电泳 1%1.5%琼脂糖凝胶,电泳电压5V/em10V/cm,当溴酚蓝线到达凝胶板2/3时停止电泳,取 出凝胶板置于紫外透光分析仪观察和拍照 C.4结果判定 在电泳板上,肉眼观察 若测试管和对照管的谱带一致,则判定样品中不含有内切酶;若不一致,则 判定样品中含有内切酶

T4DNA连接酶GB/T36389-2018介绍

T4DNA连接酶是一种广泛应用于分子生物学领域的酶类，主要作用是在DNA单链之间形成磷酸二酯键，从而连接DNA分子。GB/T36389-2018是对T4DNA连接酶技术规范的制定和规范化，旨在提高实验结果的可靠性和准确性。

T4DNA连接酶的结构与功能

T4DNA连接酶属于DNA连接酶家族，重约68kDa。它能识别DNA单链末端，并在ATP水解的驱动下，在两个DNA链之间形成磷酸二酯键，从而连接DNA分子。

由于其在连接DNA方面的高效性和特异性，T4DNA连接酶广泛应用于PCR产物克隆、DNA测序、基因工程等领域。

GB/T36389-2018的制定背景

随着T4DNA连接酶技术在分子生物学领域的广泛应用，对其质量和规范性的要求越来越高。GB/T36389-2018是在此背景下制定的技术规范，它包括了T4DNA连接酶试剂盒的使用方法、性能指标、质控和检验等方面的内容。

GB/T36389-2018的主要内容

GB/T36389-2018主要包括以下内容：

• T4DNA连接酶试剂盒的一般要求
• T4DNA连接酶的性能指标
• T4DNA连接酶的使用方法
• T4DNA连接酶的质控与检验

结语

T4DNA连接酶GB/T36389-2018的规范化标准对于提高实验结果的可靠性和准确性具有重要作用。在实际操作中，我们需要严格按照标准操作，以保证实验结果的有效性和可靠性。

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