家畜日本血吸虫病诊断技术

家畜日本血吸虫病诊断技术

国家标准 GB/T18640一2017 代替GB/T186402002 家畜日本血吸虫病诊断技术 Diagnwstietechmiquesfordomestieamimalschistosomiasis 2017-11-01发布 2018-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T18640一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T186402002《家畜日本血吸虫病诊断技术》 本标准与GB/T186402002相 比主要变化如下 -增加了日本血吸虫病、中间宿主、疫水等8条术语的定义 -增加了IHA和sEA两条缩略语的注解 -增加了家畜日本血吸虫病的临床诊断、剖检检查以及诊断结果的综合判定等内容 修订了GB/T18640一2002中粪便毛呦孵化法,补充了不同种类动物粪样的处理方法,增加了 尼龙筛兜直接淘洗法,将孵化温度由20C一25C修订为20C30C,孵化方法上增加了顶 管孵化法 修订了GB/T186402002中间接血凝试验(IHA)方法,规定了诊断液和标准血清的基本性 质,增加了血样采集方法,规范了操作方法,对判定标注进行了量化 -2002的编写格式.将各单项技术所需材料.试剂.仪器合并介绍,同时将 改变了GB/T18640- 各单项技术的结果判定合并到诊断结果项下进行综合判定 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位;农业科学院上海兽医研究所 本标准起草人;刘金明、林矫矫、石耀军、李浩 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T18640-2002
GB/T18640一2017 家畜日本血吸虫病诊断技术 范围 本标准规定了家畜(牛,羊、猪、犬和马属动物)日本血吸虫病临床诊断、间接血凝试验(IHA,病原 学诊断的方法和程序 本标准适用于家畜(牛、羊、猪犬和马属动物)日本血吸虫病的诊断、检疫、流行病学调查和防治效 果评价 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1 日本血吸虫病schistosomiasisjapomieau 由日本血吸虫感染人和动物所引起的疾病 2.2 中间宿主intermediate h0st 寄生虫在无性繁殖阶段所寄生的动物 2.3 疫水infeetedwater 被细菌、病毒等微生物以及寄生虫所污染的,具有传染性的水源 注:本标准中专指含有日本血吸虫尾的水 2.4 成虫adultworm 性发育成熟的虫体 2.5 虫卵eg 雌虫和雄虫交配后产的卵 2.6 Nracidium 毛勃myr 从吸虫虫卵中孵化出的幼虫 2.7 毛恸孵化miraeidiumhatchins 虫卵转变成毛蝴的过程 2.8 虫卵可溶性抗原solubleeantigenm 虫卵裂解后释放的溶解于生理盐水的抗原分子 2.9 ation 间接血凝试验imdirecthemugelutimi 以红细胞作为载体的间接凝集试验
GB/T18640一2017 缩略语 下列缩略语适用于本文件 IHA:间接血凝试验(indireethemagglutination SEA;日本血吸虫虫卵可溶性抗原(solubleeggantigen) 材料与试剂 4.1材料 竹筷,40目80目的铜筛滤杯、,260目的尼龙筛兜、500ml量杯,粪桶放大镜、显微镜,吸管、载玻 片 、盖玻片、取暖炉,水温计、盆、水缸、水桶,剪刀、闹钟、天平、脱脂棉,300mL500mL长颈平底烧瓶 或带顶管的塑料杯(500mL一1000mL)或500mL盐水瓶及与瓶口相配的10mL试管,家畜解剖刀 具、手术剪、止血钳、内径5mm~ 10mm的铜管或玻璃管以及与此相匹配的橡皮管,96孔V型微孔血 凝板(孔底角90'),移液器及吸头、定性滤纸等 4.2孵化用水 自来水、河水,池水、井水等,pH值6.8~7.2 处理方法如下;自来水,在盛器中存放8h以上;河 水,池水,井水等,加温至60C以上,冷却;混浊的水,每50L水加明矶3g5g,充分搅拌,澄清 4.3试剂 日本血吸虫病IHA诊断液为日本血吸虫虫卵可溶性抗原SEA致敏绵羊红细胞或人“O”型红细 胞,效价>64 标准阴性血清,IHA效价<4,标准阳性血清,IHA效价>1280 生理盐水 市售或由 指定单位提供 5 仪器 5.1组织捣碎机(或高速分散均质机) 5.2显微镜 5.3解剖镜 6 临床诊断 6.1.1诊断原则 根据血吸虫病流行病学特点和临床症状进行诊断 6.1.2流行特点 容易感染日本血吸虫的家畜主要有牛、羊、猪、犬以及马属动物 中间宿主为钉螺 流行区主要分 布于有钉螺孽生的长江以南十二个省(市、自治区);家畜因接触疫水而感染,大多数疫区的感染季节为 3月11月 6.1.3临床症状 6.1.3.1黄牛和奶牛主要临床症状 黄牛和奶牛主要临床症状如下:
GB/T18640一2017 急性型症状;多见于重度感染小牛,偶见于成年黄牛 典型症状为体温升高达40C以上,消 瘦,被毛粗乱,拉稀,便血,生长停滞,黄牛使役力下降,奶牛产奶量下降,母畜不孕或流产 特 别严重者肛门括约肌松弛,直肠外翻、疼痛,食欲不振,步态摇摆、久卧不起,呼吸缓慢,最后衰 竭而死亡 慢性型症状:消瘦,畏寒,被毛粗乱,拉稀,偶有便血,精神不振 轻度感染者可无症状 6.1.3.2绵羊和山羊主要临床症状 食欲减退,消瘦,腹泻,下痢,贫血,精神不振 严重者至衰竭而死亡 6.1.3.3水牛,马属动物,猪和犬主要临床症状 -般没有明显临床症状 重度感染者有腹泻,下痢,贫血,消瘦,被毛粗乱等症状 间接血凝试验(IHA 7.1血样采集 7.1.1血清:颈静脉或耳缘静脉采血1mL2mL,静置自然析出血清或待血液凝固后3000 r/min一 5000r/min离心10min,分离血清,4C保存 7.1.2血纸;在耳缘静脉采血5滴10滴,滴于定性滤纸,于阴凉处晾干,放在干净白纸中,2d内检测 也可保存于4C冰箱1个月内检测 7.2操作方法 7.2.1剪下1cm×1.2cm血纸,加200L生理盐水,浸泡10min,为血纸浸泡液 取100AL用生理盐 水作1:2稀释 7.2.2血清稀释;用生理盐水将血清作1;10和1:20稀释 7.2.3加样;取110和1;20稀释的血清或血纸浸泡液及1;2稀释的血纸浸泡液样品各25AL,加 人96孔V型微孔血凝板样品孔,每个稀释度样品加2孔 每块血凝板需设标准阳性血清、标准阴性血 清和生理盐水对照 7.2.4加诊断液:每孔加25AL诊断液,震荡混匀 7.2.5孵育:室温孵育1h~2h,然后观察并判定结果 7.3判定 7.3.1判定方法 判定方法如下: -红细胞完全不凝集,即全部下沉到孔底中央,形成周缘整齐、紧密红色圆点,为阴性(一) 红细胞25%以下凝集,即75%以上沉于孔底中央,形成较阴性小的红色圆点,周围有少量凝集 红细胞,为弱阳性(十); 红细胞约50%凝集,即约半数沉于孔底中央,形成更小红色圆点,周围有一层淡红色凝集红细 胞,为阳性(十十); -红细胞全部凝集,均匀地分散于孔底,形成淡红色薄层,为强阳性(十十十). 7.3.2判定标准 7.3.2.1试验成立条件:当阳性对照血清全部为“十+”以上阳性、阴性对照血清及生理盐水各孔均为
GB/T18640一2017 -”时,试验成立,否则试验不成立,需检查原因,重新试验 7.3.2.2在4个试验孔中有一孔出现“”以上阳性时,被检血清判为阳性 病原学诊断 8 8.1剖检检查 8.1.1虫体收集与观察 8.1.1.1家畜剖杀后,从速剥皮,仰卧,剖开胸腔和腹腔,去胸骨 分开左右肺,结扎下腔静脉 8.1.1.2找出胸主动脉,沿血管平行方向开口,从离心方向插人带橡皮管的玻璃接管或铜管,并用棉线 扎紧固定 橡皮管的另一端接自来水龙头 8.1.1.3分离肾脏,将进出肾脏的动、静脉结扎;同时将左右两侧的骼动脉和骼静脉结扎 8.1.1.4分离肝门静脉,向肝一端用棉线扎紧,离肝一端沿血管平行方向开口,插人带橡皮管的玻璃接 管并固定 橡皮管的另一端接40目铜筛 开启自来水并逐步加大水压 同时翻动肠和肠系膜以利于血管内水的流动 当橡皮管的另 8.1.1.5 端出水无血色时,关闭龙头 8.1.1.6检查铜筛内是否有虫体 如无虫体,应仔细检查肠系膜静脉和直肠痔静脉是否有虫体 8.1.1.7将收集到的虫体置于解剖镜下观察 成虫形态特征为;雌雄异体，一般呈合抱状态;口、腹吸盘 位于虫体前端;雄虫大小为(10mmm22mm×(0.50mm0.55mm),乳白色,腹吸盘以下虫体由两侧 向腹面卷曲,呈圆柱形;雌虫圆柱形,前细后粗,大小为(15mm一26mm)×(0.14mm0.28mm n),肠管 内含较多的红细胞消化后残留的物质而呈灰褐色 8.1.2肝脏组织压片检查 8.1.2.1 取出肝脏,肉眼观察 如发现肝脏表面白色结节,用眼科剪剪取结节,置载玻片上 每片可置 4个~5个结节 8.1.2.2取另一载玻片置结节之上,压紧,用胶布或橡皮筋固定 8.1.2.3 将压好的载玻片置于低倍显微镜(0信或40信物镜>下检查 虫卵形态特征为谈黄色,圆 形,卵壳均匀,无小卵盖,卵壳一侧有一小棘,大小为(74m~106wm)X(551 1一80m). 丛m 8.1.3肝脏虫卵毛勃孵化检查 8.1.3.1取肝组织10g一20g,剪碎,加人20mL 孵化用水,用组织捣碎机(或高速分散均质机 min2min 5000r/min~10000r/min粉碎1 8.1.3.2加人100mL孵化用水,混匀,均匀分成4份,分别进行毛恸孵化 8.1.3.3孵化条件及毛勃观察同8.2.3和8.,2.4 8.2粪便毛蝴孵化法 8.2.1粪样采集 8.2.1.1采集新排出的粪便或直接从直肠中采取 8.2.1.2采粪量;牛、马属动物200g,猪100g,羊和犬粪40g,每份粪样需附上填好的送粪卡,送粪卡记 录内容包括.采集地点、饲养员或畜主姓名,畜别、畜名或畜号、性别年龄、娅娠状况和采粪日期 8.2.1.3于采粪当天送到检验室
GB/T18640一2017 8.2.2粪样处理 8.2.2.1将每头家畜的粪样分3份,进行平行检测 每份检测粪量为:牛和马属动物50g,猪20g,羊、 犬10g 8.2.2.2牛,猪和马属动物粪样,根据实际情况选用下列方法中的一种处理: 将粪样装人尼龙筛兜中,用自来水在搅拌条件下(用竹筷)淘洗至滤液清澈,沥干 将粪样倒人铜筛中,铜筛置量杯上部,加孵化用水,淹没粪样,用竹筷搅拌至稀浆状,捞出铜筛 沥干后再次浸人,搅拌,如此3次 将量杯中细渣及粪水一并倒人尼龙兜中,用水冲淘洗至滤 液清澈 将粪样倒人铜筛中,铜筛置塑料杯(带顶管塑料杯去盖和顶管)上部,加孵化用水淹没粪样,用 竹筷搅拌至稀浆状,捞出铜筛,沥干后再次浸人,搅拌，如此3次 将塑料杯中粪样沉淀 15mim左右,倒去上层清夜的三分之二 将粪样置于量杯或带顶管塑料杯中,加少量孵化用水搅匀,再加满孵化用水,沉淀15mim左 右,倒去上层清液的三分之一至二分之一 8.2.2.3羊粪;无需处理 8.2.2.4犬粪:将粪样置于铜筛滤杯,铜筛滤杯置于尼龙筛兜之上,用自来水冲淋并用竹筷搅拌至滤液 清澈 8.2.3孵化 选用下列方法之一进行孵化,孵化条件为20C30,光照(日光或灯光) 长颈平底烧瓶孵化法;将上述处理后粪样装人长颈平底烧瓶,加25左右孵化用水至瓶口下 4cmm一5em处,在水面加1cmm~2em厚的松软脱脂棉,补加孵化用水至高出脱脂棉约3em. 塑料杯顶管孵化法;将上述处理后粪样装人专用塑料杯,加孵化用水至杯口 盖上中间有孔的 塑料盖,加满孵化用水 将顶管注孵化用水至管口1cm~2em,管口蒙一层薄薄的脱脂棉,倒 插人塑料盖孔中 顶管孵化法;将上述处理后粪样装人500ml盐水瓶,加满25C左右孵化用水,将试管开口端 外围缠绕一定胶布(能插人盐水瓶瓶口且不漏水),试管内加孵化用水至管口1cm2cm,管 口蒙一层薄薄的脱脂棉,迅速倒插人盐水瓶瓶口 8.2.4毛恸观察 8.2.4.1分别在孵育1h,3h和5h,进行观察 观察时,将孵化杯(瓶)向着光源并衬以黑色背景 每 个样品每次连续观察2min以上 如有怀疑,可用滴管将毛勃吸出,置显微镜进一步观察 8.2.4.2血吸虫毛肉眼观察特征;为针尖大小、灰白色、梭形,折光性强,在近水面作水平或斜向直线 折返运动 8.2.4.3血吸虫毛蝴显微观察特征;前部宽,中间有个顶突,两侧对称,后渐窄,周身有纤毛 诊断结果 9 9.1疑似 有流行病学接触史的动物,出现6.1.2所述临床症状或间接血凝试验(IHA)呈阳性 9.2确诊 活畜:粪便毛勃孵化发现8.2.4.2和8.2.4.3所述特征的毛劫 依据观察到的毛劫数判定感染强度，
GB/T18640一2017 1 个5个毛恸为十,6个10个毛恸为十十,11个20个毛蝴为十十十,21个以上毛恸为十十十十 剖检;发现8.1.1.7所述特征的虫体,或肝组织压片发现8.1.2.3所述特征的虫卵,或肝脏虫卵毛蝴 孵化发现8.2.4.2和8.2.4.3所述特征的毛呦 9.3阴性 活畜:粪便毛蜴孵化未发现8.2.4.2和8.2.4.3所述特征的毛蜴 剖检;未发现8.1.1.7所述特征的虫体,肝组织压片未发现8.1.2.3所述特征的虫卵,肝脏虫卵毛勃 孵化未发现8.2.4.2和8.2.4.3所述特征的毛呦
GB/T18640一2017 考文献 参 [1]冯静兰,徐百万,等.动物血吸虫病防治手册[M].北京:农业科技出版社,1998 [[2]徐百万,林娇娇,等 农业综合治理防控血吸虫病技术导则[M].北京:农业科技出版 社,2007. [3]韩明毅 环卵沉淀反应血纸法诊断耕牛日本血吸虫病的试验[J].兽医杂志,1989,15 03):29-31

家畜日本血吸虫病诊断技术GB/T18640-2017

日本血吸虫病是由日本血吸虫寄生于人和动物体内引起的一种慢性寄生虫病。家畜日本血吸虫病是影响农业发展的一个重要问题。因此，对于家畜日本血吸虫病的早期诊断显得尤为重要。

家畜日本血吸虫病的诊断技术

目前，对于家畜日本血吸虫病的诊断，主要采用以下方法：

• 直接法检测日本血吸虫卵
• 间接荧光抗体法检测特异抗体
• PCR技术检测日本血吸虫DNA
• ELISA法检测特异抗体

以上诊断方法各有优缺点，但是其中以PCR技术和间接荧光抗体法最为常用。值得注意的是，不同的动物类型其感染日本血吸虫的症状和病原学表现也不尽相同，因此需要根据实际情况选择合适的诊断方法。

GB/T18640-2017标准介绍

GB/T18640-2017《家畜日本血吸虫病诊断技术》，是由中国农业部发布的标准，主要适用于家畜日本血吸虫病的诊断工作。该标准规定了直接法、间接荧光抗体法、ELISA法和PCR技术等四种方法的应用范围、原理、操作步骤、结果判定、评价等内容。

通过采用GB/T18640-2017标准进行家畜日本血吸虫病的诊断，可以保证诊断结果的准确性和可靠性。因此，在家畜日本血吸虫病的防控工作中，使用GB/T18640-2017标准进行诊断具有重要意义。

结论

家畜日本血吸虫病的诊断技术是日益完善的，随着新技术的不断出现，将会有更加高效、准确和便捷的诊断方法应用于实际工作中。同时，使用标准进行诊断也是保证诊断结果可靠性的重要手段。

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化学农药环境安全评价试验准则第20部分：家畜短期饲喂毒性试验

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GB/T18640-2017

家畜日本血吸虫病诊断技术

2022/8/29 21:52:14 现行