国家标准 GB/T34738一2017 蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法 Methodofthereal-timePCRforthedetectionofhoney beessacbr00ddsease 2017-11-01发布 2018-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/34738一2017 蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法范围本标准规定了蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法本标准适用于蜜蜂及其幼虫中囊状幼虫病的检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T18088出人境动物检疫采样试剂和材料除非另有规定,仅使用分析纯试剂所有试剂均用无RNA酶污染的容器用焦碳酸二乙酯水处理后高压灭菌)分装 3.1水,GB/T6682,三级 3.2蜜蜂囊状幼虫病毒 3.3引物和探针,上游引物F1(10pmol/pL);5'-AAGTTGGAGGCGcGYATTTG-3',下游引物 R1(10pmol/pL);5'-CAAATGTCTTCTTACDAGAAGYAAGGATTG3',探针P1(5pmol/AL): 5'-FAM-CGGAGTGGAAAGAT-TAMRA-3’ 3.4磷酸盐缓冲盐水,配制方法见A.1 3.5总RNA抽提试剂 3.6氯仿 3.7异丙醇 3.875%乙醉注;用新开启的无水乙醉和焦碳酸二乙酯水配制 3.9焦碳酸二乙酯处理的水 3.10反转录酶 3.11RNA酶抑制剂(40U/L). 3.125×反转录缓冲液 3.1310×PCR反应缓冲液(含镁离子. 3.14DNA聚合酶(5U/AL) 3.15三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNPTs每种浓度均为10mmol/L. 器材 4.1荧光定量PCR扩增仪
GB/T34738一2017 4.2台式冷冻高速离心机(离心速度12000r/min以上) 43微量可调移液器(100AlL~1000ML,20ML200ML2AL20L,0.5L10L)及配套带滤芯吸头 4.4研钵 4.5涡旋震荡器 4.6恒温水浴锅 4.7离心管(1.5nmL) 4.8P(R管 5 现场检验 5.1临床特征开箱,提蜂脾查看,出现下列病理变化特征之一者,可判为疑似: a)脾面上会出现卵小幼虫、大幼虫、封盖子排列不规则的现象,即所谓“花子脾”现象 b) 病害严重时,病虫多,工蜂清理不及,可以在脾面上见到病虫巢房被工蜂咬开,巢房盖有大量不规则孔洞,露出患病幼虫上翘的头部呈“尖头”状,其头部有大量的透明液体聚积用银子小心夹住幼虫头部将其提出,可见虫体末端明显的囊状袋,虫体苍白色、无味,无黏性，参见附录B 5.2鉴别诊断在临床诊断时应注意将本病与美洲幼虫腐臭病相区别,其鉴别诊断要点参见附录B o 实验室诊断 6.1样品采集 6.1.1按GB/T18088要求,采集疑似感染的蜜蜂幼虫20只30只,也可采集以下样品蜂巢内病变区域成蜂20只一30只,或 a b不小于20cm的蜂房,或 c 取临近蜂巢的蜂蜜、花粉及小幼虫和底部的王浆等蜜蜂食物(30g一50g) 6.1.2采集的样品分别装人无菌的容器中,加人5倍~10倍样品体积的RNA保存液,尽快转移到液氮中保存,供检测用 6.2样品处理 6.2.1在洁净,灭菌并烘干的研钵内,加人蜜蜂3只5只(或幼虫3只一5只,或蜂房10只左右,或瘙蜂食物10g左右),同时加人PBs(10mL)和RNA酶抑制剂(终浓度为100U/mL),混匀并充分研磨 6.2.24C、3000r/min离心15min 6.2.3取上清液,转人无菌离心管(1.5mL)中,编号备用 6.3荧光RI-PCR 6.3.1阳性对照与阴性对照阴、阳性样品的制备方法见附录C
GB/34738一2017 6.3.2RNA提取 6.3.2.1取灭菌的1.5mL离心管,编号 .3.2.2每管加人600L总RNA抽提试剂裂解液,分别加人被检样本、阴性对照、阳性对照备 200L，一份样本换用一个吸头,再加人200L氧仿,涡旋震荡器上振荡混匀5(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可以用手颠倒混匀. 6.3.2.34C、12000r/min离心15min. 6.3.2.4取上清液转移至灭菌的1.5ml离心管中,编号,加人等量的异丙醇(一20C预冷),颠倒混匀 6.3.2.54C,12000r/min离心15nmin,离心管开口朝向离心机转轴方向 6.3.2.6小心倒去上清,加人6004L焦碳酸二乙酯处理水配制的75%乙醇,颠倒洗涤 6.3.2.74C,12000r/min离心10min. 6.3.2.8小心倒去上清,离心管倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干). 6.3.2.9立即进行cDNA的合成或一70C保存备用 6.3.3eDNA合成注本条所有操作在冰盒上进行在6.3.2.8的离心管中依次加人随机引物2L,焦碳酸二乙酯处理水12L;轻微振荡,瞬时 6.3.3.1 离心 6.3.3.270C作用10min,冰浴2min 6.3.3.33000r/min离心1nmin 6.3.3.4在超净台内,向离心管中依次加人5×反转录酶缓冲液4AL，三磷酸脱氧核糖核背酸lAl RNA酶抑制剂0.5AL,反转录酶0.5AlL,瞬时离心 6.3.3.542作用1h,70C作用15min,冰浴3min,瞬时离心,产物为cDNA,立即进行PCR扩增或 -20C保存备用 6.3.4PCR反应 6.341在R管中,依次加人以下试剂.10xR缓冲液25Al,三睛酿脱氧核糖核苷酸1L.,DNA 聚合酶0.5AL、,引物F11A、引物F21l,探针lL,cDNA2AL,焦碳酸二乙酯处理水16L;盖紧管盖,500r/min离心30s 6.3.4.2离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内,记录样本摆放顺序 6.3.4.3设置循环条件;50C2nmin,1个循环;95C10min,1个循环;95C15s,55C1min,40个循环,退火延伸时收集荧光 6.4结果判定 6.4.1结果分析条件设定直接读取检测结果值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以囤值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 6.4.2实验成立的条件阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，且阳性对照的Ct值<28.0,并出现典型的扩增曲线结果判定 6.43.1阴性:符合6.4.2的条件,无Ct值并且无扩增曲线,，结果判为阴性;表示样品中无蜜蜂囊状幼虫
GB/T34738一2017 病病毒 6.4.3.2阳性;符合6.4.2的条件,Ct值<30.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在蜜蜂囊状幼虫病病毒 6.4.3.3有效原则:Ct值>30.0的样本建议重做重做结果无Ct值者为阴性,否则为阳性综合判定符合5.1的临床特征,且6.3荧光RT-PCR检测结果出现6.4.3的阳性结果,可确诊为蜜蜂囊状幼虫病阳性
GB/34738?2017 ? A 淶?? ? A.1λ? A.1.10.2mol/L?? (NaH,POH.O)27.6g,?,?1000mL A.1.20.2mol/L?? ?(Na;HPO7H.O)53.6g,??(Na,HPO12H.O)71.6? ?(Na,HPO2H.o)35.6g??,?1000mL A.1.30.01mol/Lp7.2λ? 0.2mol/??14mL,0.2mol/1??36mL,?(NaCI) 8.5???1000mL,121C,15min??,??ù?ù? 10000U/ml A.2?? ó?0.1%??,?ù?,115C,20min?,?á
GB/T34738?2017 ? B ??) ???没 B.1???没 discase)?,?м????没 ???没(Sacbrood Sacbroodbeevirus,SBV)??泦?,?з??? B.2? ????没,??Ilauiridae,?Iflairus, RNA,?28nm,?,?Ρ B.3?? sBV??????1?2С??,5~6??γ ???,?????,???SBV?12С??, ??????д?,??????? ??,????,?,?°?,??,γ???, ???????,???,??г???,?B.1? ?B.1???没?" B.4 ??????港?港???, ????????,??没?,??? ,??,??(B.1)
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GB/T34738一2017 附录 C 规范性附录蜜蜂囊状幼虫病毒阳性样品和阴性样品 C.1 阳性样品制备取蜜蜂囊状幼虫病毒标准毒株按说明书稀释,按体积1:4加人总RNA抽提试剂灭活,剧烈震荡 1nmin，再冰浴10min,用10倍体积的磷酸盐缓冲盐水稀释,0.5mL/管分装液氮保存备用 C.2 阴性样品制备取健康蜜蜂幼虫,按体积1:4加人总RNA抽提试剂灭活,剧烈震荡1min,再冰浴10min,用 10倍体积的磷酸盐缓冲盐水稀释,0.5mL/管分装,液氮保存备用
GB/34738?2017 ο [1],?.??к[M].;?,2008

蜜蜂囊状幼虫病荧光PCR检测方法GB/T34738-2017

蜜蜂囊状幼虫病是由囊状幼虫病毒感染蜜蜂幼虫引起的一种传染病，其主要症状是蜜蜂幼虫体内出现囊状幼虫。为了及时发现和控制该疾病，我们可以采用荧光PCR检测方法进行检测，该方法已被国家标准GB/T34738-2017正式认证，以下是具体步骤：

1.样本处理

首先，我们需要收集蜂群中可能感染囊状幼虫病的幼虫或成虫组织样本。将样本切碎并加入适量的缓冲液进行处理，使其病毒核酸释放出来。

2.荧光PCR反应体系准备

接着，我们需要在无菌条件下准备荧光PCR反应体系。其中，反应体系包括引物、荧光探针、Taq DNA聚合酶、缓冲液等。具体的反应体系比例需根据不同的实验室条件和试剂盒要求进行调整。

3.荧光PCR反应程序设定

确保反应体系已经按照要求配置好后，我们需要设定荧光PCR反应程序，这包括了反应温度和时间等参数的设定。荧光PCR反应程序的设定必须依据具体试剂盒说明书进行操作。

4.荧光PCR检测操作

最后，我们可以进行荧光PCR检测操作。将处理好的样本加入准备好的荧光PCR体系中，进行PCR扩增和荧光检测。如果样本中存在囊状幼虫病病毒核酸，则会在荧光信号检测仪器中显示阳性结果。

综上所述，使用荧光PCR检测方法可以高效、准确地检测蜜蜂囊状幼虫病，有助于及时发现和控制该疾病。需要注意的是，在进行荧光PCR检测前，必须按照国家标准GB/T34738-2017的要求进行处理和操作，以保证检测结果的准确性。