猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法

猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T27540一2011 猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法 Methodofthereal-timeRT-PCRforthedeteetionof classicalswinefevervirus 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27540一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标推起草单位;兽医药品监察所 本标准主要起草人:王琴、王泰健、徐璐、范学政、刘俊、蒋春燕、赵启祖、宁宜宝、邹兴启
GB/T27540一2011 猪瘟病毒实时荧光RI-PCR检测方法 范围 本标准规定了猪瘟病毒(Classicealswinefevervirus,CsFV)实时荧光RT-PCR检测方法 本标准适用于猪痛的诊断和监测,适用于猪活体及其脏器、血液、排泄物和细胞培养物中CSFV核 酸的检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 农业部公告第302号兽医实验室生物安全技术管理规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CSFV;猪瘟病毒(Classicalswinefevervirus) Ct值;达到闵值的循环数(eyclethreshold DEPC;焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate) HSsTaq酶;热启动TaqDNA聚合酶(HsTaqDNApolymerasey RNA:核糖核酸(ribonucleicacid 荧光RT-PCR:荧光逆转录聚合酶链式反应realtimeluorescentquantitativereverse transcriptionpolymerasechainreaction) 试剂和材料 除另有说明,所用试剂均为分析纯;所有试剂均用无RNA酶的容器分装 TrizolRNA抽提试剂,外观为粉红色,分装至棕色瓶中,于4C8C保存 4.2氯仿;4C预冷 4.3异丙醇:4笔预冷 4.475%乙醇;用新开启的无水乙醇和DEPC水配制,一20C预冷 4.5DEPC水:去离子水中加人0.1%DEPC,37C作用1h.(121士2),高压灭菌15min 4.6RNA酶抑制剂(30U/aL 10×PCRbuffer10mmol/LpH8.3Tris-HCI,50mmol/LKCl,1.5mmol/LMgCl 4.8dNTP(2.5mmol/L). 4.9用于RT-PCR反应的引物浓度为10mol/L,探针浓度为5umol/L,其序列如下 上游引物F:5-TACAGGACAGTCGTCAGTAGTTCGA-3
GB/T27540一2011 下游引物R:5-CCGCTAGGGTTAAGGTGTGTCT-3 探针P;5-FAM-CcCACcTCGAGATGcTATGTGGAcGA-TAMRA-3 4.10 反转录酶,Superserip"反转录酶(2o0U/AL .11DNA聚合酶:HsTaqDNA聚合酶(5U/L) b 4.12阴性对照:DEPC水 4.13强阳性对照非感染体外转录RNA(4200pg/L). 4 弱阳性对照;非感染体外转录RNA42pg/aL) 14 器材和设备 5 高速台式冷冻离心机:最大离心力12000g以上 5.2冰箱 5.3荧光PCR检测仪 55 组织匀浆器 4 5.5微量移液器和吸头 6 5. 离心管 样品的采集 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套,样本不得交叉污染 6.2采样工具 min10min， 扁桃体采样器:鼻捻子、开口器和采样枪 使用前均应用3%氢氧化钠溶液浸泡消毒5 经清水冲洗 灭菌牙签和0.5ml或1.5ml离心管经(121士2)C,高压灭菌15min;剪、摄经160C干烤2h 6. 3 采样方法 6.3.1活体样品 固定活猪的上唇,用开口器打开口腔,用采样枪采取扁桃体样品,用灭菌牙签挑至0.5ml或1.5ml 离心管并作标记,编号,送实验室 取待检样品,按1:5倍体积加人DEPC水,于研钵或组织匀浆器中 充分研磨,3000离心15min,取上清液转人离心管中编号备用 6.3.2内脏样品 采取病死猪各种脏器(淋巴结、胰脏、脾脏、回肠、肝脏和肾脏)装人一次性塑料袋或其他灭菌容器， 编号,送实验室 取50mg一100mg待检样品,按1;5倍体积加人DEPC水,于研钵或组织匀浆器中 充分研磨,3000g离心15min,取上清液转人离心管中编号备用 6.3.34%EDTA抗凝血 用无菌注射器直接全血,注人含1/104%EDTA溶液的无菌容器中,充分混匀后编号备用
GB/T27540一2011 6.3.4排泄物 挑取少许粪便样本于离心管中,加人适量生理盐水,振荡混匀,室温3000g离心15min,取上清液 转人离心管中编号备用 其余液体排泄物直接转人离心管编号备用 6.3.5细胞培养物 细胞培养物冻融3次,转人离心管中编号备用 存放与运送 采集或处理的样品在28C条件下保存应不超过24h;若需长期保存,应放置一70C冰箱,但 应避免反复冻融(冻融不超过3次) 采集的样品密封后,采用保温壶或保温桶加冰密封,在6h~8h 之内运送到实验室 按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的生物安全标识 实时荧光RT-PCR检测 7.1核酸提取 在样本制备区进行 7.1.1取n个灭菌的1.5ml离心管,其中n为待检样品数×重复数3十阳性管数弱阳性管数十阴 性管数,对每个离心管进行编号 每管加人500LTizol,分别加人被检样品、阳性对照、弱阳性对照和阴性对照各200L(由于 7.1.2 阳性和弱阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染),颠倒10次混匀,静置5min;再加 人200L氯仿.混匀器上振荡混匀5s(也可以用手反复颠倒混匀) 于4C、12000g离心15min 7.1.3取与7.I.I中相同数量灭菌的1.百mL离心管,加人00L异两醉(4C预冷),对每个管进行 编号 取7.1.2中离心后的上清液约500AlL(注意不要吸出中间层)转移至相应的管中,颠倒混匀. 20笔静置30min. 于4C、12000g离心15min(离心管开口保持离心机转轴方向放置),弃上清,倒置于吸水纸 上,沾干液体,加人600AlL75%乙醇,颠倒洗涤 7.1.5于4C、12000g离心10min(离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),弃上清,倒置于吸水纸 上,沾干液体(不同样品应在吸水纸不同地方沾干) 7.1.64000g离心10s离心管开口保持朝离心机转轴方向放置),用微量加样器小心将残余液体吸 干,室温干燥3min10min 加人38L经DEPC处理的水和2LRNA酶抑制剂,轻柔混匀溶解管壁上的RNA.冰上保 7.1.7 存备用 提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增;若需长期保存应放置一70C冰箱 7.2荧光RT-PCR扩增体系的配制 在反应混合物配制区进行 设PCR反应数为n,其中n为待检样品数×重复数3十阳性管数十弱阳性管数十阴性管数,每个样 本测试反应体系配制见表1 配制完毕的反应液分装时应尽量避免产生气泡.上机前注意检查各反应 管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器
GB/27540一2011 表1每个样品反应体系配制表 体系组分 用量 终浓度 10×PCRBuffer 5.0 dNTPs 1.5 0.075anmol/L 猪瘟病毒RT-PCR反应液 上游引物F 3.0L 0,64mol/L 下游引物R 0.64mol/1 3.0 探针溶液 探针P 1.5L 0.154mol/L Superscript川反转录酶 0.3 " 2U/ 反应酶 HsTaqDNA聚合酶 0.05U/nL 0.5nl 总 量 14.8L 7.3加样 在样本处理区进行 在各设定的荧光RT-PCR管中分别加人本标准7.1.7中制备的35.2ALRNA溶液,盖紧管盖后 500r/min离心30s 放人荧光PCR检测仪内 7.4荧光RT-PCR扩增 在检测区进行 将本标准7.3中离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内,记录样品摆放顺序 循环条件设置 a)反转录50C/20min; b预变性94C/4min: 88C,8s.,60C,35s,40个循环 荧光收集设置在此阶段每次循环的退火延伸时进行 7.5结果判定 7.5.1阔值设定 试验检测结束后,根据收集的荧光曲线和C值直接读取检测结果,Ct值为每个反应管内的荧光信 号达到设定的闵值时所经历的循环数 闵值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阀值线刚好超过 正常阴性样品扩增曲线的最高点为准 7.5.2 质控标准 7.5.2.1阴性对照无C值,且无典型扩增曲线 强阳性对照的C值应<27.0并出现典型的扩增曲线;弱阳性对照的c值应在34.0左右并 7.5.2.2 出现典型的扩增曲线 否则,此次试验视为无效 7.5.3结果描述及判定 7.5.3.1 阴性 无C值并且无典型的扩增曲线,表示样品中无CSFV核酸
GB/T27540一2011 7.5.3.2阳性 Ct值<34.0,且出现典型的扩增曲线,表示样品中存在CSFV核酸 7.5.3.3可疑 Ct值>34.0,且出现典型扩增曲线的样本建议重复试验,重复试验结果出现Ct值<34.0和典型扩 增曲线者为阳性,否则为阴性

猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T27540-2011

随着畜牧业的不断发展，猪瘟病毒等病毒的传播也成为一个不容忽视的问题。因此，开发一种高效、准确的检测方法就显得尤为重要。

猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法是一种目前比较先进的检测方法，其原理是通过特异性引物扩增病毒核酸，并利用荧光探针进行实时检测。该方法具有快速、准确、灵敏度高、特异性好等优点，已经被广泛应用于猪瘟病毒的检测中。

GB/T27540-2011是国家标准，规定了猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法的具体操作步骤、试剂盒的要求等内容。该标准对于确保检测结果的准确性和可靠性非常重要。

猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T27540-2011主要包括以下几个步骤：

• 提取样品中的病毒核酸；
• 准备PCR反应体系；
• 进行实时PCR检测；
• 分析检测结果。

在实际操作中，还需要注意一些细节问题。比如，在提取样品中的病毒核酸时，应该采用适当的方法，并控制好提取量；在准备PCR反应体系时，应该按照标准要求配制试剂盒，并避免引物和探针的污染；在进行实时PCR检测时，应该严格按照程序操作，避免空白对照、模板对照等出现假阳性或假阴性。

总之，猪瘟病毒实时荧光RT-PCR检测方法GB/T27540-2011是一种非常先进的检测方法，可以用于猪瘟病毒等病毒的快速、准确检测。在实际操作中，需要严格遵守标准要求，并注意一些细节问题，以确保检测结果的准确性和可靠性。

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