猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法

猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法

国家标准 GB/T35901一2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 Real-timeCRmethodfordetetionofporeinecireovirusype2 2018-02-06发布 2018-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35901一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标准起草单位:上海出人境检验检疫局、农业科学院上海兽医研究所、中华 人民共和国深圳出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院、湖南圣湘生物科技有限公司 本标准主要起草人:张强、李健、熊炜、童光志、赵和平、花群义、李树清、杨忠苹、李国新、王巧全 王艳、林颖峥、蔡开妹、喻正军、吴绍强、林祥梅
GB/35901一2018 猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法 范围 本标准规定了猪圆环病毒2型荧光PCR检测的操作方法 本标准适用于猪圆环病毒2型核酸检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T25172猪常温精液生产与保存技术规范 缩略语 下列缩略语适用于本文件 荧光PCR;荧光聚合酶链式反应(realtimepolymerasechainreaction) C值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阔值时所经历的循环数eyclethreshold DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid Taq酶:TaqDNA聚合酶(TaqDNApolymerase TE缓冲液:Tris-EDTA缓冲液(Tris-EDTAbuffer PCV;猪圆环病毒(poreinecircovirus 仪器设备 4.1荧光PCR检测仪 4.2高速台式冷冻离心机可控温至4C、离心速度可达12000r/min以上 4.3普通冰箱;2C8C 4.4普通冰柜;一20C以下 4.5超低温冰箱:可控温至一70C以下 4.6微量移液器;0.2Al2AL、1AL~10L,10ML100AL、,20L~200AL、100ML1000AL,并 配备与移液器匹配的吸头 高压灭菌锅 4.7 5 耗材 5.11.5ml离心管 5.20.2mlPCR薄壁管或八联管
GB/T35901一2018 6 试剂 6.1除非另有说明,在检测中使用的试剂均为分析纯,实验室用水应符合GB/T6682的要求 6.2DNAzol,商品化DNA抽提试剂,于2C8C保存 6.3无水乙醇，-20C预冷 6.475%乙醇,无水乙醇和双蒸水配制-20笔预冷 6.58mmol/LNaoH溶液,配制见附录A 6.6PBS缓冲液(0.01nmol/L.PBs，pH7.4),配制见附录A 6.7Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液;Taq酶浓度为5U/aL,Taq酶反应缓冲液中Mg浓度 为15mmol/1 6.8dNTPs;含dATP、dGTPdCTP,dTTP各10mmol/L,一20C保存,避免反复冻融 6.9引物和TaqMan探针,其序列见附录B. 6.10猪圆环病毒2型阳性对照样品和阴性对照样品:阳性对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒， -20C保存备用;阴性对照可采用健康猪的组织材料. 6.11内参照质粒;带有人P珠蛋白基因的质粒 样品采集和处理 7.1采样工具 7.1.1手术刀,剪刀锻子,经160干热灭菌2h， 7.1.2组织研磨器或者研钵,经160C干热灭菌2h 7.1.3真空采血管 7.2样品采集 7.2.1血清样品采集:用无菌注射器抽取受检猪静脉血不少于5ml,置于无菌离心管内,室温或者 37倾斜放置自然凝集20min30min,2000r/min一3000r/min离心10min,吸取上清液到新的 离心管内备用 7.2.2粪便样品采集;取猪新鲜粪便1g,装人15mL灭菌离心管中,加人5mPES,混匀 7.2.3精液样品采集;按照GB/T25172的方法采集和保存精液 7.2.4组织样品采集:采取病死猪(包括流产的死胎)或扑杀猪主要脏器(淋巴结、脾脏、肺脏、肾脏和肝 脏)装人灭菌15ml离心管中,编号,送实验室 7.2.5细胞培养物;细胞培养物反复冻融3次,第3次解冻后,将细胞培养物置于1.5ml无DNA酶的 灭菌离心管内,编号备用 7.3样品保存和运输 上述采集的样品可立即用于检测 不能立即检测的样品,在2C一8C下保存应不超过24h -20C士5C可以稳定保存3个月,一70C以下可长期保存 样品运送采用低温保存进行运输,并在 规定温度下的保存期内送达 样品处理 7 .4 7.4.1血清和精液样品无需进行前处理,直接用于核酸提取 7.4.2粪便样品:3000r/min离心101 nmin,取上清液,转人1.5mL离心管中,用于后续的核酸提取
GB/35901一2018 7.4.3组织样品;取1g解冻的组织,剪碎,加人2mLPBS进行研磨,制备组织匀浆,8000r/min离心 5min,取上清用于后续的核酸提取 ,4C离心10min,取上清用于后续的核酸提取 7.4.4细胞培养物:4000r r/min， 荧光PCR操作程序 8.1DNA抽提 8.1.1在核酸提取区操作 DA抽提使用DNAnl试剂提取,也可以使用等效商品化试剂盒提取 8.1.2取n个灭菌的1.5ml离心管,其中n为待检样品数十阳性对照十阴性对照,对每个离心管进行 编号 8.1.3每管先加人800LDNAzol,再分别加人被检样品、阳性对照、阴性对照各200L,颠倒10次混 匀，4C或室温10000r/min离心10min 8.1.4取9004L上清,置新的1.5mL灭菌离心管中,加人500L无水乙醇,混匀,室温放置3min; 4C或室温10000r/min离心5nmin 8.1.5弃上清沿管壁缓缓加人0.8ml. 1mL.75%乙醇,颠倒3次6次混匀,4C10000r/min离 心5min 反复洗涤两次后,将离心管倒扣于吸水纸上,自然晾干或用移液器移去残液 8.1.6用50AL8mmol/几NaOH溶液溶解沉淀,DNA在2C8C冰箱可保存两个月，-20C冰柜 可稳定保存两年 8.2荧光PCR检测 8.2.1反应体系的配制 在试剂配制区进行 设实时荧光RCR反应管数为n,"为待检样品数十阳性管数十阴性管数,每 个反应的体系见附录C,为了避免移液器取样损失,建议按从十1个反应进行配制 配制反应液在冰盒 中进行 8.2.2反应液的分装 将8.2.1中配制的荧光PCR反应液充分混匀,按照每管39.8AL分装于0.2mL透明PCR管内,将 PCR管置于96孔板上,按顺序加样并做好标识,转移至核酸提取区 8.2.3加样 在核酸提取区进行 在每个PCR反应管内加人0.2L的内参照质粒,并分别加人8.1制备的核酸 10ALDNA溶液,盖上盖子,500r/min~1000r/min离心30s 转移至检测区 8.2.4 上机检测 荧光通道设置 8.2.4.1 在检测区进行 将8.2.3中离心后的PCR管放人荧光PCR检测仪内,设置探针:5'选择FAM和 HEX两个荧光通道,3'均选择无(None) 8.2.4.2循环条件设置与检测 第一阶段,预反应50C/2min: 第二阶段,预变性95C/2min; 第三阶段,变性95C/15s,退火、延伸,荧光采集60C/30s,40个循环;
GB/T35901一2018 第四阶段,冷却25/10s 检测结束后,保存结果,根据收集的荧光曲线和C值判定结果 o 结果判定 9.1 闻值设定 阔值设定原则根据仪器噪声情况进行调整,以阔值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准 9.2质量控制 9.2.1PCV-2阴性对照;FAM通道无报告C值或无典型的S型扩增曲线,HEX通道C值<36且扩 增曲线为典型的S型; 9.2.2PCV-2阳性对照;FAM通道C值<30,HIEX通道C值<36,扩增曲线为典型的S型 9.2.39.2.1和9.2.2要求需在同一次实验中同时满足.否则,本次实验无效,需重新进行 9.3结果描述及判定 9.3.1被检样本检测结果中FAM通道c值<38,且扩增曲线为典型的s曲线,报告为PCV-2核酸阳 36 则该样本的检测结果无效,应查找并排除原因,并对此样本进行重复实验
GB/35901一2018 附 录 A 规范性附录 溶液配制 A.18mmol/LNaoH溶液 称量0.32gNaOH,溶解到1000mL去离子水中,混匀,分装,常温保存 磷酸盐缓冲液(0.01mol/L，PBs,p7.4 用800mL燕馏水溶解8gNaCl,0.2gKCI,1.44gNaHPO和0.24gKH,PO 用HCl调节溶 液的pH值至7.4,加水至1L 分装后经121C、15nmin高压灭菌后备用
GB/T35901一2018 附 录 B 规范性附录) 引物和探针 引物、探针的名称和序列见表B,1 表B.1引物、探针的名称与序列 名称 序列 5'-GGiAGTcTGGTGACcGTTGC-3' PCV2-qF PCV2-qR 5'-CCAATCACGCTTCTGCATTTT-3 rm 1-3" PV2- P(探针 5'-FAM-CCGTA(T TcAAAAGTTcAGccA-BHQ1 ICF 5'-AAGTGcTcGGTGccTTTAGTG3" ICR 5'-(GTCCCATAGACTCACCCTGAAGT-3" IcCP(探针) 5'-HEX-CCTGGCTCACCTGGACAACCTCAAGBHQ1-3 注引物和探针可由生物公司合成,用TE溶液溶解并稀释至100mol/1储存浓度，-20C保存备用;根据需要配 制成10pmol/L工作液，-20丫保存供检测使用
GB/35901一2018 录 附 C 规范性附录 荧光CR反应体系 荧光PCR反应体系见表C.1 表c.1荧光rCR反应体系 组分 1个检测反应的加人量 5 10×PCRBuffer Taq酶5U/4L 2Al. dNTPs(100mmol/1 l.5Al 0.25 1mol/L Me AL 2F07 PCV2- 4mol/L 山 PCV2-qR(104nmol/I 1L PCV2-P(10mol/L 0,.6 lCF(10从mol/L 0.5A IC-R(10Hmol/I 0,5Al cPI0pma/L 0,5Al ddH.o 235儿 合计 39.8 I

猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法GB/T35901-2018

猪圆环病毒是一种严重危害猪类养殖业的病毒，目前已经成为全球范围内的重要疾病之一。尽管在疫苗的使用和预防控制方面有了很大进展，但是猪圆环病毒仍然给养殖业带来了巨大的经济损失。因此，对猪圆环病毒进行快速、准确的检测变得至关重要。目前，PCR技术已经成为病毒诊断及检测的常用手段之一。

GB/T35901-2018是我国针对猪圆环病毒2型的荧光PCR检测标准，该标准规定了PCR反应所需试剂的质量和技术要求、样品采集处理方法、PCR反应条件、荧光信号检测及解读等方面的内容。

根据GB/T35901-2018所规定的方法，进行猪圆环病毒2型的PCR检测需要准备适当的试剂和仪器设备，包括PCR混合液、引物、探针、荧光定量PCR仪等。在样品采集处理时，应严格按照标准要求进行，并尽可能避免污染和误差的产生。

进行PCR反应时，需要设置适当的温度和时间参数，以保证反应的准确性和有效性。同时，在荧光信号检测及解读方面，也需要进行相应的操作和判断。通过这些步骤，可以最终得到猪圆环病毒2型的检测结果。

总体来说，GB/T35901-2018所规定的猪圆环病毒2型荧光PCR检测方法具有快速、准确、可靠等优点，已经成为病毒检测领域的重要手段之一。

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