国家标准 GB/T34797一2017 核酸引物探针质量技术要求 Qualityteehniealrequirementsofprimersandprobes 2017-11-01发布 2018-05-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/34797一2017 核酸引物探针质量技术要求范围本标准规定了DNA引物探针的质量评价指标、技术要求,试验方法包装运输和储存要求本标准适用于DNA引物探针等寡核苷酸产品的质量评价及其检测规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T30988多酚类植物基因组DNA提取纯化及测试方法术语和定义 GB/T19495.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 寡核苷酸oligonueleotide 二至三十个核苷酸残基以磷酸二酯键连接而成的线性多核苷酸片段寡核苷酸可由仪器自动合成,它可作为DNNA合成的引物、基因探针等注，在使用这一术语时,对核苷酸残基的数目并无严格规定,在不少文献中,把含有三十甚至更多个核苷酸残基的多核苷酸分子也称作寡核苷酸 3.2 引物 primer 人工合成的两段寡核苷酸序列,一段与目的基因一端的一条DNA模板链互补,另一段与目的基因另一端的另一条DNA模板链互补 3.3 探针 probe -段带有检测标记,且顺序已知的,与目的基因互补的核酸序列 3.4 定制序列 customsequenee 客户提供的DNA序列及合成要求等信息 3.5 定制引物 estomprimer 客户提供的DNA引物序列及合成要求等信息
GB/T34797一2017 3.6 定制探针eustomprobe 客户提供的DNA探针序列、修饰集团及合成要求等信息 3.7 1OD单位 1OD 在1mL体积1 光程标准比色皿中,260 波长下吸光度为1的寡核苷酸溶液 cm nm 3.8 序列比对 alignment 为确定两个或多个序列之间的相似性和同源性,而将它们按照一定的规律排列并分析的过程缩略语下列缩略语适用于本文件 DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid DSL脱盐(desalination) HAP:新型寡核苷酸纯化(highaffinitypurification HPLC;高效液相色谱(highperformanceliquidcehromatography) MS:质谱massspectrometer) OD:光密度(opticaldensity OPC;寡核苷酸纯化柱(oigonucleotidepurificationcartridge PAGE;变性聚丙熔酰胺凝胶电泳(polyacrylamidegeleectrophoresis) 质量评价要求 5 5.1技术要求 DNA引物探针产品质量控制指标及技术要求应符合表1的规定表1NA引物探针产品质量技术要求产品种类指标要求总量"OD <10% 碱基准确性与定制引物序列一致脱盐'如DsL.等 >75% 85% 过柱"(如oPC,HAP等纯度" PAGE级 90% 引物 HPLC级 >95% 脱盐(如DSL.等 <25% <15% 过柱(如OPC、HAP等碱基缺失率 PAGE级 10% <5% HPIC级 0.05% 相对分子质量"
GB/34797一2017 表1(续产品种类指标要求总量"OD 0<10% 碱基准确性与定制探针序列一致 HPLc级 95% 纯度" 探针碱基缺失率 HPLC级 5% 修饰基团与定制探针一致相对分子质量 <0.05% “”表示相对误差指碱基数<40引物纯度;当碱基数>41,或当引物为修饰引物,或%GC>70%,或序列中有连续5个G以上时,其纯度值与表1规定纯度值差值的绝对值应<5% e进行脱盐或过柱方式纯化的产品,在实验没有相关要求的情况下,可不考虑纯度探针合成宜采用HPI.c纯化方式 5.2外观及性状产品应为半透明或不透明的片状粉状物质,无异味,易溶于水和TE缓冲液 5.3引物探针的总量引物探针的总量一般以oD来表示,合成产品oD测量值与定制序列oD值作比较,要求总量相对误差<10%. 5.4引物探针的相对分子质量测得的引物探针相对分子质量(MW)与定制序列MW值作比较,要求相对分子质量相对误差 0.05% 5.5碱基准确性(DNA序列的一致性》将合成的引物探针序列与定制序列进行比对,匹配度应达到100% 5.6碱基缺失率合成产品碱基缺失率应符合表1要求 5.7引物探针的纯度引物探针纯度主要级别分为“脱盐”级、“过柱”级,PAGE级、HPLC级,应满足表1要求 5.8探针修饰基团的准确性探针修饰基团定制序列应完全一致 5.9试验效果评估将合成以后的引物探针进行PCR扩增以对其试验效果进行评估,包括特异性、效率、产物、引物二聚体带等
GB/T34797一2017 6 质量检测试验方法除非另有说明,在分析中仅使用分析纯试剂,水为GB/T6682规定的一级水 6.1外观及性状感官判断 6.2合成DNA的总量检测 6.2.1测定吸光度利用紫外分光光度计测定合成DNA产品的OD,n,利用吸光度A等于1为1OD单位来计算合成 S DNA产品的总量重复测定3次,结果取平均值 6.2.2试验方法按照GB/T30988执行 6.3核酸引物探针相对分子质量的检测 6.3.1相对分子质量的直接计算相对分子质量可根据引物探针合成单,按照式(1)直接计算 Mw=(A×313.21)十(C×289.18)十(G×329.21)十(T×304.19)一61.94 式中 Mw 相对分子质量; ,C,G、T 各碱基对应的碱基数 A 注:计算探针相对分子质量时,式(1)应加上相应的修饰基团相对分子质量常见修饰基团相对分子质量参见表 A.1 6.3.2质谱测定相对分子质量采用Es源电离喷雾技术,负离子模式将样品转化为运动的带电气态离子碎片,按质核比(m/: 大小分离并记录,通过换算测得相对分子质量 HPLC和Ms的设备及流动相参数参见附录B. 6.3.3测定结果采用6.3.2方法测得的相对分子质量与6.3.1中计算的相对分子质量相对误差应小于或等于 0.05% 6.4碱基准确性检测产品序列和定制引物或定制探针序列的匹配程度,此序列由合成仪后台自动生成并验证 6.5碱基缺失率通过质谱联用仪对合成的寡核苷酸序列进行测定,计算扣除目标峰以外的其他峰高占所有峰高的比值
GB/34797一2017 6.6引物探针的纯度检测 6.6.1 质谱法采用6.3.2的方法测定,计算目标峰面积占所有峰面积比值得出纯度 6.6.2高效液相色谱法采用高效液相色谱进行纯度测定,具体条件参见附录B,计算峰面积,并与对照进行比较,得出引物探针纯度纯度应符合表1的要求 6.7探针修饰基团的准确性 6.7.1质谱法采用6.3.2的方法测定,通过比较相对分子质量来确定是否含有定制探针的修饰基团 6.7.2荧光光谱法采用荧光光谱仪,固定激发波长,并以激发波长为起始点对发射波长进行扫描起始点至900n nm，验证修饰基团的准确性对应修饰基团的特征吸收峰参见表C.1 6.8引物探针验证 6.8.1总则选择目标产品DNA作为阳性对照(如水稻、玉米,大豆等),以非目标产品DNA作为阴性对照,以灭菌去离子水为空白对照,进行PCR扩增(或实时荧光PCR)试验,根据扩增结果判断试验效果特异性验证试验应符合GB/T19495.1的要求 6.8.2特异性和符合性判断根据扩增图谱查看是否获得特异性条带(或是否有典型扩增曲线) 获得特异性条带(或有典型扩增曲线),即可判断产品符合要求,引物设计合理记录格式参见表D.1 6.8.3引物二聚体带观察PCR扩增产物图谱未形成明显的引物二聚体带,空白对照和阴性对照未出现扩增现象，即可判断产品质量合格,引物设计合理 6.9样品保存贮存于一20C冰箱,避免反复冻融未稀释的干粉一20C保存不宜超过1年;稀释的母液宜小量分装，一20C不宜超过半年;稀释的工作液在一20不宜超过1个月包装、运输、标志 7.1包装产品应使用1.5mL2mL或5mL的离心管分装,用96孔板固定,或按客户要求进行包装 7.2运输干粉成品通过铁路、空运或快递方式常温运输运输过程中应注意防止重压,避免日晒、雨淋,不
GB/T34797一2017 得与有毒有害物品同时运输 7.3标志产品包装箱外使用标志按照GB/T191的规定执行 8 合成报告单引物探针合成后应附合成报告单,或等同的指导性文件文件内容应至少包括以下部分 a 名称; b 序列 c 长度; d 纯化方式; e 修饰基团; f OD; g 4gs; h)nmoles; %GC; TM, j Mw k oDperVial m)4gsperOD; n nmolesperOD; 配制方法及浓度; o 保存条件和有效期 p 注相关指标检测分析方法参见附录E 9 标签试剂盒外包装应标示如下内容:产品名称、生产批号或生产日期、规格和数量、运输和保存温度、有效期、生产企业名称和地址
GB/34797一2017 附录 A 资料性附录修饰相对分子质量表A.1常见修饰基团相对分子质量修饰名称相对分子质量修饰名称相对分子质量修饰名称相对分子质量 3 'C6Spacer 179,2 5'MethyleneBlue 514 5'Biotin 405.4 3'C3Spacer 138.1 5'AlexaFluor488 647.8 5'N3(叠氮 289 5'BH 'JoB 3'dde 273.2 666.4 Q2 540.5 3'inverteddT 5'NH2C6 179.2 5'BHQ1 538.5 303 3'NH2C6 179.2 5'AMCA 507 5'HSSH 328.4 3'AMCA 507.8 5'Cy5 657.8 部分硫代(PS 16.l 14 3'P 79.9 5'Cy3 506.6 -0-Methyl碱基 5'TexasRed Spacer9 3'Eclipse 537.9 881.5 212.1 3'BHQ2 556.5 5'ROX 695.8 C3Spacer 38.1 FTAMRA 3'BHQ1 554.5 591.6 lntCy5dT 633.74 3'sHc6 5'HEX 196.2 744. 606 lntCy3-G 3'SHC3 154.2 5'TET 675.2 lntCy3-H 765.9 419.2 lntTAMRA-dT 3'FE 5'6-FAM(FITC 537.6 564.6 3'MethyleneBue 544 5'COO)H(基 262.2 lnt6FAMD 512.5 3'JOE 666.4 3'Biotin-TEG 569.6 lntDigDt 698 3'NH2C7 209.2 13'Dabeyl 837.7 IntNH2C6dT 154.1 3'Cy5 687.8 3'Dabeyl-N 462.4 dSpacer 180. s'Cy 3'TAMRA 644.6 1000 344.3 3 Spacerl8 3'TexasRed 911.5 3'TAMRA-N 621.6 (C6Spacer 179.2 I3'ROX 725.8 5'CHO醛基 228.6 lntBiotindT 380.5 3'HEX 774.1 5'CHCH(炔基 160.1 2FRNA 18 14 3'TET 705.2 5'Dig 722.9 5-MethyldC 3'6-FAM(FITC) 569.5 79.9 ntHSSH 328.4 430 3'Dig 752.9 5Dabey lntBHQ1 656.4 3'Fluorescein 567.6 5'sHC6 196.2 313 2-Aminopurine 3'HSSH 5'NH2c12 263.3 lntFAM,IntTAMRA 1077.1 244.3 I3'Biotin 380.5 5'FE 389.2

GB/34797一2017 录附 C 资料性附录修饰基团特征吸收峰表c.1修饰基团特征吸收峰一览表修饰名称激发波长EX 发射波长(EM 3'TAMRA 560 582 5'ROX 578(567 604(591 5'HEx 535 553 5'6-FAM(FITc 494 522 3'AMCA 345 425 3'JOE 520 548 3'NH2C7 547 573 3'Cy5 649 670 3'Cy3 550 570 3'RO 588 608 3'HEX 556 535 3'TET 521 536 3'6-FAMFITC 492 518 3'Fluorescein 497 519 5'AlexaFluor488 499 518 5'AMCA 347 444 5'Cy5 675 694 5'c 58 596 Cy3 5'TAMRA 548(542) 552(568) 5'TET 521 538
GB/T34797一2017 附录 D 资料性附录) 引物探针验证记录格式表D.1引物探针验证记录格式名称 DNA成分检测引物探针规格 OD 数量厂商验收参数及要求: 空白对照阴性对照阳性对照检验依据检验记录: 该引物标识 ,外观和包装 DA为阳性对照,以 DNA为阴性对照,以灭菌去离子水为空白对照,按照要求的反应以体系和扩增程序进行PCR反应,以验证该对引物扩增的有效性其结果如下阳性对照 ,Ct值: 阴性对照 ,Ct值空白对照 ,Ct值: 检验结论 10
GB/34797一2017 附录 E 资料性附录引物探针相关指标检测分析方法 B.1oigoDNA质量数的计算按照每个OD约等于334g来计算质量数(见示例1) 示例1 ！管5oD丽的20meroligoDNA 质量数=5×33=165" "g; 摩尔数=165一5652.75=0.029mol=29nmol 若加双燕无菌水400AL溶解,则浓度为;29nmoL一400L=72.5Amol/L E.2oligoNA电泳分析采用7nmol/1尿素的聚丙熔酰胺电泳和1倍TBEBufer进行电泳为防止加样时的扩散和二级结构的影响,样品上样前应加饱和尿素处理 E.3T 值的计算 T 值计算方法有以下几种: 软件得出 a T值可以从引物评价分析软件中直接得出,如Oligo6等 b)4(G+C)十2(A+T)法长度在25mer以下的引物,T值可以按照式(E.1)计算得出 r =4(G+C)十2(A十T) E.1) GC含量法对于较长的寡聚核苷酸引物,T 值可以按照式(E.2)计算得出: T=81.5十16.6×L.og[Nat+]十0.41×(%GC)一600/sizeE.2 式中 -引物长度 size

GB/T34797-2017核酸引物探针质量技术要求

随着生物技术的不断发展，核酸分析技术已经成为了现代生命科学领域中最为重要和基础的技术之一。而核酸引物探针则是核酸分析技术中最为重要的组成部分之一。

GB/T34797-2017标准规定了核酸引物探针在设计、合成、纯化、检测等方面的质量技术要求，以确保其在实验中的准确性和可靠性。

一、核酸引物探针的质量技术要求

1. 设计要求：核酸引物探针的设计应当考虑到以下因素：

目标序列的特异性和长度；
引物探针的相互作用及其与目标序列的匹配情况；
引物探针的物理化学性质，如熔点、GC含量等。

2. 合成要求：核酸引物探针的合成应当符合以下要求：

纯度高，无毒副产物；
长度准确，无杂质和缺陷；
具有稳定的物理化学性质，如熔点、GC含量等。

3. 纯化要求：核酸引物探针的纯化应当满足以下条件：

具有良好的分离度和纯度；
去除毒副产物和杂质。

4. 检测要求：核酸引物探针的检测应当能够准确地判断其质量是否符合标准，并确定其在实验中的最适使用条件。

二、总结

GB/T34797-2017标准规定了核酸引物探针在设计、合成、纯化、检测等方面的质量技术要求，为核酸分析技术的开展提供了基础保障。同时，本标准的实施也有助于推动核酸引物探针质量技术的不断发展和创新。