可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法

可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T20756一2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素 甲讽霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Methodforthedeterminationofchoramphemieol,thiamphenicol,and florfenicolresiduesinedibleanimalmuscles,liverandaqguaticprodcts LC-MS-MSmethod 2007-03-01实施 2006-12-31发布 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管委员会国家标准
GB/T20756一2006 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由秦皇岛出人境检验检疫局提出 本标准由国家质量监督检验检疫总局归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局、广东出人境检验检 疫局 本标准主要起草人;庞国芳、林海丹、林峰、焦红、陈捷 本标准系首次发布的国家标准
GB/T20756一2006 可食动物肌肉、肝脏和水产品中氯霉素、 甲讽霉素和氟苯尼考残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了可食动物肌肉、肝脏、,鱼和虾中氢霉素、甲碱霉素和氟苯尼考残留量的液相色谱-串联 质谱测定方法 本标准适用于可食动物肌肉肝脏、鱼和虾中氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考残留量的测定 本标准方法的检出限;氯霉素为0.14g/kg,甲碱霉素和氟苯尼考为1.0g/kg 规范性引用文件 2 下列文件中条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有的 修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是 否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分;总则与定 义 (GB/T6379.1一2004,Iso5725-1l:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,IsO5725-2;1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一1992,neqISO3696;1987) 原理 样品中的氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考在碱性条件下,用乙酸乙酯提取,提取液旋转蒸干后,残渣用 水溶解,经正己炕液液分配脱脂 液相色谱-串联质谱仪检测 试剂 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.2乙酸乙酯 4.3正己炕 4.4氢氧化铵;25%28% 4.5无水硫酸钠;经650C灼烧4h,置于干燥器中备用 氧霉素、甲碱霉素和氟苯尼考标准物质;纯度>99.5% 爪代氯霉素内标标准溶液1004g/mL 标准储备游液;10o 4g/mL 分别准确称取适量的氯霉素、甲讽霉素和氟苯尼考标准物质,用甲醇 配成1004g/m的标准储备溶液,该溶液于一18C保存,可使用1年 4.9混合标准储备溶液l4g/ml 分别准确吸取1ml氧霉素、甲碱霉素和氟苯尼考标准储备溶液 (4.8)于100mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度 该溶液于一18C保存,可使用6个月 4.10中间浓度混合标准溶液;20ng/mlL 准确吸取1mL 混合标准储备溶液(4.9)于50ml.容量瓶 中,用水稀释至刻度 该溶液于4C保存,可使用3个月
GB/T20756一2006 4.11内标标准储备溶液:14g/ml 准确吸取100l尔代氯霉素(d,-氯霉素)标准溶液(4.7)于 0ml容量瓶中,用甲醉稀释至刻度 该溶液于一18C保存,可使用6个月 4.12中间浓度内标溶液;20ng/ml 准确吸取1mL内标标准储备溶液(4.11)于50ml容量瓶中 用水稀释至刻度 该溶液于4C保存,可使用3个月 4.13基质混合标准工作溶液;根据每种标准的灵敏度和仪器线性范围,吸取一定量的中间浓度混合标 准溶液(4.10)和中间浓度内标溶液(4.12),用空白样品提取液配成系列浓度的基质混合标准工作溶液、 内标浓度均为0.3r" 当天配制 m ng/ 4.14滤膜;0.2um 仪器 5.1液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源 5.2分析天平;感量0.1mg和0.01g 5.3离心机:4000r/'min. .4 高速台式离心机:13000r/min 5. 5.5组织捣碎机. 5.6匀质器 5.7旋转恭发器 5. .8 超声波 5.！液体混匀器 5. .10聚丙烯离心管;50ml,1.5mL,具塞 5.11鸡心瓶;25m 5 12比色管;50mL,具塞 试样制备与保存 6.1试样的制备 取样品约500g用肉类组织捣碎机绞碎,装人洁净容器作为试样,密封,并标明标记 6. 试样的保存 2 将试样于一18C冰箱中保存 测定步骤 提取 称取5巨试样,精确至0.g 置于0ml聚丙婚离心管中,加人中间被度内标游液(!12) 75.0AlL,加人15ml乙酸乙醋,0.45ml氢氧化铵(4.4),5g无水硫酸钠,匀质提取30s,以40001 r/nmin 离心5 ,上清液转移至50mL比色管中 另取一个50mL离心管,加人15mL乙酸乙醋,0.45mL min， 氢氧化铵,洗涤匀质刀头10s,洗涤液移人第一支离心管中,用玻棒搅动残渣,于液体混匀器(5.9)上涡 旋提取1min,超声波提取5min,以4000r/min离心5min,上清液合并至50mL.比色管中 残渣再加 人15ml.乙酸乙酯,重复上述操作,合并全部上清液至50mL比色管中,用乙酸乙酯定容至50mL 摇 匀后移取10mL乙酸乙酯提取液于25nmL鸡心瓶中,在45C旋转浓缩至干 7.2净化 鸡心瓶中的残渣用3mL水溶解,超声5min,加人3mL正己婉涡旋混合30s,静置分层,弃掉上层 的正己烧,再加3ml正己烧涡旋混合30s,静置分层,移取1ml.水相于1.5ml.的聚丙烯离心管中,以 3000 r/min离心5min,过0.2Am滤膜后,供液相色谱-串联质谐测定
GB/T20756一2006 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 色谱柱;DiscoveryC色谱柱,5Am,l50mm×2.1mm(内径)或相当者; a bb 柱温:40C; 流动相.甲醇十水(40十60); ce d)流速:0.30mL/min 进样量;20L e 7.3.2质谱条件 离子源电喷雾离子源， a bb 扫描方式;负离子扫描; 检测方式;多反应监测(MRM); c d 电喷雾电压;-1750V 雾化气、气帘气、辅助加热气、碰撞气均为高纯氮气及其他合适气体,使用前应调节各气体流量 以使质谱灵敏度达到检测要求; fD 辅助气温度:500C; 定性离子对,定量离子对,采集时间,去簇电压及碰撞能量见表1. g 表1氯霉素、甲讽霉素、氟苯尼考和气代氯霉素(d-氯霉素)的质谱参数 定性离子对 定量离子对 采集时间 去簇电压 碰撞能量 被测物名称及内标名称 m/) m/: /m1s 320.9/257.0 -16 氯霉素 320.9/152.0 200 -55 320.9/152.0 26 354.0/290.0 18 甲碱霉素 354.0/185,0 200 -55 21 354.0/185.0 356.0/336.0 -14 氟苯尼考 356.0/336.0 200 -55 356.0/185.0 27 326.0/157.0 -55 尔代氯霉素d,-氯霉素 326.0/157.0 200 26 7.3.3液相色谱-串联质谱测定 7.3.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物和内标物的保 留时间之比,也就是相对保留时间,与标准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5%之内;且样品中各 组分定性离子的相对丰度与浓度接近的标准溶液中对应的定性离子的相对丰度进行比较,若偏差不超 过表2规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表2定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >20一50 >10~20 1o 50 允许的最大偏差 士20 士25 士30 土5o0 7.3.3.2定量测定 在仪器最佳工作条件下,对基质混合标准工作溶液(4.13)进样,以标准溶液中被测组分峰面积和尔 代氯霉素(d-氧霉素)峰面积的比值为纵坐标,标准溶液中被测组分浓度与爪代氯霉素(d-氯霉素)浓度 的比值为横坐标绘制标准工作曲线,用标准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中待测物的响应值均应 在仪器测定的线性范围内 内标法定量 氯霉素、甲碱霉素,氟苯尼考和尔代氯霉素(d-氯霉素)的标 准物质的多反应监测(MRM)色谱图参见图A.1 氧霉素、甲讽霉素和氟苯尼考的添加浓度及其平均回 收率的试验数据参见表B.1
GB/T20756一2006 7.4平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定 7.5回收率试验 阴性样品中添加标准溶液,按7.1一7.2操作,测定后计算样品添加的回收率 结果计算 结果按式(1)计算: 1000 -x是x二*完 X= O0 式中 试样中被测物残留量,单位为微克每千克(ug/kg); 基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL). 试样溶液中被测物的色谱峰面积 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); -基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升ng/mlL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积 试样溶液中内标物的色谱峰面积 样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 注:计算结果应扣除空白值 精密度 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,被测物的含量范围及重 复性方程见表3和表4 表3氯霉素、甲碱霉素和氟苯尼考的含量范围及重复性和再现性方程(基质为动物肌肉 化合物名称 含量范围/g/kg 重复性限r 再现性限R R= 0.1142m十O.o174 0.0500~1.00 广=0.075m十0.0186 氯霉素 甲碱霉素 0.5004.00 r=0.252m+0.103 R=0.264十0.102 氟苯尼考 0.5004.00 gr=0,9116lg川-0,618 lgR=0.916lgm-0.617 注:m为两次测定结果的算术平均值 表4氧霉素、甲讽霉素和氟苯尼考的含量范围及重复性和再现性方程(基质为动物肝脏 化合物名称 含量范围/u4g/kg 重复性限r" 再现性限R 氯霉素 0,05001,00 广=0.143m十0.0034 R=0.196m十0,0049 甲碱霉素 187 0.5004.00 r=0.228m1十0.T R=0.292n1十0.0622 氟苯尼考 0.5004.00 r=0.164m+0.0519 R=0,205m十0.036 注;m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 2 9. 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,被测物的含量范围及再 现性方程见表3和表4
GB/T20756?2006 ? A ?? ù??ù??????ù????(MRM)?? ù??ù???????ù????(MRM)??,?A.1 4.06 2.18 3709 8000 3000 ?ù ? 6000 2000 4000 1000 2000 0.51,01.52.02,53.03.54.045 3.03.54.04.5 0,51.0 /minm /min 2.62 3.97 1.5e4 2000 ? 1500 ?ù 1.0e4 1000 5000.0 00 0.0 0.51.01.52.02.53.03.54.04.5 0.5l.01.52.02.53.03.54.04.5 /min //min ?A.1ù??ù??????ù????(MRM)??
GB/T20756?2006 ? B ?? ù??ù???????,B.1 B.1ù??ù???????(n=10 ? ?/u4g/kg) ?/(%) 0.1o 97.8 ù 0,50 97.9 1.00 113.0 1,00 101.0 ?ù 2.00 104.0 4.00 99.8 1.00 99.0 ? 2.00 100.0 4.00 108.0 0.10 100.0 ù 98.0 0,50 1.00 105.0 1.00 04.0 ?ù 2.00 97.1 4.00 77.3 1.00 103,0 ? 2.00 106.0 4.00 99.1 0.10 118.0 0,50 ù 112.0 1.00 108.0 97.o 1,00 ?ù 2.00 97.3 4.00 91.7 1.00 90.o ? 2.00 92.9 4.00 86.2
GB/T20756一2006 表B.1(续 样品基质 化合物名称 添加浓度/(ug/kg 平均回收率/(% 0.10 113.0 氯霉素 0,50 107.0 l.00 109.0 1.00 96.4 甲碱霉素 虾 2.00 98.9 4.00 96." 1.00 93.o 氟苯尼考 2.00 83.9 4.00 86.4