蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法

蝇类抗药性检测方法家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法

国家标准 GB/T26349一2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 Testmethodsofflyresistancetoinsectieides一 Testmethodsofinmsensitiveacetylcholinesteraseformuscadomestica 2011-01-14发布 2011-05-01实施 卫生部 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T26349一2010 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的起草规则起草 本标准由卫生部提出并归口 本标准起草单位:农业大学、北京市疾病预防控制中心,人民解放军军事医学科学院微生 物流行病研究所 本标淮主要起草人;高希武、曾晓其,梁浦马彦、刘婷,终颖,赵影言
GB/T26349一2010 蝇类抗药性检测方法 家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法 范围 本标准规定了家蝇(Muscadomestica)不敏感乙酰胆碱酯酶(AChE)的检测方法 本标准适用于家蝇对有机磷、氨基甲酸酯类药剂抗药性的生物化学检测 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件， 乙酰胆碱酯酶区分浓度diseriminatingconeentrationofacetyleholinesterase 能够抑制敏感品系家蝇乙酰胆碱酯酶正常活性90%的杀虫药剂的浓度,单位为mol/L或 mmol/L 2.2 F1代F1generation 从现场捕捉的家蝇繁殖后得到的第一代 试虫 现场采集家蝇,室内饲养，羽化后3d5d的F1代雌性家蝇 冰浴条件下储存不超过1d -20C条件下储存不超过1周或-80C条件下储存6个月以内 试剂 4.1磷酸氢二钠(NaHIPO,化学纯 4.2磷酸二氢钾(KHPO,化学纯 4.3曲拉通X-100(TritonX-100). 4.4乙酰硫代胆碱(ATCh).分析纯 4.55,5’-二硫双硝基苯甲酸(DTNB),分析纯 4.6磷酸缓冲液(0.1molLpH7.5PBs).称取30.18gNaHPO.12H,O和2.16gKH.PO.,燕留 水定容至1000ml DTNB-乙醇显色剂称取12.4mgDTNB,溶于125ml95%乙醇中,加人50mL磷酸缓冲液,最 后用蒸僧水定容至250ml,4C避光保存 4.8ATCh溶液;称取28.9mgATCh溶于10ml燕水中,-20C避光保存 分光光度法 5.1仪器设备 5.1.1 分光光度计
GB/T26349一2010 1.2恒温水浴箱 5. 5. .1.3玻璃组织匀浆器 5. .1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上). 5.1.5加液器 5. 2 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液,试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%Tritonx 100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见表A.1)的2倍,溶剂 在反应体系中的最终浓度应小于1% 5.3操作步骤 5.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪(切)下,放人4C预冷的玻璃组织匀浆器(1mL) 中,加人0.5mL4丫预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100),充分匀浆 匀浆液在4,10000离心15min,取上清液即为酶液，冰浴保存备用 5.3.2 5.3.3取4支试管,分别加人上述酶液0.1mL,在其中3支试管中分别加人一定量的杀虫药剂溶液 0.lmL,使其终浓度达到区分剂量,第4支试管中加人0.1mL磷酸盐缓冲液作为无药剂对照管;另取 支试管加人0.2ml磷酸盐缓冲液,作为空白对照 上述5支试管30C保温5min后,分别加人0.1mLATCh,在30C继续保温15min后,加人 1.6ml.DTNB乙醇显色剂 以空白对照调仪器0点,在分光光度计中于412nm波长下测定无药剂对照管和药剂处理管的 光密度值(ODi2. 5.3.6按上述方法每个种群检测100只家蝇 5. 结果表述 4 测定AChE残存活性的计算见公式(1) OD E ×100% OD 式中: E -AChE残存活性; OD -药剂处理管平均光密度值OD12; OD 无药剂对照管平均光密度值oD 5.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸醋 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群 酶标仪法 6.1仪器设备 酶标仪 恒温水浴箱 3 6.1. 玻璃组织匀浆器
GB/T26349一2010 6.1.4台式冷冻离心机(离心力10000g以上) 6.1.5加液器 杀虫药剂的配制 用丙酮或其他的有机溶剂将杀虫药剂配制成母液试验前用磷酸盐缓冲液(含0.1%Trton X-100)稀释到区分浓度(常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度见附录A表A.2)的 2.5倍,溶剂在反应体系中的最终浓度应小于1% 操作步骤 6.3.1取家蝇1只,用眼科剪刀或手术刀片将头部剪下,放人4C预冷的玻璃组织匀浆器(1mL)中， 加人0.5ml4C预冷的磷酸盐缓冲液(含0.1%TritonX-100)，充分匀浆 6.3.2匀浆液在4C,10000离心15min,取上清液即为酶液,冰浴保存备用 6.3.3在酶标板孔中加人0.1mL酶液,在每个孔中分别加人0.05mL.DTNB和o.lmL含抑制剂的 ATCh溶液,抑制剂终浓度为区分浓度,每只家蝇设无抑制剂对照一个,用缓冲液代替抑制剂量,在酶标 仪中读数5min,曲线的斜率作为反应初速度() 计算平均值 按上述方法每个种群检测100只家蝇 结果表述 测定AChE残存活性的计算见公式(2) E=当×100% 心 式中 E -AChE残存活性; 药剂处理组平均反应初速度 u 无药剂对照组平均反应初速度 U 6.5判别标准 AChE残存活性大于20%为不敏感的AChE,具有不敏感AChE的个体为对有机磷或氨基甲酸酯 类药剂具有抗性的个体,抗性个体在种群中的比例达到20%时为抗性种群
GB/T26349一2010 附录A 资料性附录 常见杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 A.1表A.1给出了用分光光度法测出的3种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 表A.13种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度(分光光度法) 区分浓度1n 杀虫药剂 mol/L 敌敌畏(DDVP) 2×10 残杀威(propoxur) 4×10 灭多威(methomyD) 6X10" 注，敏感品系来自农业大学选育的家蝇敏感品系,2004年测定结果 表A.2给出了用酶标仪法测出的3种杀虫剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度 A 表A.23种杀虫药剂对敏感家蝇品系乙酰胆碱酯酶的区分浓度(酶标仪法》 区分浓度I 杀虫药剂 mol/L 3×10 敌敌畏(DDVP 残杀威(propoxur 5×10 灭多威(methomyl 4×10- 注:敏感品系来自农业大学选育的家蝇敏感品系,2004年测定结果

蝇类抗药性检测方法：GB/T26349-2010家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法

蝇类抗药性是指它们在接触杀虫剂后仍能够生存并繁殖的能力。为了防止蝇类抗药性的发展，需要开发新的检测方法以测试它们对杀虫剂的敏感度。

GB/T 26349-2010是中国国家标准化委员会发布的一项关于蝇类抗药性检测的标准。该标准提出了多种检测方法，其中最常用的是家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法。

家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法的原理与不敏感乙酰胆碱酯酶法类似，都是通过测定蝇体内酶的活性来判断其对杀虫剂的敏感度。该方法具有简便、快速、准确等优点，并且可以用于高通量筛选，因此被广泛应用于蝇类抗药性检测领域。

值得注意的是，家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法只适用于家蝇这种害虫，而不能用于其他蝇类或昆虫的抗药性检测。

总之，蝇类抗药性对于人类健康和生态环境都具有严重的影响。使用GB/T 26349-2010中提出的家蝇不敏感乙酰胆碱酯酶法进行检测可以帮助我们更好地了解蝇类对杀虫剂的敏感度，从而制定出更有效的防治策略。

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