纳米技术纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法

纳米技术纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法

国家标准 GB/T34059一2017 纳米技术纳米生物效应代谢组学方法 核磁共振波谱法 Nanoteehnolwgy一Nanobolwgieleffectsofnanomaterials NMR-basedmetabolomics 2017-07-31发布 2018-02-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34059一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由科学院提出 本标准由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口 本标准起草单位:科学院武汉物理与数学研究所、国家纳米科学中心 本标准主要起草人;张利民、王玉兰、唐惠儒,吴晓春
GB/T34059一2017 引 言 纳米材料通过呼吸、摄取、皮肤直接或间接接触等众多途径进人生物体,能够在细胞、亚细胞乃至分 子水平影响生物体,引起生物体代谢改变 因此可以通过纳米材料暴露引起的生物体代谢组改变来评 价纳米材料的生物学效应 代谢组学研究是以组群指标分析为基础,以高通量检测和多变量数据统计 分析为手段,以数学模型与系统整合为目标的学科,是系统生物学的一个分支学科,已经广泛应用于肿 瘤、消化道疾病、代谢性疾病以及药物毒理等领域 目前代谢组学测试方法主要是色谱-质谱联用法和 核磁共振波谱法,本标准制定基于核磁共振波谱法检测并用于评价纳米材料生物效应的代谢组学分析 方法 IN
GB/34059一2017 纳米技术纳米生物效应代谢组学方法 核磁共振波谱法 范围 本标准规定了纳米材料暴露引起生物体代谢组变化的核磁共振检测方法 本标准适用于纳米材料的生物效应评价 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T13966分析仪器术语 GB/T19619纳米材料术语 术语和定义 GB/T13966和GB/T19619界定的以及下列术语和定义适用于本文件 3.1 代谢组学方法 metab0nOmicS;metabolomics 对生物体内代谢物组进行分析,并建立代谢物与生理病理少化的对应关系的组学方法m 3.2 纳米材料暴露nanomaterialsexposure 纳米材料与人群或实验细胞和动物充分接触 缩略语 见附录A 原理 用质子NMR法检测经纳米材料暴露后的生物样本,利用多变量统计分析代谢组学方法分析代谢 物含量的变化,据此评估纳米材料生物效应 仪器 6. 高分辨核磁共振谱仪 质子共振频率500MHz以上的NMR谱仪,参数优化建议参见附录B
GB/T34059一2017 6.2核磁管 用于NIMR谱仪检测的样品管 测试样品 纳米材料暴露后的生物样本,包括细胞、动物体液和组织等 8 检测步骤 8.1打开仪器,将装有待测试样的样品管置于NMR磁体内 8.2设置待测样本温度(通常实验温度为25C),等待至仪器稳定 8.3锁场与调谐 8.4调用仪器自带氢谱脉冲序列,根据不同生物样本选择合适的脉冲序列 8.5参照仪器厂家提供的标雅物质的谱峰半高宽,对NMR谱仪进行匀场 8.6优化并设定谱宽、脉宽、等待时间、采样点数、采样时间和扫描次数等测量参数 核磁共振信号采集 8.7 8.8将仪器所测谱图保存,并记录仪器状态和测量数据 8.9选取部分代表性样品进行二维NMR谱的采集并保存 g 信号归属 代谢物的NIMR信号通过一系列二维谱进行归属,并查阅相关文献和公共数据库进行归属验证 通常情况下,NMR信号包括糖类、氨基酸类,胆碱类,有机梭酸类、脂肪酸、核苷/酸类等代谢物 10 信号的预处理和多变量统计分析 10.1信号预处理 应用核磁谱仪自带分析软件将核磁信号进行预处理,包括核磁谱图基线的校正、化学位移的定标 谱峰对齐和积分以及数据归一化 对于细胞培养液和尿样宜采用总面积归一化;对于血浆样品宜采用 不归一化或总面积归一化;对于细胞提取物、组织提取物和肠道提取物宜采用湿重归一化;对于肠道内 容物提取和粪样提取宜采用干重归一化 10.2数据预处理 应用生物信息学软件将核磁数据进行标准化预处理,包括中心化处理、自适换算、帕累托换算等 主成分分析宜选择中心化处理方式 正交化偏最小二乘法判别分析宜选择自适换算或者帕累托换算 0.3数据多变量统计分析 10.3.1概述 包括非监督的模式识别方法和有监督的模式识别方法 0.3.2非监督的模式识别方法 将数据进行主成分分析(PCA) 主成分分析可以直观展示样品的聚集离散程度,是否存在异常点
GB/34059一2017 和组内分组趋势 0.3.3有监督的模式识别方法 将数据进行正交化偏最小二乘法判别分析(OPLs-DA),并将OPLs-DA标准化处理后的数据进行 回溯转换成负载图 10.4统计模型验证 10.4.1概述 主要包括内部验证和外部验证,确保后续数据分析结果的可靠性 0.4.2内部验证 主要采用交叉验证的方法 舍一法是最常用的一种交叉验证方法,即将样本总数的1/7作为验证 集,6/7作为训练集 10,4.3外部验证 主要包括置换排列检验(PermutationTest)和变异系数方差分析(CV-ANOVA)两种方法 测试分析结果 金纳米棒体外暴露的代谢组学测试,形态学与组织病理学辅助评价及常规生化指标检测等生物 11.1 效应评价实例参见附录B 11.2纳米材料生物效应研究的核磁共振检测报告格式参见附录C
GB/T34059一2017 附 录 A 规范性附录) 缩略语 缩略语见表A.1 表A.1缩略语 缩略语 中文名称 英文名称 核磁共振 NMR Nuclearmagneticresonance Ctr 中心化 mean-centeringandnotscaling Uv 自适换算 Autoscalingandscaledtounitvariance Par 帕累托换算 Paretoscalingandscaledtoparetovariance PCA 主成分分析 Principalcomponentsanalysis ogonaltopartialleastsquaresdiserinminantanalysis OPIS-DA 正交化偏最小二乘法判别分析 Ortho CV 交叉验证 Crossvalidationm PR 置换排列检验 Permutationtest CV-ANOVA 变异系数方差分析 Coeffieientofvariationanalysisofvariance CTAB 十六熔基三甲基澳化做 Cetvltrimet山hvlammoniumbronmide DMEM 达尔伯克(氏)必需基本培养基 Dulbeccosminimumessentialmedium HEPES N-2-N'-2-hydroxyethylpiperazineethanesul N-2-胫乙基眼嗓-N'-2-乙碱酸 sulfonicacid PBS 磷酸缓冲液 Phosphatebuffersolution
GB/34059一2017 录 附 B 资料性附录 金纳米棒对细胞毒性评价实例 金纳米棒表征 B.1 采用透射电子显微镜和紫外/可见吸收光谱仪分别表征了十六烧基三甲基澳化铵(CTAB)修饰的 金纳米棒的形貌(16.7nm×62.5nm)和消光光谱特性,如图B.1所示 0.9 N 0.6- 0.3 0.0- 20o 400 60o 800 000 00m 波长/nm 图B.1透射电子显微镜左)与紫外/可见吸收光谱仪右)对金纳米棒的特性表征 纳米材料体外(细胞)暴露实验步骤 B.2 B.2.1细胞培养 本实例采用含10%胎牛血清DMEM培养基(不含HEPEs,不加抗生素),接种密度40%一50%， 温度为37C,二氧化碳5%,培养48h,使细胞融合度接近100% B.2.2纳米材料暴露 细胞培养融合度接近100%时,开始加人纳米材料溶液进行暴露实验,同时保留一组细胞样本作为 平行对照组 实验过程中使用显微镜观察细胞生长情况并进行细胞计数,建议用于代谢组学分析的细 胞个数约为10”个,湿重约为100mg 金纳米棒暴露24h后,将细胞计数并收集 B.2.3细胞收集 首先用移液器移去培养基,加人5ml，磷酸缓冲液(PBS)润洗，然后移除PBS,加人0.25%胰酶 5mL消化细胞约2nmin一5min 向细胞培养液中加人含血清培养基4mL使胰酶失活,将溶液转至 5mL离心管 加人4nmL培养基再次润洗培养瓶,将溶液转至同一离心管 然后在温度为4C,转速 为800g情况下离心2min,除去上清液;加人4C预冷的PBS3mL将培养皿冲洗3次,转速为8o0g" 情况下离心后除去上清液,收集细胞,准确称重后保存于一80C超低温冰箱
GB/T34059一2017 B.2.4细胞代谢物提取步骤 提取步骤包括 往细胞中加人体积比为1:2水/甲醉1ml混合溶液,混匀,采用液氮和37C水浴分别冻融 a 3次 b 在冰浴条件下采用250W超声破碎细胞15 ,超声方式为;超声1 ,暂停1min,如此循 min， min 环8次; 在4,转速为3200g条件下离心10min后收集上清液;在细胞残渣中加人体积比12水 甲醉醇ml混合溶液,混匀,采用液氮和37C水浴分别冻融3次; d 在冰浴条件下采用250W超声破碎细胞15min,超声方式为;超声1 ,暂停1min,如此循 min 环8次; 将上述2次收集的上清液汇人5mLEP管,在4C,转速为3200g离心10min后收集上 清液; 采用真空浓缩仪除去甲醉,冷冻干燥除水,保存于一80亿超低温冰箱 纳米材料暴露前后的细胞形态学表征 B.3 如图B,2所示,16HBE细胞和A549细胞在金纳米棒暴露48h后的荧光成像对细胞存活率 10m 说明: 绿色 活细胞， 红色 死亡细胞箭头所示) 图B.216HBE细胞(A)与A549细胞对照组(B)分别在CIAB表面修饰金纳米棒 暴露48h(c.D)后细胞的明场与荧光成像图
GB/34059一2017 B.4常规生化指标检测 根据实验对象,合理检测生化指标 本实例中,纳米材料暴露后导致细胞氧化应激损伤,而谷胱甘 肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG),或GSH/GSsG的比值是氧化应激的生物标志物,因此采用生化 方法或者核磁共振检测细胞内GSH/GSSG的比值及三磷酸腺苷(ATP)含量(图B.3) 600 120 日对照口金纳米棒暴踢 日对照日金纳米棒暴露 100 400 80 60 40 200 20 48h 12h 48h 12h 24h 24h A549ccls 16HBEcels =对照=金纳米棒暴露 日对照日金纳米棒暴露 80 60 60 啪 如 40 40 20 20 12h 24h 48h 12" 24h 48h A549cells 16HBEcel 说明 -有显著性意义的户值小于 0.05 有显著性意义的值小于0.01; -有显著性意义的！值小于0.001. 关关关 图B.3CTAB表面修饰金纳米棒暴露对A549细胞和16HBE细胞内不同暴露时间GSH与 GSSG的比值及ATP含量的影响 B.5细胞提取液代谢物NMR检测 本实例中,细胞提取物使用一维的具有预饱和水蜂照射的NoEsY脉冲序列采集'HNMR谱 实 验参数优化见表B.1
GB/T34059一2017 表B.1实验参数的优化 NMR参数名称 NMR参数设置(预饱和水峰照射的NO)ESY脉冲序列 实验温度 25 谱宽 20ppm ~10" 脉宽 等待时间 2 混合时间 00ms 间隔时间 3Hs 采样时间 1.36s 采样点数 32768 累加次数 G4次 空扫 8次 细胞提取物NMR信号检测并进行归属(图B.4) 化学位移/ppm 说明 脂肪; 亮氨酸， 异亮氨酸， 额氨酸; 乳酸 图B.4细胞提取物NM谱图及部分信号归属
GB/34059一2017 B.6NMIR信号预处理后的多变量统计分析 B.6.1主成分分析(非监督分析 图B.5主成分分析得分图显示金纳米棒导致不同细胞代谢组存在明显的分离趋势,并且数据集无 异常点存在 0.010 0.005 0.005 0.000 -0.005 0.005 -0.010 -0.020.000.02 -0.02 0.00 0.02 主成分1 主成分1 图B.5对照组(红色圆圈)与CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h黑色方框)时 16HBE(A)和A549(B)主成分分析得分图 B.6.2偏最小二乘法判别分析(有监督分析 如图B.6所示为16HBE细胞对照组与cTAB表面修饰金纳米棒暴露24h的缅胞其提取物的 OPLs-DA得分图与其相关系数负载图 图形横坐标为NMR谱的化学位移,纵坐标为每个变量相关系 数的绝对值(Irl|,图形用不同颜色来表征代谢物对区分组间的贡献大小 颜色越红,则变量和分组变 量的相关系数(r)越大,表示该代谢物对区分组间的贡献越大;反之,颜色越蓝,”越小,则表示变量对区 分组间的贡献越小 此外，通过皮尔森相关系数显著性差异检测(Pearson'sproduetmoment correlationcoeffieient),并综合考虑组内样本数n(最少组的样本数),确定评估代谢物变化是否达到具 有统计学差异的值(p<0.05) 例如当n=10时,其相关系数的闵值rw为0,602,即当代谢物信号 的相关系数绝对值|r|>0.602时,则代谢物的变化才具有统计学差异 =0.4,=0.84 0 金纳米棒暴露组 48h 0.85 27 48 0.64 0.43 英 38 0.21 3:36,37, 38 对服组 25,26,29 25.26 -40 40 40 言 8. 6.5 9.5 7.5 3.5 2.5 .5 化学位移/ppm 图B.6A549细胞对照组与cIAB表面修饰金纳米棒暴露48h的细胞其提取物的 oPLS-DA得分图(左)与其相关系数负载图右 B.6.3多变量分析模型验证 置换排列实验结果显示16HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h
GB/T34059一2017 时所建立的数学模型较好(图B.7) 其中绿色数据点代表排列实验中的R'值,蓝色数据点代表排列实 验中的Q'值,任何一次随机排列产生的R,Q值均小于右端的原始值,表明原始模型的预测能力大于 任何一次随机排列变量的预测能力,则该模型验证通过 1.0 A B 0.0 0.0 0.2 0.40.60.8 1.0 0.0 0.2 0.60.8 说明 纵坐标 模型预测能力值 横坐标 -排列实验随机率 绿色数据点 R'值; 蓝色数据点 Q值 161HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面修饰金纳米棒暴露48h时 图B.7 模型的置换排列实验 另外,OPLS-DA模型的cV-ANOvA验证显示16HBE细胞(A)和A549细胞(B)对CTAB表面 修饰金纳米棒暴露48h时的力值为1.69×10-1,远小于0.05,表明所建立的数学模型较好 B.7测试结果和金纳米棒细胞生物效应评价 NMR检测并归属了包括亮氨酸、异亮氨酸,乳酸等代谢物;多变量统计分析发现金纳米棒暴露于 正常细胞(16HBE)导致谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸含量显著升高,还原型谷胱甘肽含量显著下降,氧化 型谷胱甘肽含量显著升高;然而,金纳米棒暴露于癌细胞(A549)后,细胞内谷氨酸,甘氨酸和半胱氨酸 含量未见显著变化,还原型谷胱甘肽含量显著下降,大量的核苷酸含量显著下降 荧光成像对细胞存活 率的表征表明金纳米棒暴露于正常细胞(16HBE)显示细胞毒性较小,而暴露于癌细胞(A549)后显示明 显的细胞毒性 0
GB/34059一2017 录 附 C 资料性附录 纳米生物效应研究NIR检测报告格式 纳米生物效应NIR检测报告 报告编号 委托者 名称 地址: 联系方式 测试样品 名称 编号 测试依据 NMR谱仪 制造单位 型号 NMR检测参数 待测样品类型: 温度 脉冲序列名称 采样时间 等待时间 谱宽 扫描次数 采样点数: 90度脉宽: 测试结果 原始谱图 信号归属 多变量统计分析方法: 模型验证方法: 显著性变化的代谢物: 有显著性变化代谢物的相关系数值: 测试机构 测试人员: 测试日期: 机构名称 地址: 11
GB/T34059?2017 [1]Beckonerto,KeunH.c.,EbbelT.M.D,BundyJ.,IHolmesE.,LindonJ.C.,NieholsonJ.K forNMR ofurine Metabolieproffling metabolomicandmetabonomicprocedures spectroscopy atureProtocols2007,2,2692-2703. [].Na plasma,serumandtissueextracts 12

纳米技术纳米生物效应代谢组学方法核磁共振波谱法GB/T34059-2017

随着纳米技术的不断发展和应用，人们开始逐渐关注其对生物体的影响。为了深入研究纳米物质在生物体内的代谢情况和生物效应机制，需要运用代谢组学方法和核磁共振波谱法进行分析。

GB/T34059-2017标准就是针对这一问题制定的。该标准主要包括以下内容：

• 样品处理：包括样品的收集、预处理、提取等。
• 核磁共振波谱分析：包括代谢产物的鉴定和定量分析。
• 数据归一化与分析：包括核磁共振波谱数据的处理、比较和分析。
• 生物效应评价：包括纳米材料对生物体产生的影响评价。

根据这些指标，可以对纳米材料在生物体内的代谢情况和生物效应机制进行深入研究。通过核磁共振波谱法等技术手段，可以精确地定量分析代谢产物的种类和含量，为后续的研究提供了有力的数据支持。

此外，该标准还规定了样品处理、质量控制和数据分析等方面的要求和指导，以确保实验结果的可靠性和准确性。这些要求和指导为纳米技术在生物领域的应用提供了有效的技术支持和保障。

综上所述，GB/T34059-2017标准为纳米技术在生物领域的研究提供了一套完整的方法和标准，为相关领域的研究工作提供了重要的参考和支持。

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