肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法

肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法

国家标准 GB/T40225一2021 肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法 eterminationofaetinantibody一Westernblottingmethod 2021-05-21发布 2021-12-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花警理委员会国家标准
GB/T40225一2021 前 言 本文件按照GB/T1.1一2020<标准化工作导则第1部分;标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别专利的责任 本文件由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口 本文件起草单位;测试技术研究院、成都正能生物技术有限责任公司、深圳市第二人民医院、 甘肃中商食品质量检验检测有限公司、深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司、上海市计量测试技术研 究院 本文件主要起草人;李怀平,周李华、邱俊康、马丽侠、顾大勇张秦川张译文、蒋子敬、王伟、叶德萍、 何海宁洪霞、刘刚
GB/T40225一2021 肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法 范围 本文件描述了肌动蛋白抗体的免疫印迹检测方法 本文件适用于基于免疫印迹法原理的肌动蛋白抗体的测定 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中,注日期的引用文 件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于 本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 肌动蛋白actinm -类形成微丝的球状多功能蛋白质,细胞骨架的主要成分，广泛表达于真核细胞中 注1:目前发现肌动蛋白至少存在6种异构体形式,主要分布在心肌.骨骼横纹肌和平滑肌组织中,调控细胞的收缩 能力,也表达于非肌肉细胞,调节细胞结构和活力 注2:肌动蛋白分子质量为45ku士3ku(1u之1Da),具有高度保守性在细胞中的表达相对稳定因此它常被用作 校正系统的内参 3.2 肌动蛋白抗体actinantiody 以肌动蛋白为抗原,免疫动物之后获得的动物血清中能够与肌动蛋白特异性“抗原-抗体结合”的兔 疫球蛋白的总称 缩略语 下列缩略语适用于本文件 APs;过硫酸铵(ammoniumperoxodisulphate) BCA:二咋啾甲酸(bieinchoninicacid) ECL;化学发光试剂eleetrogeneratedchemiluminescence) HRP;辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase) NP40;乙基苯基聚乙二醉(NonidetP40) PBS;磷酸盐缓冲液(phosphatebuffersaline) PBST;磷酸盐吐温缓冲液(phosphatebuffersalinewithTw ween luoride MsF;苯甲基碱肤氧(Gheylmethtylsufonylno PVDF:聚偏二氟乙烯(polyvinylideneluoride)
GB/T40225?2021 SDS;?(sodiumdodeeylsulfate) TEBS;Tris?(tris-bufferedsaline TBST:Tris?(tris-bufferedsalinewithTween TEMED;???(N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine 5 ? ?,?????SDS?????? ,?,???(?),????,?п? ?м,???λú????()?б ???SDS??????ɡ ?? й涨,?÷??,??cB/T682涨 ? 6.1??PVDF? 6.2?;betaactin 6.3HRP?;HRP?IgGHRP?lgG 6.4NP-40?? 6.5PMSF 6.6CA??? 6.7CL.? 6.8TEMED 6.9? 6.10Twen-20 6.11?? 6.12???:30%?-????,A.1? 6.13??(0.5mol/LTrisHCl.pH=6.8),A.2? 6.14??(1.5nmol/1TrisHClpH=8.8),A.3? 6.15?,A.4? 6.1610??,A.5? 6.1710???,A.6? 6.181??,A.7? 6. .19 ???,A.8? 6.20 PBS?(0.1mol/Lλ?,pH=7.4),A.9? l0X 6.21 PBS?( mol/λ?,pH=7.4),A.10 0.0l 6.22 l0X TBS?(0.lmol/Trisλ?,pH=7.4),A.11? 6.23 TBS?(0.01mol/LTrisλ?,pH=7.4),A.12? 6.24???,A.13? 6.25??,A.14 6.265%?,A.15? 6.2712%?,A.16? 6.28???
GB/T40225一2021 6.29显影液 6.30定影液 6.31电泳蛋白Marker:10ku170ku. 仪器设备 7.1垂直凝胶系统 7.2二氧化碳培养箱,37C士0.5C. 7.3电泳仪;恒压不低于220V,恒流不低于400mA 推荐使用带有计时器的电源 7.4转移系统. 化学发光仪 .5 7.6电子天平,感量为0.1mg 7 离心机:适用15mL离心管,转速不低于10000r r/min 7.8旋祸振荡器 7.9pH计,精度为0.ou. 7.10移液器 样品 8.1自制的肌动蛋白抗体建议按照预估效价调整适当稀释梯度进行预试验 8.2肌动蛋白抗体产品,首次使用时可按照产品说明书进行稀释或选择适当稀释梯度进行预试验,待 确定待测样稀释比例后,后续可沿用合适的固定稀释比例 测定步骤 -般原则 9.1 9.1.1抗原可采用不同来源的细胞制备,如HeLa细胞、,293细胞等 抗体稀释比倒和抗原上样量可根据实际试验情况和肌动蛋白抗体效价进行适当调整 9.1.2 9.2抗原的制备 9.2.1当经过处理后的细胞到达处理时间或者细胞密度达到80%95%时,收集细胞 从二氧化碳培 养箱中取出细胞培养瓶,置于冰上,用移液器吸出培养液 在培养瓶中加人4C冰箱预冷30min后的 1×PEBS,缓慢平动培养瓶,使缓冲液充分洗涤细胞表面,倒掉PBS,重复操作2次3次;在最后一次洗 涤后用移液器尽可能吸干残留的缓冲液,以洗去瓶中残留的培养基 注意全程在冰上操作 9.2.2向培养瓶中加人4C冰箱预冷30min后的NP40 裂解液(每75cm'培养瓶约加1mL),放置在 冰上裂解20min 然后用细胞刮子沿着瓶壁刮细胞 吸出刮好的细胞裂解液置于15mL离心管中(置 于冰上) 9.2.3重复步骤9.2.2,尽可能将多的细胞裂解液收集到15mL的离心管中,插人冰盒进行超声,超声 强度以不产生泡沫为准,超声每次2s3s,重复3次 如仍有细胞碎片或沉淀,宜4C,l0000r/min 离心10min,取上清 9.2.4取出少量细胞裂解液测定蛋白浓度(可用BCA蛋白测定试剂盒测定),其余细胞裂解液可分装 保存在一70C以下备用
GB/T40225一2021 9.3抗原内参储备液的制备 抗原内参储备液母液制备;称取肌动蛋白粉末1mg(精确至0.1mg),加人1m蒸僧水溶解,使母 液浓度为lmg/ml 9.4SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 g.4.1检查配胶装置,安装制胶配件,制胶滥胶(可使用商品化预制胶),组装电泳槽,注人电泳缓冲液 9.4.2关于分离胶浓度选择;按照目标蛋白分子质量范围选择待配制分离胶的浓度,见表1 肌动蛋白 分子质量为45ku士3ku,可选择8%12%浓度的分离胶,本文件给出了12%分离胶的配制,见A.16 表1目标蛋白分子质量与分离胶浓度关系表 分离胶浓度T/% 蛋白质分子质量范围/ku 25200 10 15100 12 1070 15 12~45 440 20 注:来源参考:Abeam g.4.3抗原上样前需与2×上样缓冲液等体积混匀,95C变性5nmin 用2×上样缓冲液稀释抗原内参 至10ng/L,95C变性5min 变性后的抗原和抗原内参按照规定上样量上样 抗原可参考54g、 04g,204g、404g,60"g总蛋白/泳道的上样量进行上样,抗原内参可参考50ng/泳道进行上样 建 议在邻近的齿孔加人5L电泳蛋白Marker g.4.4将电泳槽连接电源进行电泳,注意正负极的区分 电压调至80V120V,分离胶电泳时间为 h2h或直至澳酚蓝到达分离胶底部时,停止电泳 g.5印迹培养 9.5.1电泳结束后比照Marker的大小,选择包含抗原内参凝胶部分,轻轻切下后将凝胶取出,放置于 4C冰箱预冷30min的1×转移缓冲液中 9.5.2按照即将切下的目的胶块的大小来剪相应大小的硝酸纤维膜或PVDF膜,剪下后在左上角剪小 角以区分正反面,后将其浸泡于甲醇中活化约1min;之后取出放到配制好的1×转移缓冲液中平衡超 过5 min 9.5.3将转膜夹放于盛有1×转移缓冲液的盘中,白板阳极)在上,黑板(阴极)在下,由下向上依次放 置1块海绵、3层5层滤纸,用玻璃棒轻轻赶走气泡后,放上已平衡好的硝酸纤维膜或PVDF膜,注意 不要有气泡,再放切好的凝胶、3层5层滤纸、1块海绵 最后合上转膜夹,将其放置于转膜槽中 g.5.4转膜槽中倒人4C冰箱预冷30min的1×转膜液,加人冰块,盖上转膜盖 然后将转膜槽放置 于泡沫箱中,加人冰水混合物,以防止转膜过程中产生的热量 检查电极方向并连接电线 在180mAN 恒流(或90V恒压)条件下,转移时间为1.5h 9.5.5转膜结束后,确认Marker是否转移成功 将硝酸纤维素膜或PVDF膜浸没在丽春红染色液中， 摇动5min一10min或更长时间;取出印迹膜,用蒸溜水或1×PIs当溶液漂洗2次一3次,可出现清晰 条带,记录结果 弃去凝胶
GB/T40225一2021 g.6免疫反应 9.6.1封闭 将印迹膜轻轻取出后,放置于封闭缓冲液中,室温条件下摇床2h或者置于4冰箱中封闭8h 12h 9.6.2孵育一抗 将待测样品抗肌动蛋白抗体与封闭缓冲液按照1 :2500,1:5000,1:10000,1:20000， l:40000比例混合 将印迹膜置于10m该混合液中,避免产生气泡,室温条件下轻轻摇动2h或者 4C冰箱孵育8h12h. 9.6.3洗涤一抗 将印迹膜置于20ml洗膜缓冲液中,置于摇床上,室温缓慢平摇10min,随后倒掉并更换新的洗膜 缓冲液,重复操作3次 9.6.4孵育二抗 将HRP标记的二抗与封闭缓冲液按照1:5000比例混合 将印迹膜置于10ml该混合液中,室 温条件下轻轻摇动,37C孵育1h 二抗的来源应与一抗保持一致 9.6.5洗涤二抗 步骤与9.6.3相同 9.7信号采集 9.7.1洗膜完毕后,准备剪刀、锻子发光液等显影相关工具和试剂 取等量的BCLA.B液说匀,暗室中打开红外灯,不应有任何白炽光.将混合液加于印迹膜上反 9.7.2 应1min~2min 混合液的量按照印迹膜的数量配制,一般约1mL/张 9.7.3在显影板上依次放上保鲜膜、印迹膜、保鲜膜 装人化学发光仪中进行信号采集和图像收集 9.8分子质量测定 待测样品应在45ku士3ku位置出现肉眼可见的相应大小条带 也可使用图像处理软件做条带灰 度值分析,定量分析阳性的显著性 g.9效价验证 g.9.1按照20g总蛋白/泳道的上样量,待测样品按照9.5.2的要求进行稀释,各稀释度均应出现 45ku士3ku大小条带,每个稀释梯度条带大小一致,条带信号从1:2500至1:40000逐渐减弱 抗 体1:40000稀释比应有明显阳性信号 图谱见附录B 0g.0昭总蛋白/冰道的上样量进行免疫印迹检测,待测样品稀释比 g.9.2按照54g、10"g,204g、407 为1:10000进行测试 待测样品中均应出现45ku士3ku大小条带,每个上样量条带大小一致,条带 信号从5g总蛋白/泳道至60g总蛋白/泳道逐渐增强 抗体检测54g总蛋白/泳道的上样量应有明 显阳性信号 图谱见附录B g.10物种反应 分别用NIH3T3细胞(小鼠细胞),C6细胞(大鼠细胞),cOS7细胞(猴细胞),CHO-K1细胞仓鼠 细胞)代替HeLa细胞(人细胞)样品进行测试,待测样品稀释成1;10000后进行测试 各细胞样品均
GB/T40225一2021 应出现45ku士3ku大小条带,大小一致,信号均为显著的阳性信号 9.11稳定性试验 将抗体原液放于密闭的、,内壁硅化处理的聚丙烯管中,置于37C士0.5C二氧化碳培养箱进行热 处理7d 对照抗体置于一20C存放7d 两组样本处理后在室温进行目测及采用分光光度法测定吸 光度OD,目测没有显著沉淀,吸光度偏差小于10%视为无质量变化 g.12抗体特异性 免疫印迹检测不同物种细胞应在45ku士3ku位置观察到单一目的条带,且可与肌动蛋白标准物 质或商品化的肌动蛋白在同一位置检测出条带 10质量保证和控制 0.1人员 从事肌动蛋白抗体检测的技术人员应具备免疫学、化学或相关学科的理论基础知识,应完全了解细 胞培养的相关工作,掌握免疫印迹法检测等相关基础实验 10.2仪器设备 应定期对相关检测仪器进行检定或校准 10.3试剂 肌动蛋白抗体检测涉及的相关试剂需从具备专业资质并经过验证核实的供应商处采购,且具备检 验合格证明文件 检测涉及的细胞应按照国家相关指导性文件要求使用和管理 检测试剂的使用应具有严格的文件记录制度,包括试剂的标识、使用时间等信息 0.4实验室通用要求 免疫印迹检测实验室应满足生物安全一级(EBSL-l)实验室要求,遵循分区明确单一流向、因地制 宜,方便使用的原M. 细胞房应按照国家相关文件要求建设和管理 0.5样品保存 贮存于-20C士1C冰箱,避兔反复冻融 1 结果报告 肌动蛋白抗体检测后应附试验报告或等同的指导性文件,文件内容应至少包括以下部分 产品名称; a b) 抗体总量; 抗体分子质量 c 效价范围 d 物种验证; e D 抗体保存条件及期限
GB/T40225一2021 附 录 A 规范性 试剂配制 A.1聚丙烯酰胺凝胶储液 Aer(丙烯酰胺 29g Bis甲叉双丙烯酰胺 1g 100ml 加蒸馏水定容至 将上述各成分充分溶解于80mL蒸水,加蒸水定容至100ml,过滤后置于棕色瓶中,4C可贮 存30d60d A.2浓缩胶缓冲液;0.5mol/LIrisHHCI,pH=6.8 Trisbase(Tris碱 6g 加Hcl调pH至6.8 pH=6.8 100m 加蒸僧水定容至 将上述Ti、base充分溶解于80mL蒸憎水,加6mol/L盐酸调pH至6.8,加燕圜水定容至100mlL 储存于4C A.3分离胶缓冲液:1.5mol/LIrisHCl,pH一8.8 Trisbase(Tris碱 18.15g 加HCI调pH至8.8 pH=8,8 100ml 加蒸馏水定容至 将上述Tisbase充分溶解于80ml蒸憎水,加6mol/L盐酸调pH至8.8,加蒸憎水定容至100 m， 储存于4C A.4上样缓冲液 0.5mol/LTrisHClpH6.8 5ml SDS 0.4 g 2mL Glycerol甘油 3筑基乙醇(ME 0.4ml. 20mg BromophenolBlue(EBPB,澳酚蓝 加蒸水定容至 10ml 注最后加甘油和BPB. 将上述0.5mol/LTrisHCISDs及适量加蒸馏水(控制三者总体积<8mL),搅拌充分溶解;再 加人P-ME,BPB,搅拌充分溶解,加蒸水定容至10mL,储存于4C A.510×电泳缓冲液 Trisbase(Tris碱 31g 188 Glycine(甘氨酸 SDS l0g
GB/T40225?2021 1000mL ? Trisbase,Glycine,SDS?800m?,?1000ml, ? A.610??? TrisbaseTri 58s g 29 Glyeine(? g SDS 3.7g ? 1000mL ?10???,??1???,?????20% Trisbase,Glyeine,SDS?800mL??,??1000mL, ? 1?? A.7 10?? 100mL ? 1000ml 100ml10?????1000ml,?,4C A.81??? 10??? 00ml Methonol(? 200mL ? 1000ml ???. 100ml10???600mL??,?200mL?,? 1000mL,4C A.910PBs?(0.1mol/Lλ?),pH=7.4 (KHPO 2.4 g 14.4 (NaeHPO g ?(NaCI 80g ?(KCI 2g ? 800ml HclpH7.4,? 1000ml ???800mL?,6mol/pH7.4,?1000ml ? A.101Ps?(0.01mol/1λ?),plH=7.4 ?;:A.9100ml10PEBS????1000ml,?,4C ;?,???800nmL?,6mol/1pH7.4, ??1000mL,??>20min(?),?4 (KH.PO 0.24 g 1.44 (NaeHPO g
GB/T40225一2021 氯化钠(NaCI 8g 氯化钾(KCI 0.2g 加蒸水至 800ml 加H(Cl调节pH至7.4,加蒸憎水定容至 1000ml A.1110×TB缓冲液(0.1mol/LTris盐缓冲液),plH=7.4 Tris-baseTris碱 30g 氯化钠(NaCI 80g 氯化钾(KCIy 2g 加蒸水至 800ml 1000ml 加HCl调节pH至7.4,加蒸僧水定容至 将上述成分充分溶解于800mL燕馏水,加6mol/L盐酸调节pH到7.4,加蒸馏水定容至1000 ml， 储存于室温 A.121×TSs缓冲液(0.01mol/1Iris盐缓冲液),p=7.4 方法一:将A.l1中100mL10×TS缓冲液用蒸懈水稀释并定容至1000mL,充分混匀,储存于 4 方法二按照如下配方,将各成分充分溶解于800ml蒸憎水,加6mol/1 盐酸调节pH到7.4,加 蒸憎水定容至1000mL,高温高压灭菌>20nmin(可选做),储存于室温或4C Tris-base(Tris碱》 3g 氯化钠(NaCl 8g 0.2 氯化钾(KCI g 800ml 加蒸僧水至 加HCI调节pH至7.4,加蒸馏水定容至 1000m A.13洗膜缓冲液;即TBST或PST,含0.1%Iween-20的1×TBs或PBSs缓冲液 0×TS或10×PBs 100ml Tween20 11 g 1000m 加蒸馏水定容至 称取上述Tween-20,1l00mL10×TES或10×PIES缓冲液,加蒸僧水混匀、稀释并定容至1000mL g 储存于室温或4 A.14封闭缓冲液;即含5"%脱脂奶粉的IBsT或PBsr 脱脂牛奶 5g 100ml 洗膜缓冲液 封闭缓冲液现用现配 称取上述脱脂牛奶5g,充分溶解于100ml洗膜缓冲液中,储存于4 A.155%浓缩胶 5%浓缩胶的组分见表A.1
GB/T40225一202 表A.15%浓缩胶的组分 各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量/ml 各种组分名称 10 H.O 0.68 2.7 5.5 2.l 3.4 4.l 6.8 10%APs 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.,06 0.08 0.l 30%Aerylaminde 0.17 0.33 0.5 0.67 0.83 1.0 1.3 1.7 10%SDS 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.08 0.1 1.0mol/LTris-HClplH6.8) 0.13 0.25 0,38 0.5 0.63 0,75 1.0 1.25 TEMED 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0.006 0,008 0.01 按照上述体积配制,在最后一步配制时,加人TEMED和10%过硫酸铵 A.1612%分离胶 12%分离胶的组分见表A.2 表A.212%分离胶的组分 各种凝胶体积所对应的各种组分的取样量/ml 各种组分名称 10 15 20 25 30 40 50 10% SDS 0.05 0. 0.15 0,2 0.25 0.3 0.4 0.5 30%Aerylaminde 2.o 6.0 8.0 10.0 12.0 16.0 20.0 4.0 1.5mol/1.Tris-HCl(pH8.8 1.3 3.8 5.0 6.3 10.0 12.5 2.5 7.5 H.O 1.6 3.3 4.9 6.6 8.2 9.9 13.2 16.5 0%APs 0.05 0.1 0,15 0.2 0.25 0,3 0.4 0.5 TEMED 0,002 0,004 0.,006 0.008 0,01 0.012 0.016 0.02 按照上述体积配制,在最后一步配制时,加人TEMED和10%过硫酸铵 0
GB/T40225一2021 附录 B 资料性 效价验证 204g总蛋白/泳道的上样量的显影图谱见图B.1,抗原样本不同上样量下肌动蛋白抗体效果测定 的显影图谱见图B.2 D S UP S 1:500o0 ku 1:25 拿 180 130” 95 72 55 43 34 20gwel总蛋白 图B.120g总蛋白/泳道上样量的显影图谱 ku 2)s 60s o 6" 180 130 95- 72 55 43 34- 110000 图B.2抗原样本不同上样量的显影图谱
GB/T40225?2021 [1] HamssD,RackwoodD.GdBletrhoesisPotcins:APnetea.Appch,Third. OxfordUniversityPress,l998

肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法GB/T40225-2021

该标准主要针对肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法进行了规范和标准化。其中，免疫印迹法是目前常用的检测肌动蛋白抗体的方法之一，其基本原理是将待测样品中的蛋白质经SDS-PAGE电泳分离后，转移至聚丙烯酰胺凝胶膜上，再通过特异性抗体的识别来检测肌动蛋白抗体。

标准对肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法进行了详细的技术要求和规范，包括样品的制备、SDS-PAGE电泳分离、凝胶转移、膜上反应、显色等方面。例如，对于样品的制备，需要注意避免误差的产生，保证实验结果的准确性；对于SDS-PAGE电泳分离，需要控制好电泳仪的电流和时间，以确保蛋白质能够充分分离。

此外，标准还规定了肌动蛋白抗体检测中常见问题的处理方法，例如样品溶解不完全、印迹膜上信号弱等情况的解决办法。

通过这一标准的制定，可以更加规范和标准化肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法，提高其可靠性和精度，为临床医学研究和诊断提供支持。

肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法的相关资料

和肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法类似的标准

GB/T40225-2021

肌动蛋白抗体的检测免疫印迹法

2022/7/14 13:27:18 现行