白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法

白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法

国家标准 GB/T28630.4一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 Diagn0sticprotocolsforwhitespotdisease Part4:lHistopatholomethod 2012-07-31发布 2012-11-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28630.4一2012 前 言 GB/T28630(白斑综合征(wSD)诊断规程》分为五个部分 -第1部分:核酸探针斑点杂交检测法 第2部分;套式PCR检测法; 第3部分;原位杂交检测法; 第4部分,组织病理学诊断达 第5部分;新鲜组织的TE染色法 本部分为GB/T28630的第4部分 本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草 本部分由农业部提出 本部分由全国水产标准化技术委员会(SAc/Tc156)归口 本部分起草单位水产科学研究院黄海水产研究所,农业部全国水产技术推广总站 本部分主要起草人;黄健、杨冰,陈爱平,宋晓玲,史成银、杨丛海、魏琦、,刘莉
GB/T28630.4一2012 白斑综合征(wSD)诊断规程 第4部分:组织病理学诊断法 范围 GB/T28630的本部分规定了白斑综合征组织病理学诊断法所需试剂与材料、仪器设备、操作步骤 和结果判定 本部分适用于对发病的对虾或其他敏感宿主的确诊和对怀疑染病宿主的诊断 本部分不适用于对潜伏性感染或病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测 原理 2.1白斑综合征的病原和病理学特征 白斑综合征(white SpotSyndro1 nme)又称白斑病(whitespot disease)白斑综合症、对虾暴发性流行 病 白斑综合征具有发病急和死亡率高的特征,其症状是发病对虾停止摄食,反应迟钝,或卧于池边或 在水面浮游,某些濒死对虾在甲壳上出现白色的斑块,有时伴随对虾腹节微微变红 白斑综合征的病原是白斑综合征病毒( s,wSSV)或称白斑病毒(white whitespotsyndromevirus， s,wsV),它是一种双链DNAdsDNA)病毒,能对大多数养殖对虾造成有致命的感染 病毒 spotvirus， 1290 粒子为长椭圆形,具有囊膜和独特的尾状物,直径120nm150 nm,长270nm )nm,其基因组大小 约300kb 病毒在细胞核内复制,不形成封闭体(occlusionbody) 濒死虾在全身外胚层和中胚层起源的组织中呈现出病灶,病毒主要感染的组织包括甲壳下上皮(包 括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠上皮),造血组织、、结缔组织、触角腺、血细胞和淋巴器官 等 感染早期在核内形成的包涵体(inelusion)呈嗜酸性,随着病毒的快速复制,造成核内染色质边移 细胞核肥大,包涵体的嗜碱性也越来越强 2.2技术原理 苏木精-伊红(H-E)染色在组织学和病理学中是一种常规染色方法 通过染色液 -苏木精-伊红 与组织细胞的不同组分分别相结合,使细胞核、细胞质和细胞内其他结构产生反差明显的蓝紫色和红 色,而可清晰地观察到各种不同的组织结构病理变化 试剂和材料 3.1除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和燕水或去离子水或相当纯度的水 3.2石蜡(熔点52C一54);切片级 3.3二甲苯 3.4无水乙醇 3.595%乙醇 3.6过滤海水;盐度为20~30的海水在室内放置1周后,经滤纸和0.22Am滤膜过滤 3.7戴维森氏AFA(Davidson'、AFA)固定液:见附录A的规定
GB/T28630.4一2012 r-BennettHe 3.8迈尔-班尼特苏木精(Mayer ematoxylin)染色液:见附录A的规定 3.9伊红-焰红染色液;见附录A的规定 10粘片剂:见附录A的规定 33 3.1185%乙醉,见附录A的规定 3.1280%乙醉,见附录A的规定 33. .1375%乙醉;见附录A的规定 33. .1450%乙醇;见附录A的规定 3 15阳性对照为受wssV感染且显示明显病理变化的对虾组织切片(苏木精-伊红染色 3. 16阴性对照为未受wssV感染的正常的对虾组织切片(苏木精-伊红染色 仪器设备 4.1石蜡切片机;满足4Am7Am厚度的石蜡连续切片要求 4.2程控组织脱水机或使用手工脱水步骤 3 4 石蜡包埋机或使用手工包埋步骤:满足石蜡切片机对石蜡块规格的要求 4.4程控切片染色机或使用手工染色步骤 4.5展片水浴锅;敞口,无盖水浴锅或使用自制保温盒加一定温度的水代替 4.6平板烘片机;室温至100C或使用恒温箱代替 4.7显微镜;带高修镜(0x)和油镜00x 4.8毛笔 4.9小慑子 4.10载玻片 4. .11盖玻片 4. 12玻片架 操作步骤 5.1样品准备 5.1.1样品采集的要求和固定方法见附录B的规定 5.1.2在制作切片前,按照附录B的方法进行取材修整,应保证标本的胃和腮能被有效地切片 5.2脱水 75%乙醉(105min)-85%乙醉(105nin)--85%乙醉(l05min)-95%乙醉(45min)-95%乙醉 45min)-无水乙醇(45min)-无水乙醇(45min) 5.3透明 无水乙醇-二甲苯(1:1,25min)--二甲苯(20min)--二甲苯(20nmin) 5.4浸蜡 纯石蜡(80min)一纯石蜡(80min) 5.5包埋 用石蜡包埋机进行包埋
GB/T28630.4一2012 5.6切片 用石蜡切片机切片,厚度5m 对每个石蜡包埋块至少切取两块不连续的切片 5.7展片 展片水浴锅(40)中展片,用涂有一层粘片剂的载玻片捞出,置于平板烘片机上于45C烘片2h 5.8染色 二甲苯(5mim)-二甲苯(5mim)无水乙醉(2min)无水乙醉(2min)一95%乙醉(2min)一 95%乙醉(2min)80%乙醉(2min)-80%乙醇(2min)50%乙醇(2min)蒸懈水(2min)蒸懈 水(2min)蒸僧水(2min)迈尔-班尼特苏木精染色液(5mim)--缓慢流动的自来水(Gmin)伊红 焰红染色液(2min)-95%乙醇(80s)-95%乙醇(2min)-无水乙醇(2min)-无水乙醇(2min)- 甲苯(150s)-二甲苯(150s)--二甲苯(150s). 5.9封片 滴加2滴中性树胶封片 5.10观察 明视野显微镜下观察 结果判定 正常样品的组织切片经H-E染色后,核质反差明显,细胞质染成红色，细胞核染成蓝紫色 6.2白斑综合征的病灶主要出现在对虾的甲壳下上皮(包括体表和附肢的甲壳下表皮、胃上皮和后肠 上皮),造血组织、结缔组织,飓,触角腺、血细胞、淋巴器官等组织中,最方便观察的组织是覆盖有甲壳质 的胃上皮 在肝胰腺管上皮、中肠上皮和肌肉细胞中无感染病灶,但在这些组织中的结缔组织和血细胞 中可见到病灶 6.3受感染的细胞,其细胞核的核仁消失,早期感染在核内出现嗜酸性着色(显红色),晚期感染的细胞 核肿大,染色质边移,核内呈不同程度地较均匀的嗜碱性着色(紫色) 核内嗜酸性着色(显红色),较深 且均 6.4诊断结果可疑时,补充核酸探针的原位杂交检测或PCR检测进行确诊
GB/T28630.4?2012 ?A 淶?? ?? A.185%? 95%? 850mL 950 ? ml ,档 80%? 800mL 95%? 950mL ? ,档 A.375%? 95%? 750ml ? 950ml , A.470%? 95%? 700ml ? 950mL ,档 A.550%? 95%? 500mL ? 950mL ,档 6 ??AFADavidson'sAFA)?? A 330 95%? ml 220mL ?(37% 115mL ?(??)?335ml ,?档
GB/T28630.4?2012 A.7R-F?? 95%? 407ml 349 ?(37% ml ?(??)?222ml ,??(28%30%NH,)?22mlplH6.07.0. ?档 A.8-???? 1000mL ? ? 1.0 g 0.2g 90.0g 1.0g ?? 50.0g ?,????,档 A.91"%? Y(? 5g ? 500ml ???,档 A.101%? B(? lg ? 100mL ???,档 A.11-??? 100 1%? ml 1%? 0ml 780ml 95%? 4 ml ????,档 A.12?? l 100ml ?
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GB/T28630.4一2012 附 录 B 规范性附录 甲壳类动物疾病诊断采样原则与方法 B.1采样目的 甲壳类动物的疾病诊断通常出于三个目的之一 疾病流行状况的监测 b种苗或场地的健康证书; 疾病发生后的诊断 c 对于不同目的进行分析所需的样品类型和数量极不相同 B.1.1疾病发生后的诊断 在临床发病的情况下,应从活的或濒死的甲壳类动物中仔细选择带有特征性病灶的高质量标本,强 调标本应具有代表性,并且是濒死的或临床发病的 避免采集死后的标本,采样时要根据诊断方法考虑 样品所需的保存条件 要对已发生的疾病进行诊断,建议最少采集100个幼体标本,50个后期幼体(如仔虾、仔蟹)标本、 10个稚体(如幼虾,稚蟹)或成体如成虾,亲蟹等)的标本 如果临床病症明显,可采集更多的数量 过,上述推荐的“最少”数量只是一个指导性的参考量,应强调仔细选择标本的质量比随便捡出上百个标 本来充数要更有价值得多 B.1.2对无症状的甲壳类动物的诊断 要监测疾病流行情况、或检测无症状感染的病原,或核准健康证书,所需的采样数量就应该用统计 学方法来确定 先假定感染的检出率大于或等于2%,5%,10%,20%等,再对不同大小的群体计算所 需的最少样品数量,该数量应能使样品中出现感染标本的概率满足95%的可信限 对不同大小的群 体,所需要的采样数量已被计算成预定的表格(参见表B.1 为了监测疾病流行或核准健康证书,对不同大小的群体进行诊断所需的样品数量应与表B.1相 符,并取其最低的假定检出率,即2% 为了诊断群体中似乎存在的无症状感染,可假定检出率高于5%,从表B.1查出所需的采样数量 表B.1各种大小的群体在推测病原检出率不同时满足95%可信限的采样数量 各假定检出率的采样数量 群体大小 20% 30% 40% 2% 5% 0% 50% 50 35 20 50 l0 75 45 23 100 10 50 25 250 110 10 55 26 500 130 10 55 27 1000 140 10 1500 l40 55 27 10
GB/T28630.4一2012 表B.1(续 各假定检出率的采样数量 群体大小 5% 0% 50 2% 20% 30% 40% 2000 145 60 27 10 27 145 4000 60 10 10000 60 27 145 10 >100000 150 60 30 10 注表格中的采样数量是指实际被有效分析的样品数,如果所采集到的样品不一定每份都能分析到,则应采集更 多样品 例:对于100000尾仔虾的群体来说,在60尾样品中查出3尾阳性,则该群体存在5%病原检出率 的结果具有95%的可信度 对不同病原的监测,还应注意最适于采样的生活期有差异 例如,要监测对虾杆状病毒病、斑节对 虾杆状病毒病或杆状病毒的中肠腺坏死,最佳采样期是幼体和早期仔虾;要监测涛拉病、白斑综合征和 黄头病,最佳采样期是幼虾和亚成年虾;要监测整虾瘟,最佳采样期是幼整虾和成年整虾 B.2不同诊断方法所需样品的采集要求 B.2.1直接显微镜检查或组织印片/涂片染色检查的样品 用于直接镜检的样品应在采集后立即处理,起码要求能做到制备好风干的组织印片或涂片 待检样品尽可能使用活标本,如果得不到活标本,至少也应使用冰鲜或用缓冲的10%甲醛(37% 固定的标本 B.2.2组织学诊断的样品 B.2.2.1采样时样品要求 采样时,应尽量减轻对动物造成的胁迫,固定前需要运输或临时暂养时要保证水中有充足的含 氧量 B.2.2.2固定液要求 谁备好充足的同定液一般原则是一体积的组织样品最少应十馆体积的同定液(例如,0g对虾组 织应要100ml固定液) 大多数组织学诊断都可使用戴维森氏AFA固定液(见附录A) 该固定液可快速渗透,能有效阻 此甲龙类的组织自游且其般性可使甲脱悄 如果样品要准备进行免疫组织化学分析或进行RNA病毒的原位杂交诊断,可采用非酸性的RF 固定液(见附录A) 但R-F固定液不应该用于常规组织学样品的固定,因为它对组织的渗透较慢,且 不能使甲壳脱钙,用它固定的组织可能会导致切片和染色困难 B.2.2.3不同样品的固定方法 幼体和仔虾,用细筛绢或吸管选取标本 将采集的个体直接浸人10倍体积的固定液中,固定12h一 24h然后转移到70%乙醇中长期保存 大的仔虾和小的幼虾:按上述方法选取并采集标本 用注射针尖或解剖刀尖划破甲壳,将采集的个
GB/T28630.4一2012 体直接浸人10倍体积的固定液中,固定12h24h,然后转移到70%乙醇中长期保存 大的幼虾以及成虾;用注射器将体重5%10%的固定液注射到活虾体内 先对肝胰腺区域分 2处~3处进行注射,然后将固定液注射到第1,第3和第6腹节 头胸部,特别是肝胰腺区域应该多注 射一些 注射使虾完全死亡,然后立即用解剖刀片划开甲壳,在头胸区的划口沿着头胸甲中线的右侧 在腹节区的划口沿着腹节右侧的中部 再将个体浸人10倍体积的固定液中,固定24h,然后转移到 0%乙醉中长期保存 体重大于12g的虾或蟹;按上述方法注射并划破甲壳,然后将虾体在头胸和腹节连接处的后面横 切,如果虾体较大,再在腹节中部横切 将各部分浸人10倍体积的固定液中,固定24h,如果个体较大 或甲壳较硬,应延长固定时间,直到72h,然后转移到70%乙醉中长期保存 个体很大的虾或蟹;注射固定液后,对个体解剖,取出应进行组织学分析的组织或器官,分别浸人 10倍体积的固定液中,固定12h一24h,然后转移到70%乙醉中长期保存 B.2.2.4样品编号、登记和标签 在采集样品时应对标本进行编号和登记,并根据编号记载标本的全部说明档案,包括标本种名.龄 期,重量或大小,来源、个体症状,群体健康状态以及其他相关信息 要使用抗水的纸条或毛面塑料纸做样品标签,并用2B铅笔在标签上注明标本登记编号及其主要 说明,将标签直接放人与该标本相同的含固定液包装中,不要用钢笔、圆珠笔或记号笔作标签 B.2.2.5样品的包装和运输 大体积的固定液或含乙醇溶液不能进行邮寄或运输,样品运输前应进行相应的处理 在运输前 12h,将样品从70%乙醇中转移到50%的乙醇中保存以降低样品中的乙醇含量 包装前将样品从50%乙醇中取出 幼体、仔虾或小的幼虾标本转移到具密封圈的螺口聚丙烯塑料 管中,放人标签,再填充少许吸水纸,然后用50%乙醉浸透,盖紧管帽;较大的标本用3层一5层白色纸 巾完全包裹,将纸巾包裹的标本放人一个厚的枭丙烯塑料袋中,用50%乙醇浸透纸巾,在袋内放人标 签,将塑料袋用热塑封口机熔封 将上述塑料管或塑料袋用2层吸水纸包裹,放人一个厚塑料袋中并完全密封 多个小塑料袋再封 个较大的塑料袋内,最后所有的塑料袋放人一个抗压的运输用包装箱内,填人防压充填物,进行邮 寄或运输 B.2.2.6组织学标本修整的取材 从50%或70%的乙醇保存液中取出固定好的标本,置于木头或塑料垫板上,根据标本的大小进行 修整,以便确保感兴趣的组织能被有效切片 幼体或仔虾;用擦镜纸将个体包好,放于脱水盒中进行脱水,包埋时去掉擦镜纸,用热毁子调整标本 在包埋模具中的位置进行整体包埋 小于3cm的幼虾;用单面刀片或解剖刀沿对虾的中线右侧将标本纵剖两半 如果虾体较长,再从 第2腹节处横切两半 取包含中线的左侧进行脱水,包埋时纵切面向下包埋 大于3cm的幼虾或亚成年虾;用单面刀片或解剖刀从对虾的头胸和腹节连接处切断,再将头胸沿 中线右侧纵剖两半 取包含中线的左侧,切去步足80%的长度,剔净胃内容物;如果头胸长度大于 ,切取包含胃部和肝胰腺部分的1cnm以下的部分;如果厚度大于0.5cm,削去高出0.5cm的部分 lcm， 再从不含中线的右侧头胸部斜切下腮区 将切取的含中线左侧头胸部和切下的腮区放人同一个脱水盒 进行脱水,包埋时将含中线左侧头胸部的纵切面向下,腮区的纵切面向上,前后对错地放人同一个包埋 模具中包埋 如果需要对腹节部分进行组织学分析,选取感兴趣的腹节或第1,第3和第6腹节,从 第1和第3腹节横切出厚度不超过0.5cm的段,对第6腹节纵切,分别脱水和包埋
GB/T28630.4一2012 大于8cm的虾或蟹;参照上述修整方法,按照长宽不超过1cmX1cm,厚度不超过0.5cm的要求 对感兴趣的组织所在的区域进行修整;对特定的组织或蟹的组织,也可考虑进行横切,甚至独立地解剖 出相应的组织器官,按需要分别进行脱水和包埋,胃和肠道中的内容物应剔除干净以免损伤切片刀. B.2.3分子生物学或免疫学诊断的样品 B.2.3.1样品采集和保存要点 用于PCR,RT-PCR或核酸探针斑点杂交检测的样品应注重保护病原的核酸 用于抗体的免疫分 析检测的样品应注重保护病原的抗原活性 用于核脆检渊酸抗体检渊的样品应十分小心地防止各样品间的交又污染,每个样晶应使用新的 次性塑料袋或塑料管和内置标签 不同的样品采集和保存方法对不同的检测方法的适用性有差异,并且可能应增加一些辅助的样品处理手 段,因此在样品采集和运输时要注明曾使用过的保存条件,使实验室能根据其保存条件进行相应处理 B.2.3.2不同类型样品的采集和运输 B.2.3.2.1活标本;活标本可在现场处理或以活体形式运输到诊断实验室 B.2.3.2.2血淋巴;许多分子生物学或免疫学检测的首选样品是血淋巴,样品可用注射器从心脏、腹 部血窦采集,或切断附肢采集 B.2.3.2.3冷藏标本;应经24h以内运输到实验室进行分子生物学或免疫学检测的样品可采用这种 方法保藏 运输前,应将各样品独立装袋,用足量的冰将样品塑料袋埋人泡沫塑料箱中,进行合适的包 装后运输到实验室 B.2.3.2.4深冻标本;采集活标本,用干冰或用低于一20C的冰柜速冻,将标签放人独立的样品包装 袋,用足量的干冰将样品包装袋埋人泡沫塑料箱中,进行合适的包装后可满足较苛刻的运输要求 B.2.3.2.5乙醇保存的样品;对于难以用冷藏或冷冻方法存放和运输样品的情况,可用90%一95%的 乙醉来保存和运送某些类型的样品 小于2g一3的个体,解剖出的组织或抽取的血淋巴可保存于 90%一95%的乙醇中,做好相应标签,运输前1h,将保存的标本转移到50%的乙醇中,然后按B.2.2.5 的方法进行包装和运输 B.2.3.2.6特殊采样液保存的样品;一些特定的分子生物学或免疫学检测方法或试剂盒提供了样品 的采集、保存和运输用试剂,可为样品的保存、运输和后续的检测操作提供便利 如SEMP-SsC采样液 可用于斑点杂交检测的核酸样品的保存和运输,SEMP-Tris采样液可用于PCR和核酸探针检测的核 酸样品保存和运输,TrizolIM)可用于RT-PCR样品的保存和运输等 但要注意,不同的采样液保存的 样品通常只适用于该试剂指定的检测方法,而并不一定适于进行其他的诊断 1 这是适合的市售产品的实例 给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对这一产品的认可 10

白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法GB/T28630.4-2012

什么是白斑综合征？

白斑综合征是一种口腔黏膜疾病，其特点为口腔内出现不同形态、大小、数量和分布的白色斑块或红斑，严重者可发展为癌前病变或癌变。该病病因尚不明确，可能与免疫紊乱、遗传和环境因素等多个因素有关。

组织病理学诊断法

组织病理学诊断法是WSD诊断的重要手段之一，主要通过对患者口腔黏膜组织标本的显微镜检查来确定病变类型、程度和分布情况。国家标准GB/T28630.4-2012对该诊断方法进行了详细规定，下面将对其主要内容进行介绍。

标本获取

标本获取应在严格无菌条件下进行，可采用局部麻醉后切取口腔黏膜病变组织或用钳夹取表浅溃疡、白斑等组织标本，并尽可能保持完整性和代表性。

处理与染色

所得组织标本应立即放入10%中性缓冲福尔马林液中固定，经过去水化、脱脂、透明、浸渍、包埋等多道工序处理后，制备成为可以供显微镜观察的薄切片。根据需要，可使用常规染色、免疫组织化学染色、原位杂交等染色方法。

诊断结果解读

组织病理学检查结果包括病变类型、程度和分布情况等信息，结合临床表现和其他检查结果进行综合分析后，可做出最终的WSD诊断和治疗计划。

总结

WSD是一种常见的口腔黏膜疾病，组织病理学检查是诊断该病的重要手段之一。国家标准GB/T28630.4-2012对该诊断方法进行了详细规定，医生应根据标准要求进行操作，确保诊断准确性和临床应用价值。

白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法的相关资料

和白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法类似的标准

GB/T28630.5-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第5部分：新鲜组织的T-E染色法

2022/10/28 19:16:17 现行

GB/T28630.4-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法

2022/10/28 19:13:08 现行

GB/T28630.3-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第3部分：原位杂交检测法

2022/10/28 19:05:21 现行

GB/T28630.2-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第2部分：套式PCR检测法

2022/10/28 18:57:52 现行

GB/T28630.1-2012

白斑综合征(WSD)诊断规程第1部分：核酸探针斑点杂交检测法

2022/10/28 18:47:59 现行