猪流感HI抗体检测方法

猪流感HI抗体检测方法

国家标准 GB/T27535一2011 猪流感H抗体检测方法 Detectonmethodofhem#gelutnatoinhihiton.antihody againstswineinfluenza 2011-11-21发布 2012-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T27535一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口 本标推起草单位;农业科学院哈尔滨兽医研究所 本标准主要起草人:乔传玲、杨焕良、陈艳、辛晓光、陈化兰
GB/T27535一2011 猪流感H抗体检测方法 范围 本标准规定了猪流感病毒血凝(HA)和血凝抑制(H)试验的技术要求 本标准适用于猪流感血清HI抗体的检测 仪器 水浴箱、4C冰箱等 试验材料 单道及多道微量移液器,吸头 试剂 4.10.01mol/LpH7.2PBS(参见附录A中A.1) 4.2胰酶溶液(参见附录A中A.2). 4.30.01mol/儿KIO溶液(参见附录A中A.3) 4.41%丙三醉盐水(参见附录A中A.4). 4.5阿氏(Alsevers)液(参见附录A中A.5) 4.60.5%鸡红细胞悬液(参见附录A中A.6) 4.7Hl试验抗原和阴、阳性血清(参见附录A中A.7). 血凝HA)试验 5.1用多道微量移液器在微量反应板的112孔均加人0.05mLPBS,换吸头 5.2吸取0.05m抗原,加人第1孔,反复抽打3一5次混匀 5.3从第1孔吸取0.05ml抗原加人第2孔,混匀后吸取0.05mL加人第3孔,如此进行对倍稀释至 第11孔,从第11孔吸取0.025m弃之,换吸头 第12孔作为红细胞对照 mlL.0.5%(体积分数)鸡红细胞悬液(将鸡红细胞悬液充分播匀后加人). 5.4每孔均加人0.05" 5.5轻轻混匀,室温(20C一25C)下静置20min后观察结果(如果环境温度太高,可置4C环境下). 对照孔红细胞显著呈钮扣状时判定结果 5.6结果判定:将反应板倾斜45",观察红细胞若没有呈泪滴状流淌,则判为HA阳性;完全血凝(不流 淌)的病毒最高稀释倍数代表1个血凝单位(HAU) 血凝抑制(HH)试验 6.1操作步骤 6.1.1血清样品的处理待检血清样品需经“胰酶-加热-高碘酸盐方法”处理,以去除血清中非特异性
GB/T27535一2011 凝集抑制因子 其步骤为;先加0.15mL胰酶溶液于0.3ml 血清中,在56C水浴灭活30min后冷却 至室温;加0.9mL高碘酸钾,混合,室温孵育15min;加0.9mL丙三醇盐溶液,混合,室温孵育15min;加 0 .75mlL生理盐水并混合,置4C保存备用 6.1.2根据HA试验中测定的HI抗原效价配制4HAU的抗原 HA效价除以4即为含4HAU抗原 的稀释倍数 例如,HA效价256,则4HAU抗原的稀释倍数应是64(256除以4). 6.1.3在微量反应板的211孔加人0.025mLPBS,第12孔加人0.05mLPBSs. 6.1.4吸取0.05ml血清待检血清,阳性血清及阴性血清)加人第1孔内,从中吸取0.025ml于第 2孔,充分混匀后吸0.025mL于第3孔,依次对倍稀释至第11孔,从第11孔吸取0.025mL弃去 6.1.51~11孔均加人含4HAU混匀的抗原0,025ml,第12孔作为红细胞对照 室温(20C一25C) 下静置10min30min 每孔加人0.05nL.0.5%(体积分数)的鸡红细胞悬液混匀,轻轻混匀,室温(20C25C)下静 6.1.6 置10min一30min(若环境温度太高,可置4丫条件下进行),在红细胞对照孔呈钮扣状沉于孔底时即可 判定结果 结果判定 6.2.1检测结果成立的条件;已知阳性血清与相应抗原反应后出现预期的H效价,阴性血清与抗原 反应H结果为阴性;反之试验重新进行 6.2.2以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI效价 待检猪血清经过处理后已作 10倍稀释,如果血凝抑制有一个孔发生抑制,此时血清的效价即为1:10,判为阳性 6.2.3未经疫苗免疫的猪只经过14d后再次采样,测定,如果第二次的抗体高于第一次2个滴度,判 为该猪处于感染期 注意事项 标准抗原稀释液浓度为4个HAU,并且在每次试验前进行标定 孵育时间要严格控制 红细胞对照完全沉淀时要迅速判读 在一些病毒株中可见红细胞从病毒 中解脱,如果有这种情况的发生,要提前判定或置4C下孵育 7.3红细胞悬液始终符合标准 7.4反应试剂要按规定保存和使用 为避免反复冻融和细菌污染,应以无菌操作将试剂分装成小 包装 7.5冻干的试剂应按照说明书中规定的体积重新溶解并保存
GB/T27535?2011 ?A ?? ? A.10.01mwl/Lp?7.2PBs NaC 8g KCl 0.2g Na,HPO 1.42g 0.27 KH,PO g 800mL ?? Na(OHHCpH(7.0?7.4),??1000mL.,121C?15min ? A.2?? ?(P-250 200 mg 0.01mol/LPBS 25ml ?,??20C?70C,?6? A.30.01mo/LKIo? KIo 230mg 0.01mol/1PBS 100ml ?,KIo?,1?á A.41%? ml 0.01nmol/1.PBS 99ml ? A.5(AIsevers)? 2.05g 0.8g 0.055 g 0 42g ?? 100 ml NaOHHClpH6.1 121C?15 ,2C8C汸 min
GB/T27535一2011 A.60.5%鸡红细胞悬液 采集23只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积阿氏液混合,用 PBS液洗涤3次,以3000r/min离心5min,洗涤后用PES配成0.5%体积分数)红细胞悬液,2~8C 保存备用 A.7H试验抗原和阴、阳性血清 抗原系用猪流感病毒接种SPF鸡胚,收获感染鸡胚液,用甲醛溶液灭活,经浓缩后,加适宜稳定剂， 经冷冻真空干燥制成 用于H试验,检测猪流感病毒的抗体 阳性血清系用猪流感病毒灭活疫苗免疫SPF鸡,采血、分离血清,加适宜稳定剂,经冷冻真空干燥 制成;阴性血清系采集SPF鸡血,分离血清,冻干制成 用于猪流感病毒H试验,分别作为阳性与阴性 对照 使用冻干的抗原和血清时均按瓶签上规格标注的量,用灭菌生理盐水溶解

猪流感HI抗体检测方法GB/T27535-2011

一、检测原理

HI法是通过测定样品与已知含量病毒抗原的反应力度来确定样品中特异性抗体的含量。HI试验主要依据被检血清中抗体与病毒之间的相互作用，通过比较被检血清的凝集滴度能力与对照血清的凝集滴度能力高低来判断被检样品中是否存在该病毒的抗体，并可以据此确定其抗体效价。

二、操作步骤

1.试剂准备

（1）红细胞悬液：选择适宜的红细胞种类，如鸡红细胞或鹅红细胞等，经过多次洗涤并调整成合适的浓度后制备红细胞悬液。

（2）病毒抗原：选择合适的病毒株，经过多次传代、培养和纯化后制备病毒抗原溶液。

（3）对照血清：选择已知含量的抗体阳性血清作为对照血清。

2.样品处理

（1）禽类血清样品处理：在37℃水浴中加热30分钟，去除非特异性抗体。

（2）其他类型样品处理：根据具体情况选择适当的处理方法。

3.试验操作

（1）将标准病毒抗原和待检血清按比例混合，孵育一段时间。

（2）加入红细胞悬液，再次孵育一段时间，观察红细胞聚集情况。

（3）根据红细胞聚集程度，判断被测血清中是否存在病毒抗体。

三、结果解读

HI法检测结果以最高稀释度作为抗体效价。如被测血清最高稀释度为1:64，则该样品抗体效价为64。

综上所述，猪流感HI抗体检测方法GB/T27535-2011是一种较为常见和可靠的检测方法，对于猪流感等相关疾病的防控具有重要意义。

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