国家标准 GB/T3180g一2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法 DeteetionandidentifieationofPythiumsplendensBraun 2015-07-03发布 2015-11-27实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/I3180g一2015 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位:宁波出人境检验检疫局、浙江出人境检验检疫局、检验检疫科学研究院本标准主要起草人:张慧丽、张建成、顾建锋、郑炜、徐瑛、陈先锋、段维军、陈吴健、吴志毅、杜洪忠、吴品珊
GB/I3180g一2015 油棕猝倒病菌检疫鉴定方法范围本标准规定了油棕猝倒病菌的形态学和分子生物学检疫鉴定方法本标准适用于油棕猝倒病菌寄主植物的植株、插枝等植物材料及介质的检疫鉴定仪器设备生物显微镜(具油镜镜头,具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50X),高压灭菌锅,天平(感量1/100g,1/10000),研钵、制冰机,纯水仪、涡旋振荡器、台式离心机、分光光度计、高速冷冻离心机,真空抽干仪.,低温冰箱、冷藏冷冻冰箱、超净工作台、普通PCR仪、光学CR反应管,pH计、电泳仪,水平电泳槽,实时荧光CR仪、微量移液器(0.5AL,.2L,10AL.20AL.100,Al.200 4L、 1000L)、PCR反应管(0.2mL.0.5mL),锥形瓶,试管,培养皿、载玻片,盖玻片主要试剂和培养基除另有规定外,所有试剂均采用分析纯无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、氢氧化纳、醋酸铵、氯化钾无水乙醇、澳化乙锭、三氧甲烧、异丙醉、异戊醇、氨节青霉素、利福平、制霉菌素,苯菌灵、氧化钠 CTAB、TaqDNA聚合酶,dNTP混合物、10×PCR缓冲液,琼脂糖、DNA分子量标准、Tris/EDTA sDs提取缓冲液(TEs)、Tris/EDTA缓冲液(TE)、Tris、棚酸盐EDTA缓冲液(TBE)等培养基及缓冲液配制方法见附录B 检疫鉴定 4.1症状检查仔细检查根部,根部症状是软化变褐,腐烂;茎部症状是出现灰色或棕黑色水溃状斑点(参见附录A) 对可疑植物和繁殖材料的介质土应取样做进一步检验 4.2组织分离选娄及根部变褐但没有完全腐烂的植物材料,用流动的自来水冲洗干净,在根茎病健交界处切取 0.5em×0.5cm的小块组织,用1%次氯酸钠进行表面消毒3min,无菌水冲洗3次,灭菌滤纸吸干表面水分后,置于选择性培养基上,25C~30C黑暗培养,每天观察,待长出菌丝后,挑取菌丝尖端转移到基础培养基上纯化,保存备用 4.3土壤诱集对禾本科植物叶片(如;马唐、狗尾草,碑草等)进行高温高压灭菌处理,剪成直径1cm大小的小片作为诱饵取5g20g土壤样品研磨破碎放人50mL.灭菌洁净烧杯中,厚度不超过2cm,缓慢加人无菌水没过土表1cm~2 cm,用吸水纸轻轻去掉形成的表面膜和漂浮的有机物残渣,每烧杯水面放置诱饵10片左右静置过夜,体式显微镜下观察,将有菌丝体长出的诱饵取出,用无菌水洗净表面,无菌吸
GB/I31809g一2015 水纸吸干,放人选择性培养基平板上培养待长出菌落后镜检,菌丝体呈棉絮状,分枝,无隔多核,挑取菌丝尖端转移到基础培养基上纯化,保存备用 4.4培养物观察得到病菌纯培养物后,挑出菌丝制片用解剖针将菌丝尽量展开,观察病菌特征需测量不少于 30个菌丝膨大体大小,计算平均值 4.5CR鉴定方法 PCR鉴定方法见附录C 鉴定特征 5.1培养性状在基础培养基上菌落边缘整齐,气生菌丝发达,蛛丝状 5.2 形态特征菌丝和菌丝体 5.2.1 培养基上菌丝膨大体丰富,叶片诱集可产菌丝不规则分枝,菌丝宽3.5m一9.24m,平均6.4 Amo 生大量菌丝膨大体菌丝膨大体(参见附录A)球形至近球形,光滑,通常顶生,很少间生,直径25Am~ 49 Am,在异宗配合腐霉中油棕猝倒病菌的菌丝膨大体直径最大,平均384m,其余种菌丝膨大体平均直径小于30m,菌丝膨大体内充满颗粒状原生质,菌丝膨大体需在有水的情况下经数小时萌发,萌发尺时每个膨大体产生1 一6个芽管,不产生游动袍子囊和游动抱子 5.2.2有性生殖阶段特征有性繁殖为异宗配合,但有些分离物单培养也可以形成藏卵器,藏卵器也可以出现在老化的培养物雄器异丝生,顶或培养数年的菌株上藏卵器顶生或间生,球形,器壁光滑、薄直径24pm一38pm 生,偶尔间生,每个藏卵器1个一8个雄器,柄有时分支或分叉,多个雄器同时围绕一个藏卵器,雄器细胞大,通常20m×154m,直或颈状弯曲卵袍子游离在藏卵器内,不满器,与藏卵器的比例为1:1.2 33 直径204m 3m,壁光滑,薄,壁厚1m一2Am(参见附录A. 结果判定以油棕猝倒病菌在寄主上的症状、分离物的培养特征、无性及有性世代阶段特征等作为鉴定依据、进行综合判定若以上特征与第5章鉴定特征吻合,则鉴定为油棕猝倒病菌若菌丝膨大体平均值小于38um,应进行分子鉴定,分子鉴定结果为阳性,可判定为油棕猝倒病菌样品保存与结果记录 7.1样品保存经检验确定携带油棕猝倒病菌的样品,经登记和标记后视样品的状态采用相应的保存方式,妥善保存6个月,以备复核保存期满后,应经灭菌处理
GB/T31809一2015 7.2菌株保存与处理从检测样品中分离并鉴定为油棕猝倒病菌的菌株,应妥善保存对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理 7.3结果记录与资料保存需要保存的记录包括;样品的种类、自然状态,来源,被为害状及为害程度(无症状也要说明),诊断时使用的方法,PCR检测应有电泳结果照片,鉴定实验室的名称,负责人和鉴定人的签字等
GB/I31809g一2015 附录A 资料性附录油棕猝倒病菌相关信息 A.1油棕猝倒病菌基本信息学名;PhiusblendensBraun 异名:Globisporangiwmsp/l le7dle7S 中文名:油棕猝倒病菌、油棕苗疫病菌,天竺葵黑胫病菌、华丽腐霉分类地位;藻菌界(Chromista),卵菌门(Oomycota),卵菌纲(Oomycetes),腐霉目(Pythiales),腐霉科(Pythi ),腐霉属(Pyhi iaceae" i472 近似种:腐霉属中异宗配合且产生球状菌丝膨大体的种有4种,其中间型腐霉(P.intermnedium)菌丝膨大体为链生,与其他3种差异明显,本标准列出了油棕猝倒病菌与其他3种近似种的主要区别传播途径;通过带菌的土壤和繁殖材料进行传播 A.2方法原理根据油棕猝倒病菌在寄主植物上的症状,通过组织分离、土壤诱集对病原菌进行分离培养,采用形态学(参见A.4)和分子生物学方法对病原菌进行鉴定(见附录B和附录C) A.3病害症状在大多数寄主植物上引起种腐,出苗前疫病或苗期猝倒,在红薯上产生坏死斑,在天竺葵属(Pelar goniumsp.)植物上引起黑胫病,在胡椒(Pipernigrum)上引起萎症状,在大黄(Rheumoficinal le 上引起冠腐,在芦荟属(Aoespp.)植物上引起根腐图A.1所示为油棕猝倒病菌在卡瓦胡椒(Pier mehysticum)上的为害症状
GB/T31809?2015 ?: " -?; ?; ,?? ?:ScotNelson,2005 ?A.1???(Pipermehysticum)????
GB/I31809g一2015 A.4形态特征(见图A.2和图A.3 说明 -菌丝膨大体,a.b为顶生e为间生 a一菌丝膨大体萌发产生芽管; 藏卵器、雄器藏卵器,雄器,卵袍子 fl 注引自HonH.Ho2011,标尺均为20pm. 图A.2油棕猝倒病菌的形态特征
GB/T31809?2015 10m ? ?; 12 3~1l -? VanderPlaats-Niterink,1969 ?:V ?A.3??ī? A.5 ???250?,???;?(Aloespp.)(Arto arpushelerophylus)?(Begoniaspp.),?(Cauja4scaian)??(Canaaliaensior mis),(Capsicumspp.),?(Caricaaaya),(Chrysanhemumspp.),(Cirus aurantiumn)(Coleusblumei)?(Cucumissatius)(Cymbidiunspp.)? Dieffenbachiapicdta),(Eaeisguineensis),?(Geraniumspp.),?(Helianthusanm uus),(Hordeumvulgare(Iooeabatalas)?(Lactucasatia?(Liliumlon gi/lorum),(L1 ,?(Manihoesculenta (Medicagosaliua),?? iu2.sitatissim1 (Melilotusspp.) ,?(Nauilocalyrynchei),?(Pelargoniumspp.)?(Phaseolusau ,?Phaseolwuulgaris?Pinusellioti ?Pipermethystficum) reuus Pi 'pernigrwm?Pi; isusati2 ,Pyr4scommunis ?Raphanussativus) Rheumoffieinale)(Sacc harwmnoficinarumn(Spinacia Trifoliumn oleracea
GB/I31809g一2015 spp.)、小麦(Tri让 ,蚕豆(ViciaJaba,豇豆(Vignasinensis),玉米(Zeamays)等 ic'naestiUu A.6地理分布非洲;科特迪瓦、马达加斯加、尼日利亚、南非,坦桑尼亚亚洲:马来西亚、日本,新加坡、伊朗、印度、越南、,阿曼、台湾大洋洲;澳大利亚、,斐济、新喀里多尼亚、新西兰,巴布亚新几内亚、所罗门群岛欧洲;爱尔兰,比利时、德国,法国,荷兰、葡萄牙,意大利,英国美洲;巴西,波多黎各、哥伦比亚,美国佛罗里达州,加利福尼亚州、特拉华州爱荷华州、印第安纳州、密西西比州马里兰州北卡罗菜纳州、新泽西州、宾夕法尼亚州弗吉尼亚州华盛顿州、北达科他州、密苏里州、夏威夷州)、特立尼达和多巴哥、牙买加 A.7近似种油棕猝倒病菌与近似种的区别见表A.1 表A.1油棕猝倒病菌与近似种的区别种类特征 P.splendens P.sylcalicum P.heterothallieum 球形、亚球形或柠檬形,顶生或间球形或柠檬形,直径17.78m 球形,直径25m49m,平均菌丝膨大体生球形直径l4.6Am~25.3Am, 34.58Am,平均31.54Am,顶生 38Mm,顶生平均18.94m1 或间生球形,顶生或间生,20mm 球形，顶生或间生，24Am顶生或间生,16Am21Am,平 ,平均藏卵器 2m X(294m~324m) 38am 均19.3am 24Am 每个藏卵器2个4个雄器,异每个藏卵器3个一8个雄器,异每个藏卵器1个8个雄器,异雄器丝生,常在接近藏卵器处形成二丝生,在藏卵器周围形成复杂的丝生,柄有时分支或双分叉叉状分支结构,柄近藏卵器处分支 20am33am,平均25um1 13.24m19,8m,平均16.54m 184m~284m,平均214m 卵袍子一9.2m,平均6.44m 宽没5pn- 菌丝宽11m,附着胞镰刀状或棒状宽74m,无附着胞无附着胞
GB/T31809?2015 ? B 淶?? ? B.1 B.1.110%V8 100mlV8??,?0.2g,?20g,??1000ml121C? 20min B.1.2? ?V8??,?,??,???1.5mm?? ????,?ál00mL??1000mL,?100C,??0.2g" ?20g121C?20min B.2? ???? 1000mL121?20min,?55?п(?Ч ?):ù200mg,?100mg,ù50mg,100mg,?,??塣 ?????????(??),?е??? 0.5%?? B.3TES?? 100mmol/LTris-HCIpH8.0)10mmol/LEDTA20g/ISDS. B.4CTAB/NaCI? 100g/ICTAB,0.7mol/INaCl B.5TrisEDTA?TBE 5?;Tris54g,27.5g,0.5mol/EDTA(pH8.0)20ml.,??1000ml? ???0.5 B.6Iris/EDTA?(TE) 10mmol/Tris-HC1,1nmmol/LEDTA,pH8.0
GB/I31809g一2015 附录 c 规范性附录油棕猝倒病菌的CR方法 C.1引物序列 P.slendes的特异性引物Pspl和ITs2的序列见表c.1 表c.1特异性引物序列引物序列5'-3 产物大小 G;AAG;GTCGG;AGTAAAATcTGG;c Pl 150bp ITS2 GCTGCGTTCTTCATCGATGC 注，引自P.H.wang,2003 C.2DNA提取 c.2.1收集经干燥过的菌丝约0.5g放人1.5ml浸在液氮里的离心管中,用塑料杵碾碎待用 C.2.2离心管中加人1mLTES提取缓冲液,另加人100mg一200mg蛋白酶K,55C保温30min,期间轻轻混匀 C.2.3加人5mol/LNaCl28AL、CTAB/NaCI溶液138Al,65C保温10min. c.2.44c13000《离心10min,保留上清液 C.2.5加人等体积的三甲烧:异戊醉(体积比为24:1),轻轻混匀,冰浴30nmin. C.2.64C13000！离心10min,保留上清液 c.2.7加人450AL5mol/LNHAe,冰浴至少30min. c.2.84C16000尽离心10min,保留上清液 C.2.9加人约2/3体积的异丙醇沉淀DNA,13000终离心15min C.2.10DNA沉淀用1mL70%乙醇洗2次;室温干燥,用100ALTE缓冲液溶解DNA备用注DNA提取也可使用商业化试剂盒 c3CR扩增反应体系见表c.2,每个样品设2个平行处理以油棕猝倒病菌DNA或含有油棕猝倒病菌目标片断的质粒作为阳性对照,以其他真菌菌株DNA作为阴性对照,以水代替模板作为空白对照 10o
GB/T31809一2015 表c.2PCR反应体系 25L反应体系试剂名称储备液浓度加样体积/al 10×PCR缓冲液 2.5 MgC 25mmol/L 1.5 2.5mmol/L dNTP混合物 TaqDNA聚合酶 5U/L 0.2 引物 10Amol/I 各0.5 12 DNA模板 50ng/Al一100ng/l ddH. 补至25L C30s.682C30s.,72C30s,.35个循环;72C10 PCR反应条件为;94c5min;94 min C.4产物检测在0.5×TBE电泳缓冲液中,1.5%琼脂糖凝胶电泳,5V/em,0.5%EB染色20o ,凝胶成像仪分 min 析结果 C.5结果判定在阴性对照和空白对照没有产生预期大小条带、阳性对照产生约150bp的预期大小条带情况下如果检测样品出现与阳性对照大小一致的条带,则为阳性; 如果检测样品没有出现与阳性对照大小一致的条带,则为阴性
GB/T31809一2015 参考文献 [1]陈秀贤,曾会才,何汉兴,等海南腐霉新记录种Pythiumsplendens的鉴定及其对油棕苗的致病性测定[] 云南农业大学学报,20o8.,23(3);32132！. [2]AI-Sa'diAM，DrenthA，DeadmanML，DeCockAwAM，AitkenEABMolecular charaeterizationandpathogeniecityofPyhiuspeciesassoeiatedwith damping.ofin ingreenhousecu cumberCucumissativus) Oman[] PlantPathology,2007,56(1):140-149 [3]BRAUNH.Comparativestudies andtworelativespeciesfromm Pthi hiumndebaryanumn. Geranium[].JournalofA AgrieulturalResearch，1925,30:1043-1062. ribosoma [4] Chenw.Restrietionfragmentlengthpolymorphist imsinenymaiealyampifed 1992,82:1467-1472. wspecies[].Phytopathology NAsofthreeheterothallePyhiu [5]GuoLY，K owH.TwowidelyaccessiblemediaforgrowthandreproduetionofPhytophe unmspecies[].AppliedandEnvironmentalMierobhiology,1993,59,2323-2325. horaandPythin [6]JohnTMiddletonPythiumCrownRotofRhubarbJ.BulletinoftheTorreyBotanical Club，1947,74(1):1-8. Klassen，G.R.,M.Balcerzak，A.W A.MdeCock.19965SrRNAgenespacersasspe cies-specificprobesforeightspeciesofPyhiumn.Phytopathology86:581-587 [8]IindeC，WingfieldMJ，KempGHJ.RootandrootcollardiseaseofEucalyptusgrandis causedbyPythiumsplendlesJ.PlantDisease，1994,78:1006-1009. [9 Plaats-NiterinkANJvander MonographofthegenusPythiun[J].StudiesinMycology 1981,211-242. [10]SiderisCP.TaxonomicstudiesinthefamilyPythiaceae.II.PythiumJ].Mycologia，1932， 24:l4-61. [11]wangPH，wangYT，whiteJG,Species=specifiePCRprimersforPyhiumdevelopedl romribosomalITs1region] LetersinAppliedMicrobiology，2003,37;127-132

油棕猝倒病菌检疫鉴定方法GB/T31809-2015

油棕猝倒病是由猝倒病菌引起的细菌性病害，主要影响油棕的果实、叶片、芽和根系等部位，导致油棕的生长发育受阻，严重时会导致油棕死亡。为了防止油棕猝倒病的发生和传播，需要对油棕进行检疫鉴定。

GB/T31809-2015标准规定了油棕猝倒病菌检疫鉴定的方法，主要包括样品采集、分离鉴定和结果判定三个步骤。

1. 样品采集

在油棕生长期间，从可能受到感染的部位取样。样品可以是果实、叶片、芽和根系等，要求患病比例不低于10%。每个样品应该分别进行收集，并且保证每个样品都有足够的数量。

2. 分离鉴定

将样品带回实验室后，用无菌操作的方式将样品分离出来的猝倒病菌接种在含有适宜培养基的琼脂平板上，在30-35℃温度下孵育1-3天。经过培养后，观察是否有猝倒病菌的生长。

如果观察到有猝倒病菌的生长，则需要进一步进行菌株的鉴定。鉴定的方法包括形态学特征、生理生化特性和分子生物学鉴定等。

3. 结果判定

根据GB/T31809-2015标准中规定的方法，对样品进行分离鉴定后，可以得到猝倒病菌检测结果。如果样品中检测到了猝倒病菌，则认为该样品为阳性；如果样品中未检测到猝倒病菌，则认为该样品为阴性。

通过GB/T31809-2015标准中规定的方法，可以准确地对油棕猝倒病进行检测和鉴定，为油棕生产提供了重要的技术支撑。