GB/T32945-2016
牛结核病诊断体外检测γ干扰素法
Bovinetuberculosisdiagnosis—AssayonIFN-γinvitro
- 中国标准分类号（CCS）B41
- 国际标准分类号（ICS）11.220
- 实施日期2017-03-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小345.56KB
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牛结核病诊断体外检测γ干扰素法
国家标准 GB/T32945一2016 牛结核病诊断体外检测?干扰素法 Binetuberewlosisdiagnsis一AssayonIFN-?invitro 2016-08-29发布 2017-03-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T32945一2016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业部提出
本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/Tc181)归口
本标准起草单位.华中农业大学、,武汉科前动物生物制品有限责任公司北京出人境检验检疫局、广 西壮族自治区动物疫病预防控制中心
本标淮起草人;郭爱珍、除颖钮,涂玲玲,胡长敏、晃金、马贵平、,胡巧云,陈焕春
GB/T32945一2016 引 言 牛结核病是主要由牛分枝杆菌(Myw obacteriumbwvis,M.bovis)引起的一种人兽共患慢性传染病， 呈世界性分布
世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报疫病与国际贸易必检对象,我国将其列为 二类动物疫病,是“国家中长期动物疫病防治规划(2012一2020年)”16种优先防治的国内重大动物疫病 临床上牛结核病以肺结核最为常见,但也可发生乳腺结核和肠结核等
健康牛可通过被污染的 空气、饲料和饮水等经呼吸道和消化道感染;此外,牛结核病是人结核的重要传染源之 由于牛分枝 杆菌感染谱广持续感染普遍牛结核病程缓慢临床症状不典型等原因,牛结核病净化相对困难
随着 近年来我国现代奶牛业和肉牛业的蓬勃发展以及国内牛群交易日益频繁,我国牛结核病呈上升趋势 国内外通用的牛结核病控制策略是“检疫 ,因此,准确检测是控制和净化牛结核病的前提 目前法定的检疫方法为牛结核菌素皮内变态反应,该方法的优点是灵敏度高,缺点是:操作费时繁琐,结 果判断主观性强,可与环境分枝杆菌感染出现交叉反应,免疫抑制者或结核病后期对结核菌索的反应性 降低
牛结核病诊断体外检测IFN-7法是用牛结核菌素与禽结核菌素分别刺激外周血淋巴细胞释放 IFN-y,通过检测IFN-7浓度判断牛结核病感染状态的一种方法,是一种敏感性与特异性均高的方法 且能实现高通量检测
发达国家已成功利用该方法辅助诊断与监测牛结核病
建立我国牛结核病诊断 IFN-Y体外检测法国家标准,能为牛结核病的早期诊断、检疫、监测和流行病学调查等提供技术支撑,促 进我国牛结核病的控制和净化,保障我国养牛业的健康可持续发展
GB/T32945一2016 牛结核病诊断体外检测?干扰素法 范围 本标准规定了牛结核病诊断体外检测y干扰素法的缩略语,原理,试剂,采样和操作步骤
本标准适用于牛结核病的早期诊断、检疫、监测与流行病学调查
缩略语 下列缩略语适用于本文件
APpp,禽结核菌素(avianpurifed lproteinderivative B-PPD;牛结核菌素(bovinepurifiedproteinderivative) melinkedimmunosorbentassay ELISA;酶联免疫吸附试验(enzy HRP,辣根过氧化物酶(horseradishperoxidasey IFN-y:7干扰素(interferongamma IgG:免疫球蛋白G(immunoglobulinG PBS;磷酸盐缓冲液(phosphatebufersolution) OD:光密度值(opticaldensity 原理 感染牛分枝杆菌的结核阳性牛,其外周血淋巴细胞已被牛分枝杆菌致敏并产生免疫记忆
当体外 遇到牛分枝杆菌特异性抗原(牛结核菌素)刺激时,淋巴细胞将被激活,发生再次细胞免疫反应,大量释 放IFN-y
通过夹心ELIsA检测IFN-y浓度水平,即可诊断牛分枝杆菌感染
禽分枝杆菌属于非结核 分枝杆菌,以禽结核菌素刺激淋巴细胞作为对照,可有效排除环境分枝杆菌感染导致的非特异性反应
IFN-?体外检测法 4.1仪器与耗材 4.1.1】级生物安全柜 412二氧化碳培养箱. 413刚标仪
414混匀器 15冰箱
I
天平 17高压消海锅
4,1.8微量可调移液器及枪头
4.1.9一次性无菌离心管(2mL 4.1.10一次性肝素钠抗凝采血管
4.1.11 一次性注射器(5mL).
GB/T32945一2016 4.1.12微孔滤膜(0.22m). 4.2试剂 B-PPD工作液、A-PPD工作液、,PBS,牛IFN-》单克隆抗体,兔抗牛IFN-丫多克隆抗体、HRP标记 的羊抗兔lg(G酶标二抗、底物液、包被液、封闭液、洗涤液和终止液
试剂配制方法见附录A
4.3操作步骤 4.3.1 样品收集 无菌采集待检牛血液4ml~5ml,立即转移至含肝素钠抗凝剂的一次性无菌采血管中肝素钠终 浓度为15U/mL),轻轻缓慢颠倒3次一5次使血液与肝素钠混匀,18C一25C保存,30h内送达实验 室进行刺激培养
样品收集过程中应防止样品的污染,注意个人安全防护,具体注意事项见附录B 4.3.2样品处理 将抗凝血加人2mL无菌离心管中,每管1mL.每份血液样品设3个管,分别标记为BPPD.A PPD和PBS管
向标记管中相应加人100aL的BPPD,A-PPD和PBs,盖严,轻摇使血液与加人的刺 激物充分混合,于37C培养箱中静置培养16h~20h
收集细胞培养上清,立即用于IFN-Y检测,或置 -20C保存待检
样品处理过程中应防止样品的污染,注意个人安全防护,具体注意事项见附录B 4.3.3夹心ELISA测定Ir-?浓度 4.3.3.1试剂配制 见附录A 4.3.3.2 包被 用包被液将牛IFN-丫单克隆抗体稀释至工作浓度,加人酶标板孔中,每孔100AlL(每孔含抗体约 35ng),在2一8丫放置12h
4.3.3.3洗涤 弃去孔内包被液,用洗涤液洗板3次
每次300L/孔,每次静置1min后弃去洗涤液,洗涤完毕后 在吸水纸上拍干 4.3.3.4封闭 每孔加人200l封闭液,置37C孵育1h
重复4.3.3.3
4.3.3.5加入待检样品 将4.3.2步骤收集的待检培养上清分别加人封闭好的酶标板孔中,100AL/孔,其中B-PPD刺激上 清标记为B孔,A-PPD刺激上清标记为A孔,PBS刺激上清标记为P孔;同时设置1个空白对照孔,孔 中直接加人100lPBSs，37C作用45min,洗涤3次,方法见4.3.3.3
4.3.3.6加入兔抗牛IFN-?多克隆抗体 用洗涤液将兔抗牛IFN-y多克隆抗体稀释至标定的浓度,100L/孔,37C作用30 min,洗涤3次
GB/T32945一2016 方法见4.3.3.3. 4.3.3.7加入IHRP标记的羊抗兔lgG酶标二抗 用洗涤液将HRP标记的羊抗兔lIg(G酶标二抗稀释至标定的浓度,l00AlL/孔,37作用30 min 洗涤5次,方法见4.3.3.3
4.3.3.8显色和终止反应 每孔先加人底物液A50AL,再加人底物液B50L,室温避光显色10nin
每孔加人50L终止 液
5min内在酶标仪上测定630nm波长处的吸光度(OD值),测定前须用空白对照孔调零
4.3.3.9结果判定 BPPD刺激上清孔的oDm值记作oDimn,APPD刺激上清孔的oDm值记作oDmmn,PBs -OD0.2 刺激上清孔的OD仍值记作ODs
计算OD;rm,ODm及ODs之间的差值,当ODHmp 且ODpp-ODwp>0.2判为阳性;其他情形均判为阴性
GB/T32945一2016 附 录A 规范性附录 试 剂 配 制 血细胞刺激物 A.1 A.1.1B-PPD工作液 使用前将20000IU的牛结核菌素与PBS按119混合,备用 A.1.2A-PPD工作液 使用前将25000IU的禽结核菌素用PBS按1:11.5混合,备用
A.1.3PBs(0.1mol/L，pH7.4) 将下列试剂按次序加人100o nL
规格的容器中,加800mL蒸僧水充分溶解,用1mol/儿盐酸 HCI)或1mol/L.氢氧化钠(NaOH)调节至pH7.4,定容至1000mL 氧化钠NaCI) 8.0g 氯化钾KCI 0.2g 磷酸氢二钠NaHPO12H,O) 0.2g 2.9 磷酸二氢钾KHPO g 0.5mL 吐温-20Tween-20 1000mL 加蒸僧水至 A.2洗涤液 含0.05%吐温-20(Tween-20)的PBs(pH7.4. A.3 包被液 包被液为碳酸盐缓冲液(0.025molL.pH.6)
将下列试剂按次序加人1000mL规格的容器中 1mal/儿氢氧化的(NaoH)调节至pH9.6,定容 加800mL蒸僧水充分溶解,用1mol/I盐酸(HC)或1 至1000mL
碳酸钠(Na.CO. 1.59g 碳酸氢钠(NaHco, 2.93g 加蒸懈水至 1 000mL A.4封闭液(5"%脱脂奶 洗涤液 100mL 脱脂奶粉 5g
GB/T32945一2016 A.5底物A 将下列试剂按次序加人1000ml
规格的容器中,加800ml蒸圜水充分溶解,用1mol/儿L盐酸 HCI)调节pH至5.0~5.4,定容至1000ml 磷酸氢二钠NagHPO12H,(O) 14.6g 9.33 柠檬酸(CH,O) g 0.52 过氧化氢脉H,O. g 11 000mL 加蒸僧水至 A.6底物B 四甲基联苯二胺 20 mg 无水乙醇CH.OHD 10mL 加蒸水至 1000ml A.7终止液 氢氟酸(HF)y 250 加燕憎水至 100ml
GB/T32945一2016 附 录 B 资料性附录 采样与样品处理注意事项 B.1防止样品和环境污染措施 B.1.1采血及血样处理过程,应进行无菌操作,防止样品污染
B.1.2存放血样的容器应洁净,无菌
B.1.3所有与样本接触的待用器材如带滤芯枪头,普通枪头、离心管等器材均应洁净无菌
B.1.4血样处理与ELISA检测应在不同的区域进行,应在不同区域配备独立的加样工具和器材
血 样处理在生物安全柜或超净工作台中进行,ELISA可在敞开的干净空间内进行
操作区应有专门的固 体和液体废弃物收集容器
B.1.5废弃物经高压灭菌后应按有关规定处理
B.2个人防护措施 B.2.1采样及实验过程中应注意个人防护,戴口罩和手套,穿工作服
B.2.2在无污染环境中操作,包括:每次使用血样处理与ELISA检测操作区域后应及时清理物品,用 75%酒精或10%次氯酸钠溶液消毒;生物安全柜或超净工作台在清洁消毒后,再用紫外线照射30min
牛结核病诊断体外检测γ干扰素法GB/T32945-2016
牛结核病是由分枝杆菌属（Mycobacterium tuberculosis complex）引起的慢性传染病，对人畜健康都有严重威胁。因此，在牛场中进行牛结核病的早期发现和快速诊断非常重要。
体外检测γ干扰素法是一种常用的牛结核病诊断方法。该方法通过检测感染动物中γ干扰素水平的变化，判断动物是否感染了牛结核分枝杆菌。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速简便等优点，被广泛应用于牛结核病的诊断中。
GB/T32945-2016是中国国家标准化组织发布的一项关于牛结核病诊断的标准。该标准详细描述了体外检测γ干扰素法的操作步骤、样本采集和预处理、试剂配制、实验操作方法等内容。
该标准主要包括以下几个部分：
- 试管内γ干扰素检测法
- ELISA法
- 细胞增殖试验
这些方法在操作步骤上有所不同，但是都是基于检测感染动物中γ干扰素水平的变化，判断动物是否感染了牛结核分枝杆菌。
总之，体外检测γ干扰素法是一种常用的牛结核病诊断方法，具有灵敏度高、特异性强等优点。GB/T32945-2016提供了一套完整的体外检测γ干扰素法标准，可以确保该方法的操作规范和结果准确性。
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