动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法

动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法

国家标准 GB/T34740一2017 动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法 Diagnstiemethodsforanimalrabiesdiagosiswithdirect immunofuorescenceassay 2017-11-01发布 2018-05-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/34740一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准参考世界动物卫生组织(OIE)2013年版《陆生动物卫生手册》2.1.13狂犬病的相关内容 本标准由农业部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口 本标准起草单位;人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所 本标准起草人:扈荣良、张守峰、刘哗,张菲、连海
GB/34740一2017 动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法 范围 本标准规定了动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法的材料和试剂、器械和设备、防护措施、动物脑组 织样品采集,运输和保存,实验操作及镜检观察与结果判定 本标准适用于动物狂犬病的病原学诊断 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682一2008分析实验室用水规格和试验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件 DFA;直接免疫荧光检测DirectlImmunofluorescenceAssay FITC;异硫氢酸荧光素(Fluoresceinlsothioeyanate) PBS:磷酸盐缓冲溶液(Phosphate-BufferedSaline 材料和试剂 除非另有规定仅使用分析纯试剂 4.1水.,GB/T6682一2008,二级水 4.2狂犬病阳性对照脑组织(见A.l 4.3狂犬病阴性对照脑组织(见A.2) 4.4F:ITC标记的抗狂犬病病毒抗体(商品化的荧光抗体),应由抗狂犬病病毒核蛋白的单克隆抗体或 多克隆抗体制备而成,用PBs(0.01nmol/L，pH7.4，见B.1)稀释成工作液,现用现配 4.51%伊文思蓝溶液(见B.2) 4.6固定液(80%丙酮溶液,见B.3) 警示丙酮易燃,有害健康！ 4.7PBs(o.01mol/儿L，pH7.4，见B.1). 4.880%碱性缓冲甘油溶液(见B.4). 器材和设备 5.1剖检采样及防护器材 手术刀、剪刀、钳、毁、乳胶手套、护目镜
GB/T34740一2017 5.2样品保存及冷冻设备 无菌螺口带盖离心管、一20C以下冰箱 5.3样品消毒设备 高压灭菌器 5.4检测设备和器材 倒置荧光显微镜、37加湿培养箱、移液器及吸头、载玻片、盖玻片、染色缸,湿盒、吸水纸 防护措施 6 样品采集人员应采取相应的个人防护措施及实验操作过程中污染物品的处理(见附录c). 动物脑组织样品的采集、,运输和保存 7.1采集 7.1.1采集部位 用于检测的脑组织应包含脑干、小脑和海马角 7.1.2小动物脑组织的采集 鼠、兔等小动物可打开颅腔,采集全部脑组织 7.1.3中大动物脑组织的采集 犬等中、大动物通常可通过枕骨大孔采样法,采集部分脑组织用于本检测:用一直径5mm饮料吸 管或一个2mL一次性塑料移液管,朝一侧眼睛方向插人枕骨大孔抵最深处后捏紧或堵住外口,小心 抽出,管内脑组织即包含延髓、小脑基底部,海马角、大脑髓质和皮质等部位 7.2运输 样品装人无菌螺口带盖离心管,密封包装后，4C以下冷藏或冷冻运输 样品运输应使用双层密封 包装 在无法保证冷藏运输时,可将脑组织保存在含50%甘油的PBs(见B.1)中,但仍应尽可能低温 运输 7.3保存 在无菌螺口带盖离心管内,于一20C以下保存 实验操作 8.1脑组织触片制备 在l级生物安全柜中取小脑,脑干,海马角、大脑髓质和皮质等部位各米粒大小的待检组织,每个部 位分别在同一载玻片不同位置上轻触,形成明显的印记,倒放在吸水纸上轻压吸去多余液体 同时制备 已知阴、阳性脑组织触片 将触片在生物安全柜内室温干燥10min.
GB/34740一2017 8.2触片固定 警示丙酮易燃,有害健康！ 干燥后的触片置于载玻片架上,浸人冷的80%丙酮见B.3)内固定30" 室温自然干燥 min 10min 8.3荧光抗体染色、浸洗及封片 8.3.1以PBs(0.01mol/L，pH7.4，见B.1)稀释荧光抗体至工作浓度,加终浓度0.002%的伊文思蓝 见B.2),混匀后吸取约200AL滴加于组织触片表面 8.3.2将载玻片放人湿盒,在37C温箱内温育1h 8.3.3弃去载玻片上的染色液,于PBS浸洗2次,每次3 m1n 8.3.4以吸水纸小心吸去玻片边缘多余液体,样品表面滴加1滴(约30L)80%碱性缓冲甘油溶液 见B,4),加盖玻片,于1h内在暗室中荧光显微镜下观察 镜检观察与结果判定 9.1镜检操作 荧光显微镜下判定检测结果 应使用200倍放大倍数观察 在对样品观察结果作出阴性结论前， 每张触片应至少读取40个不同的视野 9.2染色强度及病毒抗原分布判定 9.2.1荧光显微镜下的特异性荧光为大小不等的亮绿色尘埃样颗粒或稍大的团块,有时沿神经纤维走 行,呈条索状分布 阳性样品应呈明亮的苹果绿色,组织炎性分泌物或腐败产物可导致荧光强度减弱 9.2.2脑组织样品中的病毒抗原分布对应的染色强度分为4个等级,分别记为+、十十、十十十、十十 十,无特异性荧光颗粒时记为" 9.2.3 样品的每个视野内几乎都有大量的不同大小和形状的特异性荧光颗粒 9.2.4 十:样品的绝大多数视野内都有不同大小和形状的特异性荧光颗粒,数量不等 9.2.5 十十;10%一50%的视野内可见形状,大小不等的特异性荧光颗粒,且荧光颗粒数量较少 9.2.6 0%的视野内可见形状,大小不等的特异性荧光颗粒,且荧光颗粒稀少 9.2.7 各视野均无特异性荧光颗粒出现 9.3结果判定 9.3.1阳性对照触片的抗原分布应判定为十十十十十十十,阴性触片应判定为一,作为对照成立的 标准 9.3.2在对照成立的基础上,对待检样品进行判定 待检样品着染强度为明亮或明显的苹果绿色,抗 原染色判定为十十 十十十十时判定为狂犬病感染阳性;十判定为狂犬病感染可疑;无特异性荧光染色 的样品判定为阴性 g.3.3可疑阳性样品应取多部位脑组织样品复检,复检仍为可疑的,判为阳性
GB/T34740一2017 附 录 A 规范性附录) 狂犬病阳性和阴性犬脑组织制备 狂犬病阳性对照脑组织 A.1 狂犬病阳性对照脑组织制备时首先取10%的狂犬病病毒SRV9株小鼠脑毒匀浆,0.03mL/只脑内 接种10日龄以下乳鼠,正常饲养 小鼠于第6天至第8天发病,濒死时以脱颈方式处死乳鼠,生物安全 柜内无菌采集脑组织 以直接免疫荧光法进行脑组织狂犬病病毒抗原的检测 80%以上视野内存在亮 绿色特异性荧光灶者可用作阳性对照组织 阳性对照脑组织置1.5mL螺口离心管内， C冰柜内 2o 保存,保存期24个月 A.2狂犬病阴性对照脑组织 狂犬病阴性对照脑组织制备时首先取普通家犬,在正常喂饲条件下笼养21d,如无异常表现,肌肉 注射0.1mL/kg的0.5%戊巴比妥钠溶液0.4mL/kg,待完全麻醉后,通过静脉注射气栓实施安乐死 剖检采取脑组织,无菌条件下切成约0.5cm大小,置1.5mL螺口离心管内 随机取总份数的5%,以 直接免疫荧光法进行脑组织狂犬病病毒抗原的检测 镜下所有视野内均不应有特异性荧光灶 阴性对 照脑组织于-20C冰柜内保存,保存期24个月
GB/34740?2017 ? B 淶?? ? B.10.01mol/Lλ?(PBs ?85.00g,15.49g,2.03g,??,101 B.21%?? ??lg,??,100mL B.3??(80%?? ???,к ??80mL,?(GB/T6682?2008,)100mL B.480%?? B.4.1?λ?:??4.3g,?8.6g,?GB/T6682?2008,),? 500ml B.4.280%??:?80ml?λ?(B.4.1)20mL,
GB/T34740一2017 录 附 C 规范性附录) 狂犬病诊断检测操作的个人防护措施及实验操作过程中污染物品的处理 C.1进行狂犬病诊断检测的操作者应进行狂犬病暴露前免疫,每年进行2次血清狂犬病病毒中和抗体 检测,中和抗体效价应不低于1.0IU/mL c.2检测操作时应佩戴口罩、双层手套,着长袖工作服 采样时应在此基础上加戴护目镜 c.3应避免锐物刺伤和割伤 发生外伤后,应立即停止实验,以肥皂水冲洗伤口不少于15min,并加 强免疫狂犬病疫苗1剂 C.4实验过程中接触被检病料的器械及一次性耗材应于120C湿热高压灭菌20min后按常规清洗或 废弃

动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法GB/T34740-2017

动物狂犬病是由病毒引起的一种急性传染病，通常被认为是小动物（如犬、猫等）的疾病。人类通过被抓伤或者咬伤受到感染，因此也被称为“犬咬病”。据统计，全球每年因狂犬病死亡的人数超过5万人。所以，动物狂犬病的防治十分重要。

GB/T34740-2017是中国标准化协会发布的关于动物狂犬病的直接免疫荧光诊断方法的标准。该标准规定了动物狂犬病直接免疫荧光诊断技术的原理、试剂、仪器设备、操作程序等方面。这种诊断方法具有灵敏度高、特异性强、结果准确可靠、操作简便快捷等优点，已成为人们广泛使用的一种诊断方法。

动物狂犬病的直接免疫荧光诊断法是通过检测患兽的组织、血清或脑脊液中的病毒抗原，判断是否感染狂犬病病毒。这种方法主要包括以下步骤：

1. 制备抗体：选择适当的实验室动物，注射狂犬病疫苗，使其产生高水平的抗体。
2. 取样：选择被怀疑感染狂犬病病毒的动物，采集其血清、组织或脑脊液等样本。
3. 标记抗体：将制备好的荧光素标记抗体与被检测样本中的病毒抗原结合。
4. 显微镜检查：在荧光显微镜下观察标记有荧光素的病毒抗原，从而判断是否感染狂犬病病毒。

总之，动物狂犬病的直接免疫荧光诊断方法是目前比较先进的一种诊断方法。我们应该加强宣传，提高人们的防狂犬病意识，避免发生狂犬病疫情。

动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法的相关资料

和动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法类似的标准

GB/T34740-2017

动物狂犬病直接免疫荧光诊断方法

2022/9/1 3:00:49 现行

GB/T34739-2017

动物狂犬病病毒中和抗体检测技术

2022/9/1 2:55:45 现行

GB/T36789-2018

动物狂犬病病毒核酸检测方法

2022/8/11 23:19:39 现行