GB/T31730-2015
水稻中转基因成分测定膜芯片法
Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinrice—Membrane-basedarraymethod
- 中国标准分类号（CCS）X04
- 国际标准分类号（ICS）67.050
- 实施日期2015-09-01
- 文件格式PDF
- 文本页数13页
- 文件大小382.04KB
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水稻中转基因成分测定膜芯片法
国家标准 GB/T31730一2015 水稻中转基因成分测定膜芯片法 Detectionofgeneticallymodifiedcomponentsinriee- Membrane-basedarraymethod 2015-06-02发布 2015-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31730一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由标准化研究院归口
本标准起草单位;四川华汉三创生物科技有限公司、标准化研究院、黑龙江省粮油卫生检验监 测站
本标准主要起草人;黄广平、云振宇、尹志坚、胡太贵、孙昭、张瑶、王勇强、董玖红、宋廷瑞、张金龙、 刘贞
GB/T31730一2015 水稻中转基因成分测定膜芯片法 范围 本标准规定了水稻及水稻加工产品中转基因成分的检测方法
本标准适用于转BAR基因耐除草剂水稻和转B基因(Cry1Ab/Cry1Ac)抗虫水稻中转基因成分 的快速定性检测,也适用于水稻加工产品中以上成分的快速定性检测
本标准规定的转基因成分最低检测限量是1g/kg 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 GB/T19495.1,GB/T19495.6界定的术语和定义适用于本文件
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
DNA.脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dNTP;脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate) dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate dCTP,脱氧胞苷三磷酸(deoxyeytidinetriphosphate dGTP;脱氧鸟昔三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate) TTP;脱氧胸苷三磷酸deoxythymidinetriphosphate) dUTP;脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) bp;碱基对(basepair) BAR;草丁麟乙酰转移酶基因(phosphinothrienacetylransferasegene) Cry1Ab;苏云金芽抱杆菌杀虫毒蛋白cry1A(b)基因[Bacillushuringiensi、insectieidal toxin ery1A(6) gene CrylAe:苏云金芽袍杆菌杀虫毒蛋白cry1A(e)基因[Baeiushuringiensi、insetiidal toxin ry1A(e) gene
GB/I31730一2015 CaMV35S-P;花椰菜花叶病毒的35S启动子promoterfromcauliflowermosaicvirus N0s3'’;胭脂碱合成酶基因终止子(terminationsequenceofthenopalinesynthasegene' CaMV35s-T;花椰菜花叶病毒的35S终止子(terminationsequencefromceauliflowernmosaievirus) CO59;水稻gws9基因[Ory2 satiza(ricegos9gene PC;阳性对照(positivecontro NC阴性对照(negativecontrol UNG酶;尿嗜嚏-N-糖基化酶(UNG酶)(uracilN-glycosylase) Ta酶;TherusaquaticusDNA聚合酶(TherusaquaticusDNApolymerase) AminolinkerC6;6个碳原子作为连接臂的氨基标记(c6Aminolinker 原理 根据转基因水稻中常见转基因片段和调控元件设计特异性多重PCR引物,对样本进行多重PCR 扩增
PCR引物上修饰有生物素
若样本中出现目标片段而得到PCR扩增产物,PCR产物与固定有 目标基因特异性探针的膜芯片进行杂交
杂交点上的生物素和碱性磷酸酶标记链霉亲和素反应,以及 碱性磷酸酶化学显色底物进行化学显色,则可在杂交点上形成肉眼可见的杂交信号
依据膜芯片上杂 交点的显色情况,判断样本中是否含有待检转基因成分,检测结果可以用肉眼直接判断,或用芯片识读 仪对杂交芯片进行扫描并判定结果 5 试剂与标准品 5.1试剂 5.1.1试剂组分 本标准中试剂组分和存放条件参见附录A和5.1.25.1.4的规定
除非另有规定,本方法中所用 试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的二级水
5.1.2引物 PCR反应使用的引物序列应符合表1的规定 表1CR反应使用的引物序列 序 列 目标基因 引物名称 扩增片段大小 Forward 5'-CACCTGCTGAAGTCCCTGGA-3’ BAR 93bp 5'-biotin-GTACCGGCAGGCTGAAGTcCA-3” Reverse 5'G.ACATGAAcAGcGccTTGAC3" Forward Cry1Ab 164bp 5-biotin-TTGATGGTTGCAGCATcGAA-3” Reverse 5'-GTTAGACTcAACAGCAGTGGA-3” Forward Cry1Ac 161bp Reverse 5’-biotin-GAGAAGATGGATGAATTACCCCA-3 Forwardl 5'-GGCCATCGTTGAAGATGCCTC-3’” CaMV35S-P 144bp Reverse 5'-biotin-TCATCCCTTACGTCAGTGGA-3
GB/T31730一2015 表1(续 序 列 目标基因 引物名称 扩增片段大小 Forward 5'-TGCATG.ACGTTATTTATGAG.ATGGGTTT-3” NOS-3” 113bp Reverse 5’-biotin-GCGCGCG,ATAATTTATCCTAGTTT-3” Forward 5'-CCAGATAAG;G;GAATTAGGGTTC-3” CaMv35s-T 32p Reverse 5'-biotin-ACTGGATTTTGGTTTTAGGAATTAGA-3’ Forward 5'-GACGATCCGTAGTGGAGC-3” G0S9 117bp 5'biotinGTAATcGTAGTTGGATTTccAcC3" Reverse 5.1.3探针 膜芯片表面包被的目标基因探针序列应符合表2的规定
表2目标基因探针序列 名称 序列 修饰基团 5'-CGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGAC BAR 55'-AminolinkerC6 GTGGGTTTCTG3” 5'-GCAGCTAATCTTCACCTCAGCGTGCTTCGAGACGTTAGCGTGTTTGGG Cry1Ab 5'-AminolinkerC0 CAAAGGTGGGG-3'” 5'-TCTACCAGATATAGAGTTCGTGTGAGGTATGCT'TCTGTGACCCCTAT CrylAe 5'-AminolinkerC6 TCACCTCAACGT-3 -AGGAGCATCGTGGAAAAAGAAGACGTTCCAACCACGTCTTCAAAGCA CaMV35S-P 5'-AminolinkerC6 AGTGGATTGATG3 -TTATGATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAATACGCGATAGAAAA NO)S3” 5'-AminolinkerC6 CAAAATATAGCGC-3 -AGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTT CaMV35S-T 5'-AminolinkerC6 CTATCAATAAAAT-3” -GCCTTTACATACGTTGGCACGGACGGGAATGAACATCTTGCAGGTCC G(O)S9 5”-AminolinkerC6 TTGGGGTGGTGG3 '-GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAGAAGAACGAGTG PC 5'-AminolinkerC6 TCCAAAGTACCAG3 5'-GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGAT Nc 5'-AminolinkerC6 GATcCTATTTTC-3 注，阳性寡核苷酸单链DNA(P ,10pmol/L)核苷酸序列与阳性对照核酸探针(c)序列互补,用于 ositiveG oigo" 膜芯片杂交过程质量控制.5’'端带生物素(biotin)标记,序列如下 5'-biotin-CTGGTACTTTGGACACTcGTTCTTcTCGCACTGcCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC3” 5.1.4其他试剂 5.1.4.1碱性磷酸酶标记链霉亲和素(APstreptavidin). 5.1.4.2碱性磷酸酶化学显色底物5-溴-4-氯-3-呵噪磷酸和氧化硝基四氮陛蓝(BCIP/NBT)
GB/I31730一2015 5.1.4.3磷酸二氢钠(NaHPOH.O). 5.1.4.4乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na,CHN,Naa.O 5.1.4.5十二炕基磺酸钠(SDS,CnHSO.Na)
5.1.4.8氢氧化纳(NaoHI) 5.1.4.7氯化钠(NaC)
5.1.4.8多重PCR即用型预混液MultiplexPCRMasterMix):MgCl3nmmol/L.dATP,dCTP dGTP,dTTP和dUTP各0.4mmol/L.,UNG酶4X10'U/L,Ta酶8×1o'U/L
5.1.4.9多重PCR引物预混液(MultiplexPCRPrimerMix);每条引物2umol/1
5.1.4. 10 20XSSPE缓冲液:3mol/儿NaCI,200mmol/LNaH,PO,20mmol/LEDTA,pH7.4
5.1.4.11去活化液:100mmol/LNaOH
5.1.4.12去活化清洗液;2×SSPE,0.1%SDS. 5.1.4.13杂交液;2xssPE.0.1%sDs. 5.1.4.14杂交清洗液;2xssPE.0.5%sDs 5.1.4.15 酶孵育液:;2×SSPE,0.5%SDS
5.1.4.16孵育清洗液1;2X5sPE.,0.5%sDs
5.1.4.17孵育清洗液2;2×SSPE
底物显色液;碱性磷酸酶化学显色底物NBT/BcIP,含0.15mg/mLBCIP,0.30mg/mL 5.1.4.18 NBT,100mnmol/ITris-HCl,5mmol/儿MgCl,pH9,5
5.2标准品 5.2.1LLRice62Rice转基因水稻标准品LLRice62品系,包含BAR.CaMv35S-P.CaMV35S-T转基因 成分 5.2.2BT63Riee转基因水稻标准品BT63品系,包含Cry1Ab,Cry1Ae,NOS-3’转基因成分
5.2.3Non-ModifiedRice非转基因水稻标准品
仪器与设备 6.1基因扩增仪 6.2核酸微量分光光度计
6.3纯水仪
6.4分析天平;精确到0.001 g
6.5膜芯片识读仪
6.6台式离心机;转速12000r/min 6.7分子杂交炉
6.8其他相关仪器和设备
试验方法和流程 7.1膜芯片检测流程 膜芯片法检测流程参见附录B 7.2防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施应按照GB/T19495.2的规定执行
GB/T31730一2015 7.3抽样和样品制备要求 7.3.1实验室抽样要求 实验室样品代表性应符合GB/T19495.7的规定 7.3.2样品的保存 标准品,实验室样品及测试样品的保存应按照GB/T19495.1的规定执行
7.3.3样品的制备 所有测试样品的制备操作应按照GB/T19495.2的规定执行,小心操作确保防止任何的污染和样 品组分的改变 7.3.4DNA的提取 样品中DNA的提取,应按照GB/T19495.3中的规定执行,或采用同等功能的植物基因组DNA 提取试剂盒
并对提取后的样品DNA进行定量
每个测试样品提取时应做两个提取重复
7.3.5PCR扩增 7.3.5.1CR反应体系 按照表3配制PCR反应体系
每次实验中,利用转基因水稻标准品的基因组DNA作为阳性质 控,非转基因水稻标准品的基因组DNA作为阴性质控,核酸提取空白作为空白质控,以对后续的PCR 扩增体系、膜芯片杂交反应进行质控
表3PC反应体系体积(50L) 阴性质控 空白质控 反应液组成 检测反应 阳性质控 PCRMasterMix Multiplexl 25AL 25l 25Ml 25Al MultiplexPCRPrimerMix 5A 5nl 5小 5Al 检测样品基因组DNA 200ng 转基因水稻标准品基因组DNA 200ng 非转基因水稻标准品基因组DNA 200ng 核酸提取空白 104l 无核酸酶灭菌水 补水至50Al 补水至50Al. 补水至50l 补水至50AL 注，PCR体系最终含有MgCl1.5mmol/L.,dATP,dCcTP,dGTP,drTP和dUTP各0.2mmol/L..,UNG酶1U. Tq酶2U,每条引物0.2pmolL 7.3.5.2PCR反应循环参数 按照表4设计PCR反应参数
GB/I31730一2015 表4PCR反应参数 步骤 温度 反应时间 37 10min C 95 10tmin C 95 30s C 55" 30s 72 30s 72C 10min C 注;步骤3、4、5循环40次
7.4膜芯片杂交 7.4.1膜芯片制备 膜芯片制作和质量控制参见附录c
7.4.2杂交体系 按照表5配制杂交体系液 表5杂交体系 组分 体积/l 杂交液(2×SSPE,0.1%SDS 979 20 PCR扩增产物 阳性寡核苷酸单链DNA(PositiveOligol104mol/L) 总体积 1000 7.4.3酶孵育体系 按照表6配制酶孵育体系液,用前新鲜配制
表6酶孵育体系 体积/AL 组分 孵育液(2xssPE,0.5%sDs) 999.5 碱性磷酸酶标记链霉亲和素(APstreptavdinm) 0.5 总体积 000 7.4.4杂交、酶联及显色 7.4.4.1杂交检测方式:
GB/T31730一2015 本步骤有手动操作和自动杂交仪测定两种选择 7.4.4.2手动过程: 将膜芯片置于杂交盒内,按表7进行手动杂交
杂交过程在分子杂交炉中进行,类似仪器应满足实 验要求
表7膜芯片手动杂交过程 过程名称 必 骤 去活化 加人去活化液,37C,8min,吸除去活化液 去活化清洗 加人去活化清洗液,60C,5min,吸除去活化清洗液 加人杂交体系液,42,45nmin,吸除杂交体系液 杂交 .52笔,5nin,吸除杂交清洗液,该过程重复2次 杂交清洗(2次 加人杂交清洗液， 酶孵育 加人酶孵育体系液,42C,30min ,吸除酶孵育体系液 孵育清洗1(2次 加人孵育清洗液1,12C,5min,吸除孵育清洗液1,该过程重复2次 孵育清洗2(2次 加人孵育清洗液2,37,5min,吸除孵育清洗液2,该过程重复2次 显色 加人显色液,37C,静止显色15min,吸除显色液 显色清洗(2次 加人去离子水,37C,5min,吸除去离子水,该过程重复2次 结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读 7.4.4.3自动杂交仪测定过程 具有自动杂交、清洗反应功能的仪器,可以按照表8流程所示,依次自动完成去活化,杂交,清洗、酶 孵育、显色等步骤
表8自动杂交仪测定过程 程序名称 试剂名称 温度/t 时间 min 去活化 去活化液 37 去活化清洗 去活化清洗液 60 42 45 杂交 杂交液 杂交清洗 杂交清洗液 52 杂交清洗 杂交清洗液 52 42 酶孵育 孵育液 30 孵育清洗液1 42 孵育清洗l 孵育清洗1 孵育清洗液1 42 孵育清洗2 孵育清洗液2 37 37 孵育清洗2 孵育清洗液2 显色液 15 37 显色 显色清洗 去离子水 37 37 显色清洗 去离子水 结果判读 根据杂交点显色情况进行结果判读
GB/I31730一2015 7.5膜芯片结果判读 7.5.1 目测判读 显色后的膜芯片可以用肉眼直接判读检测结果
阳性杂交信号为肉眼明显可见的蓝色斑点
如果 杂交点部位没有显色,和膜芯片背景相同,则判读为阴性杂交信号
7.5.2膜芯片识读仪判读 膜芯片显色后,使用膜芯片识读仪进行扫描分析,根据杂交点的信号值判断检测结果,阳性杂交信 号的判断闽值是3倍背景信号值加上3倍背景信号值标准差
结果判断 8.1 质量控制 8.1.1核酸提取空白对照和多重PCR扩增试剂空白对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阴性,转基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号阳 性,阴性对照探针点杂交信号阴性
8.1.2非转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,转基因探针点杂交信号阴性,阳性对照探针点杂交信号阳 性,阴性对照探针点杂交信号阴性
8.1.3转基因标准品对照 膜芯片上内源基因探针点杂交信号阳性,标准品中所含转基因探针点杂交信号阳性,阳性对照探针 点杂交信号阳性,阴性对照探针点杂交信号阴性
8.2膜芯片结果判读 8.2.1样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阴性,表明未能从样本中提取出适宜多重PCR扩增 的核酸模板,需要重新进行样本核酸提取和多重PCR扩增
8.2.2样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性,转基因探针点杂交信号阴性,表明样本核酸提 取,多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判断样本中未检出测定转基因成分
8.2.3样本检测结果中内源基因探针点杂交信号阳性,各转基因探针点杂交信号部分或全部阳性,表明样 本核酸提取,多重PCR扩增和膜芯片杂交过程正常,判读样本中存在阳性信号点对应的转基因成分
8.2.4膜芯片杂交检测结果应符合8.1.1~8.1.3对照情况
否则应判断实验不成功,需重做实验， 结果表述 9.1未检出 在阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点检测结果正常的情况下,未检出本标准所包括的转基 因成分
9.2检出 检出××××基因,阴性质控探针杂交点、阳性质控探针杂交点的检测结果正常
GB/T31730一2015 附录 A 资料性附录) 膜芯片法试剂组分和存放条件 膜芯片法试剂组分和存放条件参见表A.1
表A.1膜芯片法试剂组分和存放条件 序号 试剂组分; 存放条件 多重PCR即用型预混液 -20 -20 C 多重CR引物预混液 无核酸酶灭菌水 -20 转基因标准品基因组DNA50ng/L) -20 阳性寡核苷酸单链DNA -20 去活化液 室温 去活化清洗液 室温 杂交液 室温 杂交清洗液 室温 酶孵育液 10 室温 m 碱性磷酸酶标记的链霉亲和素 4C 12 孵育清洗液1 室温 13 孵育清洗液2 室温 4"C 14 BBCIP/NBT显色底物 15 膜芯片 室温
GB/I31730一2015 B 附 录 资料性附录 膜芯片法检测流程 膜芯片法检测按照图B.1流程进行
待测样品 核酸提取 多重CR扩增 股芯片杂交和清洗 芯片结果判读 阴性 阳性 报告结果 图B.1膜芯片法检测流程 10o
GB/T31730一2015 C 附 录 资料性附录) 膜芯片制作与质量控制 膜芯片制作 采用微定量喷点式膜芯片点样仪,将各个核苷酸探针(探针浓度254mol/L)分布在带负电荷尼龙 膜芯片上的特定位置区域
芯片表面包被的探针布局如图C.1所示
杂交阳性对照;PC,监测芯片杂交过程是否正常
内对照:GOs9,指膜芯片上用来质控PCR扩增过程是否正常的对照,使用水稻特异性内源基因 gos9扩增片段互补的一段寡核苷酸作为探针
阴性对照:NC,指膜芯片上用来质控探针杂交特异性的对照
一般使用一段与任何靶标分子序列 无关的寡核苷酸作为探针
GoS9 BAR Cry1Ab NoS-P3" C1Ac CaMV35S- CaMv35S-T C NC 图c.1膜芯片探针布局 C.2膜芯片的质量控制 膜芯片点样后扫描无漏点,连点,位点规则,大小均匀一致,点与点的距离为3004m 一500Mm;杂 交后阳性质控实验杂交信号清晰可见
水稻中转基因成分测定膜芯片法GB/T31730-2015
水稻是我国最主要的粮食作物之一，而中转基因则是指外源基因在植物中的瞬时表达，通常不会对遗传稳定性产生持久影响。然而，由于中转基因可能会对人体健康和环境产生不利影响，因此需要对水稻中的中转基因成分进行严格监测。
近年来，膜芯片法逐渐成为一种快速、高效、准确的DNA测序技术，并被广泛应用于全基因组分析、变异检测等领域。膜芯片法是一种新型的DNA芯片技术，其原理是将多个寡核苷酸探针固定在膜载体上，通过荧光信号检测目标DNA序列的存在与否。
针对水稻中的中转基因成分测定，GB/T31730-2015标准提出了一种新的膜芯片法，该方法可以同时检测多个外源基因，具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。其具体步骤如下：
- 提取水稻DNA样品并进行全基因组扩增；
- 将扩增产物杂交在膜芯片上，并用荧光标记的探针检测目标序列的存在；
- 根据荧光信号判断水稻中是否含有外源基因。
相比传统的PCR和Southern blotting等方法，膜芯片法具有更高的检测效率和精确度，且不受DNA片段长度、GC含量和可变剪接等因素的影响。因此，该方法已成为水稻中转基因成分测定的首选方法之一。
总之，膜芯片法是一种快速、高效、准确的DNA测序技术，在水稻中转基因成分测定中具有广阔的应用前景。未来随着技术的不断发展和完善，相信膜芯片法将会在更多领域得到广泛应用。
