番茄花叶病毒检疫鉴定方法

番茄花叶病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T36771一2018 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 DetectionandidentificationofTomatoosaicvirs 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/T36771一2018 次 目 前言 范围 2 规范性引用文件 3 病毒基本信息 原理 仪器、用具及试剂 5.1仪器 5.2用具 5.3试剂 取样 6.1种子取样 6.2生长期植株取样 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 7.2斑点酶联免疫吸附测定 7.3胶体金免疫层析测定 7.4RT-PCR检测 7.5实时荧光RT-PCR检测 7.6接种反应 结果判定 样品保存与结果记录 9.1样品保存 9.2结果记录 附录A资料性附录)番茄花叶病毒其他信息 附录B规范性附录)双抗体夹心酶联免疫吸附测定 附录c规范性附录)斑点酶联免疫吸附测定 附录D(规范性附录胶体金免疫层析测定 12 附录E规范性附录RT-PCR检测 附录F规范性附录实时荧光RT-PCR检测 l 附录G资料性附录种子感染水平和取样量 17 18 附录H资料性附录接种反应 19 参考文献
GB/T36771一2018 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、天津出人境检验检疫局、中华人民共 和国甘肃出人境检验检疫局 本标准主要起草人:魏梅生、孔君、朱水芳,郭京泽、李桂芬、赵文军、王军平,文朝慧、尤佳
GB/T36771一2018 番茄花叶病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了番茄花叶病毒(Ton omatomosaicuirus)的检疫鉴定方法 本标准适用于寄主植株和未处理种子中番茄花叶病毒的检测鉴定 为降低种子的感染率,采用物理(如热处理)或化学方法处理如酸处理、次氧酸钠、磷酸三钠等)的 种子,或采用农用化学品或生物制剂处理的种子,使用本标准时需通过分析,抽样或比较实验,来证明残 留的抑制物不会影响到实验 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 病毒基本信息 学名:Toatoosaicuirus 缩写;ToMV 中文名;番茄花叶病毒 异名番茄病毒1号(Lycoersicumvirus1) 分类地位;植物杆状病毒科(Virgaviridae),烟草花叶病毒属(Tobamoirus) ToMIV的其他信息参见附录A 原理 ToMV的蛋白和基因组特征是该病毒检测鉴定的依据 采用双抗体夹心酶联免疫吸附测定 (DAS-ELISA)、斑点酶联免疫吸附测定(Dot-ELISA)、胶体金免疫层析测定、RT-PCR,实时荧光RT PCR等方法来特异性检测该病毒,并判断样品是否带有ToMV ToMV的侵染性是该病毒生物学活性的重要指标 采用生物学接种的方法来判断病毒的活性 S 仪器用具及试剂 5.1仪器 电子天平(感量0.001g) 高速冷冻离心机(最大转速15000r/min) 小型瞬时离心机(最大转速7000r/min) 普通冰箱(4C). 超低温冰箱(一80C).
GB/T36771一2018 制冰机(每日制冰能力为110kg). 旋涡振荡器(最大转速2800r/min). 磁力搅拌器(搅拌容量50ml2000mL 高压灭菌锅最大压力为0.235MPa,可调控温度范围为105C~135C). pH计量程0.00~14.00,精度士0.01) 超净工作台(高效滤膜可除去99.99%以上的0.3m粒子). PCR仪(温度范围499,控温精度士0.25). 微波炉(烧烤型) 电泳仪(输出电压5V600V,输出电流2mA一200mA). 电泳槽(长度×宽度×高度为310mm×150mm×90mm) 凝胶成像分析仪(光强连续可调302nm紫外透照仪、顶置白光光源,白光转换板、UV干涉滤光片、 机载图像捕捉软件,图像分析软件). 酶标仪波长范围340nm850nm) 5.2用具 酶联板 可调移液器(2.5lL、,10aL,20L,100L,200nL、1000aL) 可调移液器头 离心管 研钵,微型磨杵等 5.3试剂 除另有规定外,所有试剂均为分析纯,实验用水应符合GB/T6682中相关规定 DAsELISA试剂见附录B Dot-ELISA试剂见附录c 胶体金免疫层析测定试剂见附录D RT-PCR检测试剂见附录E 实时荧光RT-PCR检测试剂见附录F 取样 6 6.1种子取样 6.1.1防交叉污染 依据取样的大小,按种子的千粒重,取出小样的分量 取样时要避免交叉污染,保持设备、台面、容 器、手等的清洁 6.1.2待测种子的取样 种子的取样和病害的感染水平有关,为确保种传病害检测到的概率为95%或99%,可根据病害的 感染水平或健康的容许水平来确定取样大小,具体可参见附录G 为保证感染水平在0.1%以上的病种子检测到的概率为95%,番茄种子的最少取样量为3000粒种 子,每个小样的量最多为250粒种子 可根据种子的千粒重来推算出所取样品的重量
GB/T36771一2018 6.2生长期植株取样 在植物的生长前期或中期,从具有典型花叶或斑驳症状的植株上采集叶片 检测鉴定 7.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 把制备的样品上清液加人已包被ToMV抗体的酶联板中,进行DAsELISA检测 每个样品平行 加到两个孔中 健康的植物组织作为阴性对照,感染ToMV的植物组织作为阳性对照,样品提取缓冲 液作为空白对照;其中阴性对照的种类和材料应尽量与检测样品相一致 具体操作见附录B 7.2斑点酶联免疫吸附测定 斑点酶联免疫吸附测定,见附录C 7.3胶体金免疫层析测定 病叶中病毒的检测也可采用胶体金免疫层析测定,见附录D 7.4RI-CR检测 RT-PCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双蒸水作为空白对照 分别提取样品和对照的总 RNA,反转录合成eDNA后进行PCR检测,具体操作见附录E 如采用商品化一步法试剂盒,则按照 试剂盒说明进行 7.5实时荧光Rr-CR检测 实时荧光RTCR检测的阴性和阳性对照设置同7.1,灭菌双燕水作为空白对照 分别提取样品 和对照的总RNA.反铃转录合成DNA后进行实时荧光PcR检剥,具体操作见附录F 如采用商品化 步法试剂盒,则按照试剂盒说明进行 7.6接种反应 接种反应参见附录H 结果判定 样品检测流程及结果判定按下述原则进行 酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阳性,同时RT-PCR(或实时荧光RT-PCR)的检测 结果为阳性,则判定样品携带ToMV -酶联(或胶体金免疫层析)方法检测结果为阴性,则判定样品不携带ToMV 样品保存与结果记录 样品保存 经检测确定携带ToMV的样品应在适合的条件下保存以备复核 种子应干燥低温保存,活体的病 株在隔离温室中保存,其他的离体材料如叶片等样品可保存在一80C冰箱中 做好登记和标记工作
GB/T36771一2018 保存期限至少1年 9.2结果记录 记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字 DAs-ELISsA检测应有酶 联反应数值;RT-PCR检测应有电泳图片;实时荧光RT-PCR检测应有荧光曲线图
GB/T36771一2018 附 录 A 资料性附录 番茄花叶病毒其他信息 A.1寄主范围 番茄花叶病毒主要危害番茄(Lycopersiconeculentwm)和辣椒,多数茄科植物易染病 A.2危害症状 番茄;主要症状有浅绿或深绿色花叶、斑驳,有时幼叶畸形 冬季温度低于20C时易出现“蕨叶”或 卷须样症状,植株矮化 有些引起黄花叶或“奥古巴”花叶、,斑驳症状,果实上也会出现 发病植株在茎 或叶柄上形成长形坏死条纹,导致茎叶或果实坏死 甜椒(Capsicumfrulescens);严重的叶片坏死和脱落,长期的花叶和矮化 心叶烟(Nic 黑色坏死枯斑,枯斑的直径一开始为0.5mm,后期可发展到4 mm icotialglulinosa 当温度高于33C时出现系统侵染,植株出现褪绿矮化、坏死斑和叶片畸形、扩散性坏死 白肋烟(N. .ahacumcv.whiteBurley);多数分离物接种3d4d后出现局部坏死枯斑,无系统侵 染,但有些分离物(如dahlemense,OhioI,和I)可出现系统侵染 林烟草(N.sylvesris);枯斑,无系统侵染 曼陀罗(Da ;接种2d3d后出现局部坏死枯斑,无系统侵染 turastraoni 览色藜(Cheopodiumamaranticolor )和昆诺阿黎(C.guina);接种4d~10d后出现褪绿或坏死 枯斑 千日红(Gmphr globosa):接种1周后出现坏死或半坏死枯斑,多数分离物会引起系统褪绿 1reng 斑驳 与番茄花叶病毒不同的是烟草花叶病毒通常会系统侵染曼陀罗、白肋烟、林烟草 A.3分布 全世界广泛分布 A.4传播方式 番茄花叶病毒可以通过机械接种、嫁接和植株间接触传播,还可以通过种子传毒 番茄的种传率可 达94%,病毒存在于种子的外部粘液、种皮中 有时在胚乳中也有病毒,但种胚中未发现病毒 幼苗移 栽时容易感染上病毒 胚乳受病毒感染的种子,病毒的侵染活性至少可维持9年 A.5粒体形态 病毒粒体直杆状,大小为300nm×18nm 病毒蛋白亚基螺旋排列
GB/T36771一2018 A.6基因组 单分体基因组,正单链RNA,基因组RNA由6384个核苷酸组成 共有4个ORF,编码4个蛋 白,分别为126kDa、183kDa病毒复制酶、.30kDa细胞间移动蛋白和17.5kDa病毒外壳蛋白 致病型 Craigella番茄有Tm-1、Tm-2,Tm-2”等位抗性基因 按番茄花叶病毒能否克服这些基因的抗性， 将番茄花叶病毒分为0(不能克服上述任何抗性基因、1(克服Tm-1抗性基因),2(克服Tm-2抗性基 因)、1.2(克服Tm-l和Tm-2抗性基因、2(克服Tm-2抗性基因)等5个Pelham组
GB/T36771?2018 ?B 淶?? ??? B.1? B.1.1 ? ?б??塣 B.1.2 ????塣 B.1.3?? ?????塣 B.1.4 (pNPP) B.1.5??? PBST (Na,SO 1.3g ?(PVP,?24000?40000) 20g 0.2 (NaN, g pH7.4,4C档 B.1.6? 1.59 ?(Na,CO) g ?(NaHCO. 2.93g NaN, 0.2g pH9.6,?1L,C档 B.1.7PBS?(??? ?NaCI 8.0g l.15g NaHPO 0.2g KHPO ?(KCI) 0.2g -20(Tween-20 0.5ml pH7.4,??1L
GB/T36771一2018 B1.8酶标抗体稀释缓冲液 PBST 2.0 牛血清白蛋白(BSA)或脱脂奶粉 g 20.0 聚乙烯毗咯烧酮(PVP,相对分子质量2400040000 g 叠氮化钠(NaN) 0.2g 调pH至7.4,4C储存 B.1.9底物(pNPP)缓冲液 氯化镁MgC 0.lg 叠氮化钠NaN, 0.2g 二乙醇胺 97 mL 用盐酸调pH至9.8,蒸僧水定容至1L,4C储存 B.2程序 B.2.1包被抗体 用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,l00AL孔,加盖,37C孵育2h,清空孔中溶 液,PBST洗涤3次,每次3min B.2.2样品制备 待测样晶按1,10(即1g样晶加人10ml抽提缓冲液)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆2000r/min 离心10min,上清即为制备好的检测样品 阴性对照,阳性对照作相应的处理或按照说明书进行 B.2.3加样 加人制备好的检测样品、阴性对照、阳性对照,100L/孔,加盖,4C冰箱孵育过夜,取出的酶联板 用自来水彻底冲洗,再用蒸僧水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min. B.2.4加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加人到酶联板中,100AL/孔,加盖， 37笔孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗,再用蒸僧水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min B.2.5加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1lmg/mL(现配现用),按100L/孔,加人到酶联板 中,室温避光孵育 B.2.6读数 在不同的时间内如30min、lh,2h,或更长时间,用酶标仪在405nm处读OD值,或用肉眼观察显 色情况 B.3结果判断 B.3.1 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔),应该在质量控制范围内,即
GB/36771一2018 缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于0.15,当阴性对照孔的OD值小于0.05时,按0.05计算; 阳性对照OD值与阴性对照OD值之比为5~10;孔的重复性基本一致 B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下: 样品OD值与阴性对照OD值之比明显大于2,判为阳性;样品OD值与阴性对照OD值之 比在闵值附近,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以验证;样品OD值与阴性对照OD 值之比明显小于2,判为阴性 B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断
GB/T36771?2018 ? C 淶??) ??? C.1? C.1.1?? ?????0.45m C.1.2? ????塣 C.1.3?? ???,?????,???? C.1.4 ?(NBT 5--4--3-(BCIP c.1.5Ps? 8.0 (NaCD g NaHPO 1.15g 0.2 KH,PO g 0.2 ?KCD 8 pH7.4,??1L C.1.6PBST?(??? PBS? -20Tween-20 0.5ml C.1.7?? ?? 5.0g PBST? 100ml C.1.8?? ?(Tris 12.lg ?(NaCD 8.0g ??MgCl, 0.lg pH9.0,и?1L 10
GB/36771一2018 C.2程序 C.2.1 样品制备 待测样品按1;20(即1g样品加人10mlPHS缓冲液)加人PEs缓冲液,用研钵研磨成浆， 2000r/min离心10min,上清即为制备好的检测样品 阴性对照阳性对照作相应的处理 C.2.2点样 在硝酸纤维素膜上用铅笔画加样方格(5mm×5mm),在方格内分别点人2.5L的检测样品、阴 性对照和阳性对照,晾干 并做好标记 C.2.3封闭 膜在封闭缓冲液中37C振荡孵育1h C.2.4加第一抗体 用封闭缓冲液稀释抗体,加人工作浓度的第一抗体,37C振荡孵育1h PBST缓冲液洗涤3次 4次,每次3min C.2.5加酶标第二抗体 加人工作浓度的酶标第二抗体,37丫振荡孵育1h PBST缓冲液洗涤4次5次,每次3min. C.2.6加底物显色 在10ml底物缓冲液中加人66AL浓度为50mg/ml的NBT(溶于70%的二甲基甲酰胺中)和 33AL浓度为50mg/mL的BCIP(溶于100%的二甲基甲酰胺中)混匀 室温避光条件下,将膜在其中 振荡孵育,待充分显色后,用蒸馏水漂洗终止反应 C.3结果判断 当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品出现紫色斑点,则检测结果为 C.3.1 阳性 C3.2当阳性对照出现紫色斑点,阴性对照未出现紫色斑点时,若样品未出现紫色斑点,则检测结果为 阴性 11
GB/T36771一2018 附 录 D 规范性附录) 胶体金免疫层析测定 试剂 D.1 D.1.1PBST样品抽提缓冲液pH7.4 亚硫酸钠Na.SsO 1.3g 聚乙烯毗咯烧酮(PVP,相对分子质量2400040000 20g 氧化钠(NaCIy 8.0g 磷酸氢二钠Na,HPO 1.15g 磷酸二氢钾(KH,PO,) 0.2g 氯化钾KCI) 0.2g 吐温-20Tween-20) 0.5mL 溶于蒸憎水中,定容至1L D.1.2Iris-HCI样品抽提缓冲液pH8.2 三羚甲基氨基甲婉Tris) 1.2g 亚硫酸钠(NaasO 1.3g 氯化钠(NaCI 8.0g 氯化钾(KCI) 0.2g 聚乙烯毗咯烧酮(PVP,相对分子质量2400040000 20g 1-20 0.5mL 吐温-20Tweenm 溶于蒸馏水中,用盐酸调pH至8.2,定容至1L D.2操作步骤 样品制备方法同B.2.2 测试前将试纸条恢复至室温 将试纸条含胶体金复合物的一端插人到样品中,样品液不要超过胶 min20min 体金试纸条上的Max线 测试观察的时间以10 1为好,对于病原浓度低的样品可适当延 长至30min n或更长的时间 D.3结果判断 D.3.1质控C线显紫红色,测试T线也显红色,检测结果为阳性(图D.1). D.3.2 质拉c线显紫红色,测试T线未显色,险测结果为阴性(图D2 D.3.3质控C线和测试T线均未显色,说明试纸条失效.检测结果无效 12
GB/T36771一2018 C线 T线 Max线 " 图D.1阳性(+)结果 C线 T线 Max线 图D.2阴性(一)结果 D.4贮存 试纸条应在2C~8C冰箱内密封干燥保存 使用时注意未用的试纸条密封 以免吸湿而失效 13
GB/T36771一2018 附 录 E 规范性附录) RT-PCR检测 E.1 试剂 E.1.1 核酸提取试剂 Trizol或RNA提取试剂盒 E.1.2电泳缓冲液TAE(50× 三胫甲基氨基甲烧(Tris) 242g 57.1ml 冰乙酸(CH,O 乙二胺四乙酸二钠(NaEDTA2H.O) 37.2g 双蒸水定容至1000mlL.,用时稀释至1×TAE E.2检测步骤 E.2.1核酸提取 称取0.1g样品加液氮研磨成粉末状,迅速将其移人灭菌的1.5mlL离心管中,加人1mlL的Trizol :;4C12000r 试剂,剧烈震荡3min; r/min离心10min;将上清液移人一新离心管中,加人0.5ml氯仿 猛烈震荡15s;4C12000r/nmin离心15 min;小心吸取上层无色水相到新离心管中;加人等体积异丙 醇,混匀;室温静置10min;4C12000r/min离心10min,弃上清;加人1nL.75%的冷乙醉洗涤沉淀 4C10000r/min离心10min,弃乙醇;沉淀于室温下充分干燥后溶于30LDEPC处理过的水中 -20保存备用 注:此处以核酸提取也可按照商品化RNA提取试剂盒进行操作 E.2.2引物序列 正向引物(ToMV-f:5'-cGAGAGGGGcAAcAAAcAT-3' 反向引物(ToMv-).s-AccTGTcTccATcTcTTTG.了 扩增片段长度;318bp E.2.3反转录 反应体系;20AL;在0,2mlPCR管中加人总RNAlAL,dNTPs(10mmnol/L)1lAL,DEPC处理过 的水10AL,反向引物ToMV-r(20Mmol/I)2AL,70C保温5min;冰上放置5min;再加人5×反转录 缓冲液4AL,RNaA酶抑制剂(40U/L)1AL,M-MLV(200U/L)1AL,42C保温1h,得到cDNA后 用作PCR的模板 设置阳性对照、阴性对照及空白对照 E.2.4CR扩增 反应体系:20L;在0.2mLPCR管中加人10×PCR缓冲液(含Mg+)2AL,dNTPs(10mmol/L 0.6L,正向引物ToMV及反向引物ToMVvr(均为20pmol/L)各0.5AL.TuqDNA聚合酶(2U/ 14
GB/36771一2018 L)1AL,模板2L.和DEPC处理过的水13.4AL 设置阳性对照,阴性对照及空白对照 反应程序;94c5 min;94C30s,66C30s,72C40s,35个循环;72C10min E.2.5PCR产物琼脂糖凝胶电泳 制备1.5%的琼脂糖凝胶,按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物,用DNA片段作为分子量 标记,进行电泳 电泳结束后在凝胶成像仪中观察是否扩增出预期的特异性DNA条带,并拍摄记录 E.3结果判定 阳性对照在318bp左右处有条带,阴性对照和空白对照无特异性条带,待测样品出现与阳性对照 -致的条带,测定序列比对为ToMV的,可判定为阳性 阳性对照在318bp左右处有条带,阴性对照、空白对照及待测样品无特异性条带,可判定结果为 阴性 15
GB/T36771一2018 附录 F 规范性附录) 实时荧光Rr-PCR检测 P.1试剂 核酸提取试剂同E.1.1 -步法实时荧光RT-PCR试剂 F.2引物探针 上游引物ToMV-F);5'-TTGCCGTGGTGGTGTGAGT-3'" 下游引物ToMV-R):5'-GACCCCAGTGTGGCTTCGT-3' 探针ToMV-MGB):5'-FAM-TcTTTcCATTcTcTTGTCAA-MGB3 F.3核酸提取 方法同E.2.1. F.4实时荧光RTI-PCR反应 反应体系:0.2mL离心管中加人2×一步法实时荧光RT-PCR试剂 缓冲液10L,ETaqHS 5U/L)0.4AL,反转录酶混合液0.4"L,ToMV-F(10Mmol/L)0.4AL,ToMV-R(10mol/L)0.4ML. 设 ToMV-MGB(10"mol/L)0.GAL,参比染料0.4L,模板RNA2AL,补DEPC处理过的水至20AL 置阳性对照、阴性对照及空白对照 反应程序;45C10min,9510min;95C15s,60C1min,共45个循环 F.5 结果判定 在空白对照及阴性对照无C'值且无扩增曲线、阳性对照C'值<30并出现典型扩增曲线的条 件下 待测样品的C值>40时,判定ToMV阴性 待测样品的c'值<35时,判定ToMV阳性 待测样品的Ct值小于40且大于35时,应重新进行测试;如果重新测试的Ct值>40,判定ToMV 阴性;如果重新测试的C值小于40且大于35,且分离曲线明显时,则判定结果为阳性 16
GB/T36771一2018 附 录 G 资料性附录 种子感染水平和取样量 种子感染水平和取样量见表G.1 表G.1种子的取样量 样品量/粒 感染水平/% 95%概率 99%概率 0.01 29960 46050 14980 23020 0.02 0.05 9210 5990 0. 2990 4600 0.2 1500 2300 0,.5 600 920 300 460 150 230 50 10 17
GB/T36771一2018 附 录 资料性附录) 接种反应 H.1试材 H.1.1抽提缓冲液 8.0 氯化钠NaCI g 磷酸氢二钠(NaHPO.) 1.15g 磷酸二氢钾(KH.PO) 0.2g 溶于1L蒸圜水,调pH至7.27.4 121C,高压灭菌15min. H.1.2指示植物 番茄花叶病毒的指示植物心叶烟(Nicotianaglutinos)或枯斑珊西烟(Nicotianatabacumcw. XanthiNN),需在光照充分,温度为20C一25C的条件下培育 选择具有5片6片真叶,长势良好 的植株 H.2接种 H.2.1抽提样品的接种 样品按1:10即1只样品加人10ml抽提缓冲液)加人抽提缓冲液,用研钵研磨成浆 每个抽提 样品接种2株植物,每株接种2片叶 将320目的金刚砂撒在指示植物植物的叶片上 在叶片上加 l滴接种物(100AL200AL),用带手套的手指轻抹 接种不同的样品手套要同步更换,或者用碱性肥 皂将手彻底洗干净 接种后立即用自来水冲洗植株 H.2.2阳性和阴性对照的接种 番茄花叶病毒病汁液或提纯的病毒等可作为阳性对照 样品抽提缓冲液或用健康样品的抽提液可 作为阴性对照 接种方法同H.2.1 H.3培养 接种后的植物在温度为2025C,不少于12h的光照条件下,生长5d7d 温度高于28C 不利于发病显症 H.4结果检查 番茄花叶病毒接种心叶烟或枯斑珊西烟会产生枯斑 若接种的样品在叶片上产生大量的枯斑,并且阴、阳性对照正常,则这些枯斑是可信的 若仅出现个别枯斑,则需将枯斑加少量的抽提缓冲液重复接种,以确认病毒的侵染性 通常情况下 由病毒侵染形成的枯斑再次接种时,会产生大量的枯斑 必要时可用ELISA确认接种的结果 18
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