牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22987一2008 牛奶和奶粉中喃它酮、吠喃西林、 砝喃妥因和咔喃坠酮代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determinationfotheresiduesoffuraltadon,nitrofurazone， nitrofurantoinandfurazolidonemetabolitesinmilkandmilkpowder LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22987一2008 前 言 本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准起草单位:秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人:张进杰、曹亚平、刘晓茂、曹彦忠、王静淑、杨志伟庞国芳
GB/T22987一2008 牛奶和奶粉中肤喃它酮、味喃西林、 肤喃妥因和肤喃陛酮代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中吠喃它酮代谢物(5-吗咻甲基-3-氨基-2-嘻陛烧基酮,英文缩写为 AMOZ),吠喃西林代谢物(氨基脉,英文缩写为SEM),吠喃妥因代谢物(1-氨基-2-内酰脉,英文缩写为 AHD)和吠喃幽酮代谢物(3-氨基-2-嗯陛婉基酮,英文缩写为A0Z)残留量液相色谱-串联质谱测定 方法 本标准适用于牛奶和奶粉中AM0Z,SEM、AHD和A0Z残留量的测定 本标准的方法检出限:牛奶中AMOZSEM,AHD和AOZ的检出限均为0.2g/kg;奶粉中 AMOZ.SEM,AHD和AOZ的检出限均为1.64g/kg 注:本标准中肤喃它,吠喃西林,吠喃妥因和峡喃哗酮及代谢物中英名称及英文缩写参见附录A中的表A.1 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 儿是不注日朋的引用文件,其最新版本适用于本标准 测量方法与结果的准确度正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.！ GB/T6379.1一2004,ISO5725-l:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,ISO5725-2:1994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,Iso3696;1987,MOD)y 原理 牛奶或奶粉试样用三氯乙酸水解并脱蛋白,硝基吠喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生 化,用OasisHLB或性能相当的固相萃取柱净化 液相色谱-串联质谱仪(EsI十)检测 用内标法或外 标法定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为优级纯 水GB/T6682,一级 4.2甲醇;色谱纯 43乙睛;色谱纯 4.4乙酸乙酯;色谱纯 45磷酸氢二钾,K_HPo. 4.6乙酸 4.7 二甲亚碱
GB/T22987一2008 4.8盐酸 4.9三氯乙酸,CHClO 4 10氢氧化钠 4.112-硝基苯甲醛(2-NP),C,HNO;含量>99% 4.120.1mol/儿磷酸氢二钾溶液;称取17.4只磷酸氢二钾(4.5),用水溶解,定容至1000mL 4.130.2nmol/L盐酸;量取17mL浓盐酸(4.8),用水定容至1000m 4.144mol/几氢氧化钠溶液;称取80只氢氧化钠(4.10),用水溶解,定容至500mL 4.150.5mol/L三氯乙酸溶液:称取37.5g三氧乙酸(4.9),用水溶解,定容至500ml 4.16衍生剂:含2-硝基苯甲醛0.05mol/L 称取0.075只2-硝基苯甲醛(4.11)溶于10ml二甲亚碱 (4.7),现用现配 4.17样品定容溶液;取10ml乙晴(4.3),0.3ml乙酸(4.6),用水稀释到100ml 4.18标准物质:AMOZ(CAs;43056-63-9)SEM(CcAs;563-41-7)、AHD(CAs;2827-56-7)和A0Z (CAs.80-65-9),纯度均>99% 4.19同位素标记物标准物质:D-AM0Z,ClN-SEM、C-AHD和D-AOZ 四种内标标准物质的 纯度均>99% 4.201.0mg/mL标准储备溶液;分别称取适量的四种硝基吠喃代谢物标准物质(4.18),分别用甲醇 稀释成1.0mg/mL.的标准储备溶液 避光保存于-18C冰柜中 4.210.1ug/ml混合标准溶液;分别吸取适量四种硝基映喃代谢物的标准储备溶液(4.20),用甲醇 稀释成0.1ug/ml的混合标准溶液,避光保存于 C冰柜中 4.221.0mg/mL同位素标记物混合内标储备溶液;分别称取适量的四种硝基吠喃代谢物的同位素标 记物标准物质(4.19),分别用甲醉配成1.0 -18C冰柜中 mg/mL的标准储备液 避光保存于 g/'mL同位素标记物混合内标溶液.分别移取适量的四种硝基吠喃代谢物的同位素标记物 4.230.1 内标储备裕液(4.22),用甲醇稀释成0.14g/ml的混合内标标准溶液,避光保存于一18C冰柜中 oasisHLB同相翠取柱"或相当者0. 4.24 mg,3ml 使用前依次用5ml甲醇和10ml水预处理， 保持柱体湿润 4.25滤膜:0.2m. 仪器 液相色谱-串联四极杆质谱谐仪,配有电喷雾离子源 5.2分析天平:感量0.1mg和0.01g 5.3液体混匀器 5.4固相萃取装置 5.5氨气吹干仪 5.6恒温振荡水浴 5.7真空泵;真空度应达到80kPa 微量注射器,25,L,10o 0pL 棕色具塞离心管;25ml,50ml 5 10pH计;测量精度士0.02pH单位 5 11贮液器:50mL OasisHlB固相萃取柱是water公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可 如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T22987一2008 5.12高速离心机:转速10000r/min以上 试样的制备与保存 6 试样的制备 实验室样品混合均匀,分出0.5kg作为试样 试样保存 试样置于-18C冰柜,避光保存 测定步骤 待测样品溶液的制备 7.1.1牛奶样品脱蛋白水解和衍生化 称取牛奶样品8g(精确到0.01g),置于50ml棕色离心管中,加人15ml三氯乙酸溶液(4.15). 向上述离心管中加人0.2mL衍生剂4.16),再加人适量混合内标溶液(4.23),使四种硝基吠喃代谢物 内标物最终定容浓度均为2.0ng/ml 用液体混匀器混匀置于37C恒温振荡水浴中避光反应16h 离心管取出后放置至室温,在10000r/min下离心10min，上清液倒人另一棕色离心管中 奶粉样品脱蛋白水解和衍生化 称取奶粉样品1g(精确到0.0lg),置于50ml棕色离心管中,加人8mL水,涡旋混合后,再加人 15ml三氯乙酸溶液(4.15) 向上述离心管中加人0.2ml衍生剂(4.16),再加人适量混合内标溶液 (4.23),使四种硝基吠喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL 用液体混匀器混匀,置于37c 恒温振荡水浴中避光反应16h 离心管取出后放置至室温,在10000r/min下离心10min,上清液倒 人另一棕色离心管中 样品溶液净化 上述衍生溶液加人5mL0.1mol/儿磷酸氢二钾溶液(4.12),用4mol/L氢氧化钠溶液(4.14)调节 溶液pH约为7.4,在10000r/min下离心10min,上清液倒人下接OasisHLB固相萃取柱(4.24)的贮 液器中,在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱(4.24),待样液 全部通过固相萃取柱后用20ml20%甲醇水淋洗固相萃取柱,弃去全部流出液 抽干OasisHLB固相 萃取柱(4.24)15min 用5ml乙酸乙酯(4.4)洗脱,收集洗脱液于25mL棕色离心管中,在氮气吹干 仪上45C水浴吹干,准确加人1.0mL样品定容溶液(4.17)溶解残渣,混匀后过0.2xm滤膜(4.25. 供液相色谱-串联质谱测定 混合基质标准校准溶液的制备 7.2.1牛奶混合基质标准校准溶液的制备 称取五个阴性牛奶样品,每个样品为8g(精确到0.01g) 分别加人适量混合标准溶液(4.21),制 成四种硝基吠喃代谢物含量均为0.14g/kg,0.24g/kg,0.54g/kg,1.04g/kg和2.04g/kg的基质标 准溶液,再分别加人适量混合内标溶液(4.23),含量均为2.0ng/ml 同7.1.1和7.1.3操作,作为牛 奶标准校准曲线 7.2.2奶粉混合基质标准校准溶液的制备 称取五个阴性奶粉样品,每个样品为lg(精确到0.01g) 分别加人适量混合标准溶液(4.21),制 成四种硝基吠喃代谢物含量均为0.84g/kg、1.64g/kg、4.04g/lkg,8.0g/kg和16.04g/kg的基质 标准溶液,再分别加人适量混合内标溶液(4.23),含量均为2.0ng/mL 同7.1.2和7.1.3操作,作为 奶粉标准校准曲线 测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下
GB/T22987一2008 色谱柱:Atla antisC8,3.54m,150mm×2.1mm(内径)或相当者; a D) 柱温;35C; e)进样量;40L d 流动相:流动相A为0.1%甲酸水溶液,流动相B为0.1%甲酸乙睛溶液,梯度洗脱参考条件 见表1 表1液相色谱梯度洗脱参考条件 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 流速/gl min 0.00 200 80 20 3.00 200 50 50 8.00 200 50 50 80 8.01 200 20 16.00 200 80 20 7.3.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 a)离子源;电喷雾离子源(ESI); b 扫描方式;正离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM); 电喷雾电压(IS);5000V; 辅助气(AUX)流速;7L/min 辅助气温度(TEM):480C; 聚焦电压(FP):150V g 碰撞室出口电压(CcxP):l1V; h 去簇电压(DP);45V; 四种硝基吠喃代谢物和内标衍生物的质谱参数见表2. 表2四种硝基味喃代谢物和内标衍生物的质谱参数 衍生后的硝基映喃代谢物 定量离子对 定性离子对 去簇电压 采集时间" 碰撞能量 及同位素内标物名称 m/:) m/z DP)/V (CE)/八V ms 18 335/291 50 2-NPAMOZ 335/291 100 16 335/128 209/192 1 2-NPSEM 209/166 150 40 15 209/166 249/134 19 249/134 2-NPAHD 50 200 2 249/178 236/134 1 2-NPAOZ 236/134 50 100 1 236/192 18 2-NP-D-AMOZ 340/296 340/296 45 100 15 2-NPCiiN-SEM 212/168 212/168 45 100 2-NPliC-AHD 252/134 252/134 32 40 100 2-NPD-A0Z 240/134 240/134 40 100 22
GB/T22987一2008 7.4液相色谱-串联质谱测定 7.4.1定性确证 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与混合基质标准校准溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品谱图中各组分的相对离子丰度与浓度接近的混合基质标准校准溶液谱图中对应的相对离 子丰度进行比较,偏差不超过表3规定的范围,则可判定样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K>50 20. m7 计算结果应扣除空白值
GB/T22987一2008 精密度 -般规定 本标准的精密度数据是按GB/T6379.1和GB/T6379.2规定确定的,重复性和再现性的值以 95%的可信度来计算 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,四种硝基峡喃代谢物的 添加浓度范围及重复性方程见表4 表4添加浓度范围及重复性和再现性方程 硝基吠喃代谢物的衍生物名称漆加浓度范围/ug/kg) 重复性限" 再现性限R 2-NPAM0Z =0.94481 -0.7116 R- 0.25.0 g"=0.8950 l区"一1.0874 lgm 2-NPSEM lg尸=1.1209lgm一1.0110lgR=0.9787lm一0.731 0.2一5.0 2-NPAHD 0.25.0 Ig尸=0.8502lg川一1.0206lgR=1.0293lg川一0.709 0.2~5.0 g"=1.0710lgm-0,8852lgR=0.9933lgm一0.7008 2-NPAOZ 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,四种硝基峡喃代谢物的 添加浓度范围及再现性方程见表4
GB/T22987一2008 附 录A 资料性附录 四种硝基肤喃及代谢物的中英名称及英文缩写 吠喃它酮、吠喃西林、吠喃妥因和吠喃陛酮及代谢物的中英名称及英文缩写.见表A.1 表A.1肤喃它酮,肤喃西林,肤喃妥因和肤喃陛酮及代谢物的中英名称及英文缩写 四种硝基味喃四种硝基峡喃 四种硝基映喃代谢物中文名称 四种硝基峡喃代谢物英文名称 英文缩写 英文名称 中文名称 3-amino-5-morpholinomethy-1 5-吗咐甲基-3氨基-2-曙幽烧 吠喃它闹 uraltadon AMOZ 3-oxazolidin-2-one 基酬 SEM 肤喃西林 氨基脉 nitrofurazone semicarbazide 吠喃妥因 AHD 1氨基-2-内酰脉 nitrofurantoin -aminohydantoin 吠喃陛闹 urazolidone 3-氨基-2-嘻陛烧基 3-amino2-oxazolidinone AOZ
GB/T22987一2008 B 附 录 资料性附录 多反应监测(NR)色谱图 四种硝基吠喃代谢物及内标行生物的多反应监测(MRM)色谱图.见图B.1 2.55 5-吗琳甲基-3-氨基-2-恶陛炕基闹的衔生物 5000.00 0.00 2 13 4 5mmin" 10 8.32 氨基脉的衍生物 i 5000.00 0.00 12 3 4 5in 8.52 -氨基-2-内肤脉的衍生物 星撇 2000 O 7.83 5.86 7.27 10.25 u 3 min 9.17 3-氨基-2-嗯哗婉基制的衍生物 h 2.39 6.857.478.42 G8. 吃 T3 5mm 2.52 啾甲基-3-奴基-2-感哗婉基制内标物的衍生物 科 f 墓M T0 13 in 8.29 氨基脉内标物的衍生物 排 2.00 a说 2 3 4 5minm 10 8.48 -氨基-2-内脓脉内标物的衍生物 2.33 5 min 9 氨基-2-蟋噜烧基削内标物的行生物 3.0e41 2.04 1.0e4 2.52 0.0" 0 3 T4 T5m 图B.1四种硝基肤喃代谢物及内标物衍生物的多反应监测(MRM1)色谱图
GB/T22987一2008 c 附 录 资料性附录 回 收 率 四种硝基吠喃代谢物的添加浓度及其平均回收率的试验数据见表c.1 表c.1四种硝基味喃代谢物添加浓度及其平均回收率的试验数据 奶粉和牛奶样品中四种硝基吠喃代谢物的平均回收率/% 添加浓度 基质样品 成/Ake) 2-NP-AM0Z 2-NPSEM 2-NPAHD 2-NPAOZ 0.2 96.4 92.8 91.8 96.1 92.1 91，2 94.7 93.5 0.5 牛奶 98." 97.4 93," 92.1 2.0 95.3 95.6 98,7" 93.2 1.6 96.1 91.2 92.4 94.7 4.0 93.5 94.3 98.4 97.4 奶粉 8.0 97.4 92.5 94.3 91.2 6.0 91.4 93.8 92.8 94.3