冠状病毒透射电子显微镜形态学鉴定方法

冠状病毒透射电子显微镜形态学鉴定方法

国家标准 GB/T21637一2008 冠状病毒透射电子显微镜 形态学鉴定方法 Methodofmorphologiealidentifieationofcoronavirus byIsingtransmissionelecetronmicroscopy 2008-04-11发布 2008-10-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T21637一2008 前 言 本标准的附录A和附录B为资料性附录 本标准由全国微束分析标准化技术委员会提出并归口 本标准起草单位:科学院地质与地球物理研究所、人民解放军军事医学科学院基础医学 研究所、国家生物医学分析中心、医学科学院基础医学研究所、人民解放军第二军医大学基础 部、复旦大学上海医学院、广州兴世元生物光子微技术有限公司 本标准主要起草人;陈德惠、曾荣树、杨怡、刘世德,杨勇骥,俞彰、毕舒
GB/T21637一2008 引 言 随着电子显微学、病毒体外培养和病毒分离纯化技术的发展,有关病毒形态结构、化学成分,基因构 成以及其生物学特性等方面的知识日益增长 根据透射电子显微镜下病毒形态结构特征:病毒粒子的 形状和大小,衣壳的对称性(是立体对称还是螺旋对称)和大小,壳微粒的数目和排列,核衣壳在宿主细 胞内复制和组装的部位,有无包膜,包膜表面纤突的大小,形状及间距以及有包膜病毒芽生成熟的部位 等,并结合病毒的核酸和蛋白质的生物学以及分子生物学特性对病毒进行分类和命名 目前已知对人 类致病的病毒至少涉及22个科(Family)和两个未归类的病毒属(Genus) 在病毒的命名和分类学中 病毒的形态特征是首要的指征 实践证明,根据病毒的形态和形态发生学特征可以应用电子显微术准 确地鉴定病毒到科 为了正确指导人类病毒性传染病病毒病原的诊断和鉴定工作,有必要制定与人类 疾病相关病毒的透射电子显微镜形态学分析鉴定方法的国家标准
GB/T21637一2008 冠状病毒透射电子显微镜 形态学鉴定方法 范围 本标准规定了应用透射电子显微镜观察与鉴定冠状病毒的方法、要求和冠状病毒的形态和形态发 生学特征(参见附录A、附录B) 本标准适用于利用透射电子显微镜对冠状病毒形态的鉴定 术语与定义 下列术语和定义适用于本标准 病毒yirus -类比较原始的、仅含一种核酸(DNA或RNA)、能够自我复制和严格细胞内寄生的非细胞生物 病毒粒子virionm 复制、装配完善的成熟病毒颗粒 2.3 核衣壳nleeapsid 由病毒的蛋白质衣壳和核酸中心组成,有立体对称和螺旋对称两种 核衣壳螺旋对称helealsymmetryofnucleeapsidl 蛋白质亚基被复在缠绕的核酸外面,沿中心轴呈螺旋排列,形成高度有序,对称的稳定结构 2.5 包膜enelpe 在病毒核衣壳外面,由脂蛋白和黏蛋白组成的双层脂质膜 6 2. 表面突起或称纤突 taeeprujetm.pke orpeplomer 包膜的外层由糖蛋白构成的穗状突起,具有抗原性 2.7 负染egautivestain 利用高密度重金属盐(如磷钨酸、醋酸铀等)染液,将微小的病毒包围起来,在暗背景上显示病毒的 微细结构 2.8 ultrathinsection 超薄切片 采用超薄切片机将生物样品经固定包埋后,切成厚度为60nm80nm的超薄片,用于透射电镜 观察 仪器设备和材料 3.1主要仪器设备 透射电子显微镜; a
GB/T21637?2008 b ?; e)? d)?); ?; ??" fD ??; g h)?(30C70C). 33 2 ??? 3.2.1?(AR) ???,?1 1???? 2.0 2.5 ????/% 3.1 С 25%?/ml 11.5 0.075mol/LPBS/ml 3.2.2 ??? A?;2%?? 1g 50mL ?? B?:1%?? A? 1 0.24mol/LPBS 1 ?AR) 3.2.3 3.2.4? Epon812?,2. 2Epon812? ?(1;9) ?2;8 ? DMP-30 812 DDSA MNA 812 DDSA MNA 0.12 0.51 0.06 0.43 0.50 0.38 0.015 1.03 0.12 0.85 0.25 0.75 0.03 1.00 1.54 0.18 1.28 1.50 0.37 1.13 0.045 2.06 0.25 1.69 2.00 0.50 1 .50 0.06 2.58 0.30 2.12 2.51 0.61 1.88 0.075 0.4%?-??0.1%?0.2%???(Fomvar ? 3. 2. 5 ????;??????,?2g50%?100mL.,? 10min,1~2,????????????,? ???档 3.2.6? ?????,3
GB/T21637?2008 3????? ? Pb(NO3 1.33g Na(c,H.O.)2H.o 1.76g 30mL ?? ????? ??50ml?У30min 1NNaOH8mL,????,???50mL.,??pH??12,4C?档 3.2.7(AR) 2%??(PTA),pH??6.57.0. 3.2.8 λ??: 0.075nmol/Lλ?(PBSpH??7.4),?4 4λ?? NaHPO2H.O 0.198g 1.934x NaHPO12Ho ?? 100ml 0.075nnmol/L.PBS?0.19mol/L??(pH??7.4),?5 5??? NaH.PO2H.(O 0,198g NaHPO12H.O 1.934g 6.504g 100mL ?? 0.24mol/Lλ?(PEspH??7.4),?6 3 6λ?? NaH.PO2H.o 0.712 2g NaHPO12H.O 6,962g ?? 100ml. ?? ???? a ???????е??) b ????; D ??; ???(??); e ??(100000g,2h) ?? ? 5 1.1??;????(??)??,?С?Χ, ????,?羵??в???е???
GB/T21637一2008 背景则为无结构的灰色或黑色 负染样品不需要经过固定、脱水、包埋和超薄切片,而是直接对含病毒 悬液进行染色,操作简便、分辨率高,可用于病毒快速诊断 5.1.2直接负染法 5. 1.2.1将分离病毒培养细胞的上清液经低速离心除去细胞残渣,或超速离心(100000g,2h)提纯病 毒悬液滴在铺有封口膜的载玻片上 55 1. .2.2将经碳膜加固的被覆有支持膜(一般用火棉胶或Formvar膜)的载网倒扣在病毒悬液滴上静 min2min 置1 5.1.2.3夹起载网,用小滤纸片由载网边缘部吸去多余液体 立即将载网倒扣在负染液滴上[一般用2%磷鸽酸水溶液(PTA),pH值为6.了一7.0],静置 5 1.2.4 min一2min 5 1.2.5夹起载网,用小滤纸片吸去多余染液,自然凉干 1.2. 为了确保安全,防止病毒污染环境,带病毒载网必需在紫外线(700uw/enm'800uw/enm' 5 6 距离6.5cm)下照射载网的正反面各5min,待检 5.1.3琼脂扩散负染法 预先在载玻片上制备0.8%~2.0%的琼脂薄板 将上述待检病毒样品悬液滴加至琼脂薄板表面 5.1.3.2 1.3.3快速将经碳膜加固的支持膜载网倒扣在悬滴表面,静置约2nmin~3min .3.4待悬滴中水分即将全部吸进琼脂后,取出载网进行负染(同5.1.2.35.1.2.6),待检 5. 1. 超薄切片 培养细胞 前固定:在无菌室内(P3实验室)用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下,用离心机低速离心 (00!/min.5min)成小团块,弃上清,沿管壁加人2%一3%戊二陛固定液,放4C冰箱固定1h(样品送 电镜室制作超薄切片以前,装样品的玻璃器皿表面必需经碘酒和酒精消毒,避免污染环境) 5.2.1.2后固定;经戊二醛固定的细胞团块用缓冲液轻轻漂洗后,加人1%饿酸,放4C冰箱固定1h 5.2.1.3脱水;用梯度酒精或丙酮脱水 5.2.1.4包理:在按比例配制好的环氧树脂(Epon812)中浸透后,在胶囊(或硅胶包埋板)内进行包埋 5.2.1.5聚合;在恒温烘箱内进行聚合,35C、45C各12h,60C,24h 5.2.1.6修块:包埋块在进行超薄切片之前,需在修块机上进行修块 5 .2.1.7半薄切片;必要时先切14m 厚半薄切片经染色后,在光学显微镜下进行病变细胞定位 55 .2.1.8超薄切片;用制刀机制成的玻璃刀或砧石刀切制超薄切片,其厚度一般要求在60nmm~ 80nm ,按常规经醋酸铀和枸橡酸铅双电子染色后待检 病理活检或细针穿刺活检组织等 前固定;将活检组织在固定液中迅速切成小于1mm的小块,用戊二醛固定液进行前固定 组织块需浸泡在20倍体积的固定液中1h4h,4C 后固定同5.2.1.2. 5.2.2.2 5. 2.2. 3 脱水;同5.2.1.3 5.2.2.4包埋;同5.2.1.4 5.2.2.5聚合;同5.2.1.5 5.2.2.6修块:同5.2.1.6. 半薄切片同5.2.1." 5.2.2.7 5.2. 2. 8 超薄切片;同5.2.1.8 透射电子显微镜(TEM)鉴定步骤 6 TEM加速电压选择为60kV100kV
GB/T21637一2008 6.2TEM开机,调整确认仪器处于最佳工作状态后,即可按如下步骤观察,分析样品 6.3放大倍数的选择,通常选择放大倍数在6000倍一20000倍,若需要观察和拍摄病毒精细结构(如 病毒衣壳的对称性、壳微粒的数目,大小和排列,包膜表面有无纤突、纤突大小和形状以及螺旋对称核衣 壳丝的直径等)则选择放大倍数在30000倍60000倍 负染病毒样品的透射电镜观察 先在低倍(4000倍左右)观察样品全貌,并选择PTA着色的含病毒粒子的斑点或斑块 6.4.2逐步放大倍数,仔细寻找具有冠状病毒形态特征的病毒粒子,精细聚焦,并拍片(一般在 20000倍~60000倍拍片) 负染冠状病毒形态特征 在负染样品中,冠状病毒或单个或成群呈现在被包围的灰色或黑色染液背景中,病毒呈球形或多形 态,直径一般在60nm一220nm,有包膜 核衣壳螺旋对称,直径9nm~13nm包膜表面有大而宽距的 梅花瓣状纤突(糖蛋白)长约20nm,末端宽10nm,呈皇冠状分布[图1la)] 6.5超薄切片样品的透射电镜观察 6.5.1先在低倍(4000倍左右)观察,寻找呈现病变的细胞 6.5.2逐步增加放大倍数,仔细观察细胞超微结构是否正常,寻找在细胞内外有无病毒粒子,一旦发现 具有冠状病毒形态特征的病毒粒子,精确聚焦并拍片(一般放大倍数在10000倍30000倍即可,少数 需放大60000倍 6.5.3感染细胞内冠状病毒的形态学和形态发生学特征 病毒在感染细胞胞质内复制、组装,在粗面内质网内膜上芽生成熟 在显著扩张的核周隙和粗面内 质网池中常充满数目不等的成熟病毒粒子 病毒粒子呈球形或多形态,直径60nm一220nm,有包膜 核衣壳螺旋对称,其直径9nm~13n nm 包膜表面有细长排列呈冠状的纤突,长约20n nm 病毒粒子经 胞吐释放到细胞外,大量病毒粒子常聚集在细胞突起之间或附着在细胞质膜表面 在有的感染细胞中 还可以查见含完整或不完整病毒粒子的致密体;有可能是一种自嗒体,而不是糊毒包函体[图Ib)~心 图2a)~d] 形态学鉴定结果的质量要求和报告 7.1电镜图片要求清晰,层次分明 超薄切片样品要求细胞超微结构清晰,病毒包膜(双层脂质膜)和 核衣壳丝清晰可辨 负染样品要求包膜表面纤突(spikes)清晰可辨 7.2要认真填写原始记录,包括样品来源,送检日期、编号、拍片条件、底片和照片的编号及标尺或准确 的放大倍数 7.3鉴定分析报告附有高清晰电镜图片,图片应显示 病毒粒子的直径和形状; a b病毒粒子的双层脂质包膜; 包膜表面纤突的长度和形状: D 病毒在感染细胞内组装的部位; 病毒在感染细胞内芽生成熟的部位 成熟病毒粒子的释放方式 图片应有精确的标尺,以利计算病毒粒子、纤突和核衣壳的直径或/和长度 g
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GB/T21637一2008 附 录A 资料性附录 冠状病毒科病毒粒子形态学 virionofCoronaviridae (orpholoeef 病毒粒子有包膜,呈球形 冠状病毒属(genuscoronavirus)的成员,一般直径为120nm一160nm 有一个可能是H面体,约65nm的核心壳以及包含在其中的核衣壳蛋白(N)和RNA基因组 冠状病 毒有大的表面突起(spikes),由长约20nm的柄和球形顶端的三聚体纤突蛋白(peplomers;trimersof spikeprotein)构成 在有的冠状病毒,如牛冠状病毒(EBCoV)和某些小鼠肝炎病毒株(MHV)还可以观 察到由凝血素酯酶(HE)糖蛋白构成的第二层纤突蛋白 应用冷冻电子显微镜可以观察到在冠状病毒 的包膜和核心(core)之间有一个裂缝,用洗涤剂处理后核心可以裂开,释放出含N蛋白的螺旋对称核 衣壳 摘译自:国际病毒命名学委员会CICTV第八次报告(EightReportoflnternationalCommitteeof VirusTa ，2005. axonomy)，
GB/T21637?2008 B ? ?? ?? TaxonomicStrctureofCoronavirus ???(TaxonomicStruetureofCoronavirus) ?(Order)?(Nidovirales) (Family)?(Coronaviridae) (Genus)?(Coronavirus) ????(SpeeiesintheGenls ?鲡(Group1Speeies) CCoV ?(Caninecoronavirus è?(FelinecoronavirusFCoV FIPV è????(Felineinfeetiousperitonitisvirus Humancoronavirus229EHCoV-229E) ??229E(He ?к(Por PoreineepidemiediarrheavirusPEDV ransmissible TGEV) θ?(Tr gastroenteritisvirus orcinerespiratorycoronavirusPRCoV ?(Pon ?鲡(Grp2spetites) coronavirusBCoV ??(Bovine umancoronavirusOC43HCoV-OC43 ??0C43(Humn ??HumanenterieccoronavirusHECoV inehepatitisvirusMHV С?(Murin encephalomyelitisvirusHEV ???(Por rrcInehemagglutlnatung 1osiscoronavirusPCoV ??(Puffinu ?(RatcoronavirusRtCoV eacuterespiratorysyndromecoronavirusSARS-CoV ?????(Severe 鲡(Group3Speceies) ??(InfeetiousbronehitisvirusIBV) ?(PheasantcoronavirusPhCoV ???(turkeycoronavirusTCoV ???(TentativeSpeeiesintheGenus) ù?(RabbitcoronavirusRbCoV ReportofInternationalCommitteeof ??????ccr???α(Eiaebhit VirusTaxonomy)2005.
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