琼脂糖分离介质

琼脂糖分离介质

国家标准 GB/T38170一2019 琼脂糖分离介质 Agar0se-basedchromatographicmedium 2019-10-18发布 2019-10-18实施 国家市场监督管理总局 发布 币国国家标准化管理委员会国家标准
GB/38170一2019 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由标准化研究院提出并归口 本标准起草单位:科学院过程工程研究所,标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限 公司 本标准主要起草人;黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉,苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云
GB/38170一2019 琼脂糖分离介质 范围 本标准规定了琼脂糖分离介质的分类、技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和 贮存 本标准适用于琼脂糖分离介质的生产与检测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T191包装储运图示标志 GB/T5475离子交换树脂取样方法 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 琼脂糖分离介质agarse-baselehromatographiemedium 以琼脂糖为主要原料制备的 一类球形分离介质 3.2 非特异性吸附量amountofnon-specifieadsorptionm 琼脂糖分离介质对细胞色素C的吸附量 分类 按琼脂糖含量分为4%琼脂糖分离介质和6%琼脂糖分离介质 技术要求 S 5.1外观要求 琼脂糖分离介质应球形饱满、表面光滑,在光学显微镜下应具有透明性 5.2性能要求 应符合表1中的规定
GB/T38170一2019 表1琼脂糖分离介质的主要性能要求 指标 项目 4%琼脂糖分离介质 6%琼脂糖分离介质 平均粒径(a/4nm 90,0士13.5 34.0士6.8 90.0士13.5 34.0士6.8 粒径 / 90" 90" 范围粒径比(w较轻/ >90" 90" 27o 2l0 60 60 最高流速'/em/h) 7.50士1.6o 10.50士2.00 固含量/% 0.580.70(M=200000) 0.430.62(M,=200000 0.63~0,75(M,=100000) 0.68一0.82(M,=50000 分配系数K 0.77~0.89(M,=20000) 0.72~0.86(M,=10000 非特异性吸附量"/g/ml <18 18 菌落总数/(CFU/ml) 100 <100 0.25 0.25 pH3.0 5-羚甲基糠醛脱落量 4g/ml) DH13.0 s0.15 s0.15 注M,为探针分子相对分子质量 粒径在45.0rm165.0Hm范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比 粒径在24.0Hm44.0Mm范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比 在0.1MPa压力下可达最高流速 以葡聚糖为溶质 每毫升介质对细胞色索C的吸附量 6 检测方法 6.1外观 6.1.1样品处理 按照GB/T5475直接从产品中抽取5mlL样品,置于50mLG3型号砂芯漏斗中抽干5min 用符 合GB/T6682的三级水请洗5次,每次2mmin.最后用真空泵在0.1MPa压力下抽干5min 将洗净的 琼脂糖分离介质置于烧杯中,向其中补加三级水,保证琼脂糖分离介质上应有2cm的三级水 混匀后 得到琼脂糖分离介质与水的混合体系 6.1.2样品观测 用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上,调整显微镜放大倍数 以视野里80%以上面积均为琼脂 糖分离介质为标准,用塑料吸管增战载玻片上的琼脂糖分离介质,最后用盖玻片压上 调节光学显微锐 焦距,使视野中的影像清晰 拍摄琼脂糖分离介质照片并保存 6.2粒径 6.2.1样品处理 方法同6.1.1
GB/38170一2019 6.2.2样品检测 设置激光粒度仪参数如下:测量颗粒类型为通用型,分散剂类型为水,分析模式为单峰模式,添加样 品进行测定 6.2.3结果计算 6.2.3.1 范围粒径比 按式(1)计算 w较孩 式中: W 范围粒径比,%; 粒径 w -粒径为k(m)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比.% 试样颗粒粒径在45.04m165.04mm范围内,n=165;试样颗粒粒径在24.0m一44.04m 范围内,n=44:; 试样颗粒粒径在45.0焦mm~165.04m范围内,i=45;试样颗粒粒径在24.0m一44.0nm 范围内,i=24 6.2.3.2平均粒径 平均粒径按式(2)计算 盛" d N 式中 所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径,单位为微米(4m); 单个颗粒的粒径,单位为微米(um); da 所统计的介质颗粒的数目 N 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 6.3最高流速 6.3.1样品处理 方法同6.1.1 6.3.2样品装柱 选用1.60cm×20.00cm的层析柱,堵住柱子出口,将介质与水的混合浆液倒人层析柱中,静置. 控制介质床层高度为10.00cm士0.20em,柱子上端充满水 打开柱子人口,以0.5mL/min的流速连 续向柱中通人10个柱体积的三级水,床层稳定后即可进行测试 6.3.3样品测定 将层析柱连人中低压层析系统 测定时,从零开始设定一定流速u,(mL/min),保持该流速5nmin 后,记录此时柱压力,(MPa) 继续增加流速,并测定相应流速下的柱压 直到压力达到0.10MPa为 止,此时对应流速记录为o1
GB/T38170一2019 6.3.4结果计算 最高流速按式(3)计算 60aa 3 F m4x 式中 F -最高流速,单位为厘米每小时(cm/h); 在0.10MPa压力下的体积流速,单位为毫升每分(mL/min) Uo. 层析柱截面积,单位为平方厘米(em'); 60 分钟转化为小时的换算系数 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 6.4固含量 6.4.1样品处理 方法同6.1.1 6.4.2样品称量 将5ml琼脂糖分离介质与水的混合体系装人带10Mm孔径筛板的离心柱内,置于离心机在 2000r/min下离心5min 取出离心管,将样品小心倒人称量瓶内,盖严 在已恒重的两个称量瓶中 分别称人1.0g上述分离介质精确至0.1mg 6.4.3样品烘干称量 将称量瓶开盖置于烘箱中,于105.0干燥至恒重 将称量瓶盖严,取出置于干燥器内,冷却 30min至室温,称量 6.4.4结果计算 固含量按式(4)计算 nn 1 ×100 ml一1 式中 固含量,% W 干燥前称量瓶加试样质量,单位为克(g); m 干燥后称量瓶加试样质量,单位为克(g); m 称量瓶质量,单位为克(g) mo 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 6.5分配系数K 6.5.1溶液配制 6.5.1.11%体积分数)丙酮溶液 准椭量取01mL丙围,加水混合,定容至Iml 6.5.1.22mg/m葡聚糖溶液 准确称取2mg葡聚糖,加水混合,定容至1mL
GB/38170一2019 6.5.1.3缓冲液,pH7.0 准确称取10.93g十二水合磷酸氢二钠,3.04g二水合磷酸二氢钠和8.76gNaCI,加水溶解,调pH 为7.0,最后定容至1000ml. 6.5.2样品处理 方法同6.1.1 6.5.3样品装柱 选用1.00cmX30.00cm的层析柱,将介质与水的混合浆液倒人层析柱中,堵住柱子出口,静置， 控制介质床层高度为30.00cm士0.20cm 打开柱子出人口,以一定流速连续向柱中通人10个柱体积 的三级水,床层稳定后即可进行测试 对于904m介质,流速为9.0mL/min,对于34m介质,流速为 6.0mL/min 6.5.4样品测定 用缓冲液以1.0mL/min的流速平衡层析柱至示差检测器信号基线平衡 上样1%丙酮溶液测定 丙酮的洗脱体积V,上样相对分子质量M,=2000000葡聚糖测定洗脱体积V. 再将不同相对分子质 量的葡聚糖单独上样;对于4%琼脂糖分离介质依次是葡聚糖M,=200000,葡聚糖M,=100000,葡聚 糖M,=20000;对于6%琼脂糖分离介质依次是葡聚糖M,=200000,葡聚糖M,=50000,葡聚糖M =10000 所有葡聚糖样品浓度为2.01 /ml 上样量均为200!L )mg/" 结果计算 6.5.5 分配系数K,按式(5)计算 导= K一 式中: V 各样品的洗脱体积,单位为毫升(ml); V -丙酮的洗脱体积,单位为毫升(mL); V 相对分子质量M,=2000000葡聚糖洗脱体积,单位为毫升(mL). 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 6.6非特异性吸附量 6.6.1溶液配制 6.6.1.1 缓冲液A,plH7.0 准确称取4.37gNa.lHPoO 12H.0和1.22gNaHPO 2H.O,加三级水溶解,调pH为7.0,最 后定容至1000mL,用0.454m过滤膜进行过滤 6.6.1.2缓冲液B.pH7.0 准确称取4.37只NaHPO12H.0和1.22只NaH,PO2H.O和8.76只NaCI,加三级水溶解 调pH为7.0,最后定容至1000mL,用0.45m过滤膜进行过滤 6.6.1.32.0mg/ml细胞色素C溶液 准确称取200.0mg细胞色素C于100ml容量瓶,用10ml缓冲液A溶解,定容,配成2.0mg/mL的
GB/T38170一2019 标准储备液 上样前用0.45Mm过滤膜进行过滤 6.6.1.4细胞色素c标准工作溶液 分别取0.00ml2.50ml5.00ml、12.50ml、25.00mlL、40.00m细胞色素C标准储备溶液至 00ml容量瓶中,用缓冲液A溶液稀释至刻度,配成0.00mg/mL0.05mg/mL,0.10mg/m 0.25mg/mL、0.50mg/ml,0.80mg/ml标准工作溶液 6.6.2样品处理 方法同6.1.1 6.6.3样品装柱 选用1.60em×20.00cm的层析柱,堵住柱子出口,将介质与水的混合浆液倒人层析柱中,静置 控制介质床层高度为5.00cm士0.20cm 打开挂子人口.,以1.0mL/min的流速连续向柱中通人10个 柱体积的三级水,床层稳定后即可进行测试 6.6.4样品测定 以缓冲液A平衡,流速为2.0mL/min,蛋白上样了ml 经缓冲液A淋洗至淋洗液没有蛋白出现 再经缓冲液B洗脱,收集对应洗脱峰 记录洗脱峰体积VE(mL) 用紫外分光光度计检测标准工作溶 液和洗脱峰在280nm处的吸光度An,以标准工作溶液的吸光度与蛋白浓度做标准曲线,通过标准曲 线定量洗脱峰蛋白浓度 6.6.5结果计算 非特异性吸附量按式(6)计算 CV W、= ×1000 6 V， 式中 W 非特异性吸附量,单位为微克每毫升(g/mL); C; -洗脱峰蛋白浓度,单位为毫克每毫升(mg/mL),由标准曲线计算出 V -洗脱峰体积,单位为毫升mL); 琼脂糖分离介质的体积,单位为毫升(mL) 'd 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10% 6.7菌落总数 6.7.1样品前处理 方法同6.1.l 6.7.2样品测定 参照《药典2015年版)(l105)非无菌产品微生物限度检查-微生物计数法进 行 取1ml抽干介质,加人1ml三级水,采用涡旋混合器混匀样品 将含有30ml胰蛋白胯大豆琼 脂培养基的锥形瓶121.0C灭菌20min,放人40.0C恒温箱中,待培养基冷却到40.0C时,用微量移液 器吸取1ml混匀后的样品加人到该锥形瓶中,混匀,把混合物倒人培养皿中,盖好上盖 在室温下使 混合物凝固 把培养皿置于恒温箱中35.0C孵育5d
GB/38170一2019 6.7.3结果计算 孵育期后检查培养皿,计数菌落形成单位数(CFU). 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过5CFU/ml悬浮液 .85-羚甲基糠醛脱落量 6.8.1溶液配制 6.8.1.110%(体积分数)甲醇水溶液 准确量取100ml色谱纯无水甲醇,与900ml二级水混合均匀,再用0.22m孔径的滤膜过滤,超 声除气泡 6.8.1.25-胫甲基糠醛标准储备溶液 称取20.0mg5-羟甲基糠醛标准物质于100ml容量瓶,用10ml 10%甲醇水溶液溶解,定容,配 成0.20mg/ml的标准储备液 6.8.1.31mmol/盐酸溶液pH3.0 量取0.083mL浓盐酸(12mol/L)稀释定容为1000mL,调节pH为3.0. 6.8.1.4100mmo/L氢氧化钠溶液pH13.0 称取4.00g氢氧化钠固体,溶于100mL三级水中,待冷却至室温后用三级水定容为1000mL,调 节pH为13.0. 6.8.1.5标准工作溶液 分别吸取5-羚甲基糠醛标准储备溶液5AL,15AL,25AL、40AL,50AL、100AL、1mL、2mL至 100mL容量瓶中,用10%甲醇水溶液稀释至刻度,配成0.014g/mL、0.034g/mL、0.054g/mL 0.084g/mL、0.104g/mL,0.204g/mL、1.004g/ml,2.004g/mL标准工作溶液 现配现用 6.8.2样品处理 清洗方法同6.1.1 然后取若干份1.00【抽干琼脂糖分离介质置于带盖玻璃试管内 分别取 10nmlpH3.0,pH13.0的溶液置于各试管内,样品管在40.0C条件下培养 7d后,将上层清液转移 到干净的试管内 上层清液经旋转蒸发(60.0C,50r/nmin),定容至2mL,加人等体积12mol/L盐酸,100.0C水解 lh 定容至5ml 用0.454m的滤膜过滤,得到样品待测液 6.8.3样品测定 高效液相色谱条件:色谱柱选择C,5Mm,250mm×4.6mm(内径);流动相是10%甲醇水溶液 流速1.0mL/min;检测波长285nm;柱温30.0C;进样量10L 以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测 记录标准工作溶液的保留时间 以及峰面积,以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线 以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性,并 记录下该保留时间处峰的面积,用标准工作曲线对样品进行定量
GB/T38170一2019 6.8.4结果计算 5-胫甲基糠醛脱落量按式(7)计算 X m×1.4 式中 介质中5-羚甲基糠醛的脱落量,单位为微克每毫升(4g/mL): C 从工作曲线求得的试样溶液中5-羚甲基糠醛的浓度,单位为微克每毫升(4g/mL); -试样经盐酸水解后最终的定容体积,单位为毫升mL) -称取的琼脂糖分离介质的质量,单位为克(g) mm 1.4 琼脂糖分离介质质量转化为体积的换算系数 在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%. 检验规则 7.1组批 同一工艺周期生产,质量均一的产品为一批 7.2抽样 按GB/T5475的规定进行 7.3出厂检验 每批产品出厂前应进行检验,检验合格的产品方可出厂 出厂检验项目为第5章中规定的粒径、最 高流速,分配系数和菌落总数 7.4型式检验 7.4.1正常生产时,每半年应进行一次型式检验,有下列情况之一时应进行型式检验: a) 新产品试制鉴定时; 正常生产后,如原料、工艺、设备有较大变化,可能影响产品性能时; b 产品停产半年以上恢复生产时 c 出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时 d 监督机构提出要求时 e 7.4.2型式检验项目为第5章中规定的所有项目 7.5判定规则 7.5.1出厂检验判定和复检 7.5.1.1 出厂检验项目符合7.3中项目要求,判定本批为合格品 7.5.1.2出厂检验项目1一2项不符合要求,应复检,复检后如仍有1项不符合要求,则判定该批为不合 格品 7.5.1.3出厂检验项目超过2项不符合要求,判定该批产品为不合格品 7.5.2型式检验判定和复检 7.5.2.1型式检验项目符合7.4中项目要求,判为合格品
GB/38170一2019 7.5.2.2型式检验项目13项(含3项)不符合要求,应复检,复检后如仍有1项不符合要求,则判定该 批为不合格品 7.5.2.3型式检验项目超过3项不符合要求,判定该批产品为不合格品 标签、标志,包装,运输和贮存 8.1标签 应至少包括以下内容: 产品名称; a b 型号; c 体积; d)生产批号; 生产组织; e f 生产日期; g 有效期; h注意事项 8.2标志 包装储运标识应符合GB/T191的规定 8.3包装 宜选用塑料瓶包装,包装材料应确保产品在运输、,贮存时不被污染和泄漏 8.4运输 应在常温环境下运输,避免过冷或过热,且采取措施防止产品失水 8.5贮存 应在4C8C环境下贮存,有效期为五年,超过有效期可按本标准规定进行复验,若复验结果符 合标准要求,仍可使用

琼脂糖分离介质GB/T38170-2019

琼脂糖是一种富含多糖的天然高分子化合物，广泛应用于制备各种生物学试剂和分离介质。作为一种分离介质，琼脂糖具有许多优点，如稳定性好、分离效果明显等。

GB/T38170-2019是我国针对琼脂糖分离介质制定的标准，其中规定了琼脂糖分离介质的物理化学性质、技术要求和检验方法等方面的内容。该标准旨在确保琼脂糖分离介质的质量和性能，在生物学领域中得到更加广泛的应用。

使用琼脂糖作为分离介质具有许多优点，如分离效果好、稳定性高等。在生物学研究中，琼脂糖常被用于细胞培养、酶的分离纯化、蛋白质电泳等方面。

使用琼脂糖作为分离介质的方法多种多样，包括琼脂糖凝胶电泳、硅胶层析、亲和层析等。其中，琼脂糖凝胶电泳是一种常用的方法，可以对不同大小的生物分子进行分离。在该方法中，琼脂糖凝胶作为一种分离介质，具有孔隙结构，能够根据分子的大小或电荷来实现分离。

总之，琼脂糖作为一种分离介质，在生物学领域中得到了广泛应用。GB/T38170-2019标准的制定，将进一步规范琼脂糖分离介质的质量和性能，促进琼脂糖的更加广泛应用。

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