化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法

化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法

国家标准 GB/T35515一2017 化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶 抑制活性试验方法 Chemieals一Fishassayfor0estrogenicandandrogenicactiity, andaromataseinhibition 2017-12-29发布 2018-07-01实施 中华人民共利国国家质量监督检验检疙总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35515一2017 26 附录F资料性附录卵黄蛋白原加标和批间标准品分析 附录G资料性附录统计分析流程 28 附录H规范性附录试验结果阐释和可接受性的标准 29 参考文献 图A.1用剪刀沿着胸鳍前剪开 mtm处 图A.2用剪刀沿着腹部中线伸人腹部离肛门头部大约2n 图A.3采用手术钳撑开腹壁,暴露肝脏以及其他内部器官(或者将腹壁横向固定 10 图A.4采用手术钳缓慢分离和切除肝脏 l0 图 采用手术钳缓慢摘取肠道 图 肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割 雌鱼)对于雌鱼过程相同 11 图 完成整个过程 1l 图 1 斑马鱼鱼头鱼尾的切分 17 图 黑头呆鱼珠星的数目和尺寸 I9 图 B.2臀鳍形状和尺寸的性别差异 图B.3臀鳍线的结合板上的突起过程 图B.4带有切割点的鱼身照片 图 斑马鱼产卵基板 图 D.2黑头呆鱼产卵基板 8 图 G.,1统计分析流程图 表B.1黑头呆鱼珠星模板 18 表c.1鱼类内分泌筛选试验的实验条件 21 表E.1可接受的稀释水的一些化学特性 25
GB/35515一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 andDeedpmeat 本标准技术内容与经济合作与发展组织(OrganizationforEconomieCo0 ooperation OECD)测试导则230(2009年)《21d鱼试验;雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性短期筛选试验》(英文版 -致 本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(sAC/TC251)提出并归口 本标准起草单位:检验检疫科学研究院、广东省微生物分析检测中心、上海市检测中心、宁波出 人境检验检疫局 本标准主要起草人:崔媛、陈会明、曾国驱、李海山、谢文平梅承芳、股浩文、梁艺怀、陈小青
GB/T35515一2017 引 言 本试验方法描述了一种体内筛选试验方法,将性成熟的雄鱼和处于产卵期的雌鱼一起暴露于化学 品中21d 在21d暴露期结束时,对雄鱼和雌鱼的生物标志物终点进行测定,作为测试化学品的雌激 素、芳香酶抑制或雄激素活性指标 这些测试终点包括卵黄蛋白原和第二性征 对黑头呆鱼、日本青峭 和斑马鱼可进行卵黄蛋白原测定,而第二性征只能在黑头呆鱼和日本青鳍上测定 卵黄蛋白原通常受循环的内源性雌激素的刺激,由雌性卵生脊椎动物的肝脏产生 卵黄蛋白原是 卵黄蛋白的前体，一旦在肝脏中产生,由血流进人卵巢,被发育中的卵吸收并修饰 卵黄蛋白原在未成 熟的雌鱼和雄鱼的血浆中几乎检测不到,因为它们缺乏足够的循环雌激素,但在受外源性的雌激素的刺 激下,肝脏能够合成并分泌卵黄蛋白原 卵黄蛋白原的测定能够检测不同雕激素作用模式的化学品,对雌激素类化学品的检测,有可能通过 测量雄鱼的卵黄蛋白原的产生 在雌性体内的雌激素循环水平的降低,例如通过抑制转化内源性雄激 素为天然雕微素173-雕二醉的芳香酶,会引起卵黄蛋白原水平的降低,这一点被用来检测具有芳香酶 抑制性质的化学品 采用已建立标准化的常规检测方法 采用免疫化学的物种特异性的酶联免疫吸收分析(ELISA)方 法,收集黑头呆鱼的血液、斑马鱼的血液或头/尾的匀浆以及青鳍的肝脏,作为VTG测定的样品 对于 青鳍,在血液中测量的VTG;与肝脏中所测具有良好的相关性 附录A提供了对于卵黄蛋白原分析的 样品收集的推荐程序 卵黄蛋白原可采用不同的试验方法,但都得基于验证的物种特异性ELIsA 方法 特定物种雄鱼的第二性征是可观察的,与内源性雄激素循环水平呈定量响应性,这些特性在黑头呆 鱼和青鳍上能体现,但斑马鱼没有体现,因为斑马鱼不具备可定量的第二性征 对于黑头呆鱼,外源受试物暴露的主要指标是位于雌鱼唇部珠星的数量 对于青鳍,乳突物的数目 组成了雌鱼的外源性暴露于雄激素受试物的主要标志物 附录B分别说明了对于黑头呆鱼和青鳍的 性特征评价的过程 IN
GB/35515一2017 化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶 抑制活性试验方法 范围 本标准规定了化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法的方法概述、质量保证与质量 控制,仪器设备,试验准备,试验程序,试验过程、数据和报告 本标准适用于化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验 术语、定义和缩略语 2.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 2.1.1 承载率loadingre 单位体积水中鱼的湿重 2.1.2 承载密度stnkindensity 单位体积水中鱼的数目 2.1.3 ;VTG 卵黄蛋白原vitelogenin;N -种磷脂糖蛋白,蛋黄蛋白的前体,一般出现于所有卵生动物的性成熟雌性个体 2.1.4 最大耐受浓度maximumtoleratedlconeentration;MIc 受试物引起小于10%死亡率的最高试验浓度 2.2缩略语 下列缩略语适用于本文件 ELISA:;酶联免疫吸附法(enzyme-linkedimmunosorbentassay 方法概述 将处于繁殖期的雕鱼和雄鱼共同暴露于受试物中 根据所选受试鱼物种对其相关生物标志物终点 指标进行测定 其中性特征可在解剖后目测确认,其他生物测试指标参见附录C的表C.1 设置3个 受试物浓度以及一个空白对照,必要时可采用溶剂对照 对于青觞和斑马鱼,每个受试浓度至少有2个 试验容器(每个试验容器中包括5尾雄鱼和5尾雌鱼);对于黑头呆鱼,每个受试浓度至少有4个试验容 器(每个试验容器中包括2尾雄鱼和4尾雌鱼) 暴露进行21d,在第21天暴露时对鱼进行取样 在第21天取样时,所有动物处以安乐死 对于黑头呆鱼和青鳍进行第二性征检测,参见附录B;取 斑马鱼和黑头呆鱼血液样本,或者取斑马鱼的头/尾组织匀浆样本检测卵黄蛋白原,参见附录A;对于青
GB/T35515一2017 鳍,收集肝脏检测卵黄蛋白原,参见附录A 质量保证与质量控制 质量保证与质量控制要求如下 试验结束时对照的死亡率不超过10%; a b 试验期间溶解氧浓度不低于空气饱和值(AsV)的60% 试验期间各试验容器间的水温不超过士1.5,并应保持在受试生物适宜温度的士2范围 c 内,参见附录C; d 受试物浓度在配制浓度的士20%之内 5 仪器设备 所需仪器设备如下 溶氧仪和pH计; a b 水硬度计和碱度计 c 温度控制及连续测温的设备 d 用化学惰性材料制成的试验容器,参见附录C; 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板,参见附录D中的图D.1和图D.2 e f 适宜的精密天平(至少精确到士0.5mg) 6 试验准备 6.1试验用水 6.1.1水质 试验用水应保证试验用鱼的存活和生长 试验期间水质保持恒定 试验用水的pH值在6.5~8.5 之间,变化保持在士0.5的范围内 定期分析水样,测定重金属如Cu,Pb,Zn、Hg,Cd和Ni),主要的 阴阳离子(如Ca+,Mg+,Na+K+,CI和sO,农药(如总有机磷和有机氧农药)和总有机碳和悬 浮物 合格稀释水的要求参见附录E中的表E.1 6.1.2试验溶液 通过稀释贮备液的方法来配制所确定浓度的试液 贮备液的配制推荐采用机械方式(例如搅拌或 超声)使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动 饱和度(溶解度)可用来获得适当浓度的贮备液 不推荐使用助溶剂或分散剂,但需使用时应设置溶剂对照 对于难溶物,推荐使用溶剂2 溶剂的选 择由物质的化学性质决定 建议溶剂最高浓度为100L/L 流水式试验需具备连续分配和稀释受试物贮备液的系统 定期检查贮备液和稀释水的流速,试验 期间的变化不大于10% 6.2鱼的驯养 6.2.1试验鱼应来自单一种群,并来自同一批卵或幼鱼 试验前应与试验相同的条件下驯养14d以 上 相关试验条件参见附录C 6.2.2经过48h的适应期,根据下列标准记录死亡率
GB/35515一2017 7d内死亡率小于5%,可用于试验; a b)7d内死亡率在5%10%之间,继续驯养7d,如果死亡不再发生,该批试验鱼可用于试验 7d内死亡率大于10%,舍弃整组鱼 c 试验开始前的两周内及试验期间不对鱼进行任何疾病处理 6.3预暴露和鱼的选择 推荐采用7d的预暴露期,并采用与正式试验相同的容器 在整个驯养和暴露期间,鱼适量投喂 在受试鱼产卵活跃时开始暴露黑头呆鱼在25C士2C条件下进行培养,应为20(士2)周龄;目本青纷 在25C士2C条件下进行培养,应为16(士2)周龄;斑马鱼在26C士2C条件下进行培养,应为16(士2) 周龄 试验程序 7.1 -般说明 试验设计3个受试物浓度,1个对照以及1个溶剂对照(如必要) 对试验组和对照组进行数据分 析,以确定是否具有统计学显著性差异 对于斑马鱼和青鳍,在试验的第21天,每个浓度组和对照组中取样(2个平行样,每个平行样5尾 雄性和5尾雌鱼测试卵黄蛋白原以及第二性征 对于黑头呆鱼,在暴露的第21天,每个浓度组和对 照组中取样(4个平行样,每个平行样2尾雄性和4尾雌鱼)测试卵黄蛋白原和第二性征 7.2试验浓度的选择 针对试验目的,最高试验浓度应由MTC决定 使用这种方法的前提是已有急性致死数据或其他 毒性数据可以用来估算MTC 设置3个浓度组,浓度间隔系数不超过10,稀释水作为空白对照组(必要时采用溶剂对照) 推荐 浓度间隔系数在3.2~10之间 应尽量避免使用助溶剂,如必须使用,其在所有试验容器中的浓度不能超过100AL/L 试验过程 8.1受试鱼的选择与称重 试验开始时保持试验鱼的重量差异小 推荐试验用鱼的大小范围参见附录c 试验用鱼的个体体 重应在平均体重的士20%内 试验前取部分鱼样品称量以测定平均体重 8.2暴露条件 8.2.1时间 在预暴露之后,试验时间为21d 8.2.2驯养 投喂适当饵料(附录C) 每天喂食的量可分为同等的两份或多份,并分次投喂,每次间隔至少3h 取样或解剖前12h内不投喂 对于投喂的饵料应进行污染物评估,如有机氧农药、多环芳姬(PAHs),多氧联苯(PCBs) 避免使 用含有较高水平的植物雕激素的饵料
GB/T35515一2017 每周至少两次用吸管清除容器底部的饵料残渣和排泄物 8.2.3灯光和温度 光照和水温参见附录C 8.3测试频率 试验期间定期测定受试物浓度 每天检测稀释水与受试物贮备液的流速,流速变动不得超过10% 试验开始时及其后每周1次、 测定受试物浓度 试验结果应以测定浓度为准 试验期间受试物浓度保持在配制浓度的土20%内,结 果可采用配制浓度 对样品进行离心或过滤(例如使用0.45Mm孔径滤膜),推荐离心 试验期间应测定所有试验容器中的溶解氧、水温和pH值 测定对照组和1个最高浓度组中的总 硬度和pH值 至少在1个试验容器中连续监测水温 8.4观察 8.4.1死亡率 在试验期间每天观察鱼,记录死亡率,尽早移去死掉的鱼 试验期间死掉鱼的性别需通过观察性腺 来确定 8.4.2行为和表观 注意任何异常行为(相对于对照组),如呼吸困难、,游动不协调、失衡、厌食 另外也需要注意表面异 常(如出血、变色) 在进行数据解释时,需仔细考虑这些毒性表现"” 在移除受试鱼时需对外观(如颜色)进行观察 对于黑头呆鱼,具有内分泌活性化学品可能诱发以 下表面特征的变化体色(明或暗,着色模式(垂直带的存在)和体形(头部和胸部区域) 因此在试验期 间及试验结束时,需对鱼的外观进行观察 8.4.3鱼的安乐死 在21d暴露结束时,使用100mg/几一500mg/几三卡因甲烧磺酸(Metacain.MS-222.CAs.886-86- 2)对受试鱼实施安乐死,采用300g/LNaHcO缓冲(小苏打,CAS.144-55-8),减少黏膜刺激 取血 或组织进行卵黄蛋白原检测,如附录A所示 8.4.4第二性征的观察 具有内分泌活性化学品可诱发特定的第二性征的少化雄性黑头呆鱼珠星的数目、雄性青鳍乳突 物) 黑头呆鱼和青鳍的第二性征评价推荐程序,参见附录B. 1) 这类行为观察可以提供有用的定性信息 例如,黑头呆鱼暴露于雄性激素时,能观察到正常的雄性或雄性化的 雕鱼的领域性行为;斑马鱼暴露于雕激素或抗雄激素后,其交配和在拂晓光照产卵的特征行为有所减少或 抑制 特定作用模式的化学品可能会导致动物异性的异常第二性征发生;例如维激素受体激活剂,如去甲雄三烯醇 酮、甲睾酮和双氢睾酮,可能会导致雌性黑头呆鱼形成明显的婚珠星或雕性青形成乳突物 雕激素受体激活 剂会减少珠星数目和成年雄性颈背背垫的尺寸 总体的形态学观察可以提供有用的定性和定量信息 黑头朵 鱼珠星的数量和尺寸大小以及青蜥的乳突物可以直接量化或更切实的保存标本
GB/35515一2017 8.4.5卵黄蛋白原测定 采用肝素钠润洗的毛细管从尾静脉取血或肝素钠润洗注射器穿刺心脏动脉取血 黑头呆鱼每尾鱼 收集的血的体积为5L一60AL,每尾斑马鱼5AL~15AL 血浆通过血液离心得到,加蛋白酶抑制剂 后在一80中储存待用 青觞可采用肝脏样品、斑马鱼可采用头/尾匀浆液进行卵黄蛋白原测定,参见 附录A 使用标准品对卵黄蛋白原测定进行质量控制 对每个ELISA方法,都应进行基质效应试验(样品 稀释效应)以确定最低样品稀释倍数 用来进行VTG分析的ELIsA板包括下列质量控制样品;至少 个校准标准品,其浓度范围诵盖预期的卵黄蛋白原浓度,至少1个非特异性结合分析试验空白样(一 6 式两份) 这些空白样的吸光度应小于最高校准标准吸收的5% 至少对每个样品稀释液的两个等份 平行样)进行分析 平行样如果差异大于20%,需要重新分析 校准曲线的相关系数(R')应大于0.99 校准曲线计算出的每个标准的浓度,应在配制浓度的 70%~120%之内 如果配制浓度趋势远离校准回归线的趋势(例如在低浓度),可能需要将校准曲线分 为低浓度和高浓度范围,或者采用非直线模型以充分拟合吸收数据 如果曲线分为两段,每段曲线的 R2>0.99 检测限(LOD)为最低分析标准品的浓度,定量限(L0Q)为最低分析标准品的浓度乘以最低稀释 倍数 每天进行卵黄蛋白原的测定,采用加标进行批间标准品分析,参见附录F 数据和报告 9.1采用方差分析(ANowA)对生物标志物响应进行评价 采用方差分析(ANOVA)对受试组和对照组之间的响应进行比较来确定化学品是否具有内分泌活 性 如使用了溶剂对照,对于每个终点,稀释水和溶剂对照之间进行统计分析 所有的生物学响应数据 应按性别分别处理和报告 如所选参数方法不能满足非正态分布(如Shapiro-wilk检验)或方差不齐 Bartlet检验或Levene检验),应该考虑在方差分析之前将数据转换进行均一性方差分析或加权方差 分析 多个两两比较的Dunnett检验(参数)或具有Bonferroni校正的Mann-whitney(非参数)可以用 于非单调的剂量反应 如果剂量反应近似单调,也可以用其他统计检验如Jonckheere-Terpstra检验 或williams 检验) 附录G中图G.1提供了统计流程图以确定选择最合适的统计检验 9.2试验结果报告 9.2.1测试机构: 负责人员及其研究责任; -每个实验室应具备熟练使用各种代表性化学品的能力 受试物 9.2.2 受试物的特性; 物理属性、相关的物理-化学特性; 贮备液的制备方法及试液更新的频率; 稳定性和生物降解性 9.2.3溶剂 -溶剂特性(性质、所用浓度); 选择溶剂的理由如选用水以外的溶剂 9.2.4受试动物:
GB/T35515一2017 物种和品系; -供应商及特定的供应商设施; 在试验开始时鱼龄和生殖/产卵状态; -详细的动物驯化过程; 试验开始时鱼的重量 9.2.5试验条件 试验程序,如方法,时间负荷等; 贮备液的配制方法和试液更新的频率; 试验设置浓度、实测浓度、平均值及标准差,以及分析测定方法; 稀释水特性:包括pH值、硬度,碱度、温度、溶解氧浓度,残留氧水平、总有机碳、悬浮物以及其 他测定的特性; -试验容器中的水质,pH值、硬度、温度、溶解氧浓度; 驯养的详细资料;如料类型,来源、驯养数量和频率以及可能的相关的污染分析《如PCBs PAH、和有机氧农药. 9.2.6结果: 对照符合试验质量控制和质量保证要求 试验浓度组和对照组中的死亡率; 采用的统计分析方法及理由 生物观测终点数据,包括第二性征和卵黄蛋白原 数据分析结果; 鱼的任何异常反应; 对偏离测试准则之处加以说明,试验结果阐释和可接受性的标准见附录H
GB/35515一2017 录 附 A 资料性附录 进行卵黄蛋白原分析的样品收集推荐程序 避免交叉污染 A.1 注意避免雄鱼和雌鱼VTG样品的交叉污染 A.2步骤1A:黑头呆鱼尾静脉/动脉取血 在麻醉后,采用外科手术刀片将尾柄切开,用肝素钠润洗的毛细管从尾静脉进行血液收集 血液收 集后,在15000g离心3min(或者在4C时15000g离心10min)快速分离血浆 如果需要,可在离心 后测定血细胞比容百分比 将血浆从毛细管中分离至离心管中,加人0.13单位的抗蛋白酶肽,储存于 -80C中待测 根据黑头呆鱼的尺寸(与性别有关),可收集的血液体积一般在50L/尾鱼一60L 尾鱼 A.3步骤1B黑头呆鱼心脏收集血液 用肝素钠润洗的注射器进行心脏穿刺采血(1000单位肝素钠/mL) 血液转移至离心管(用冰冷 血浆转移至干净的离心管(如果血浆体积允许,进行等分),快迷 冻),然后离心(5mm.70og ,室温 冷冻至一80中待测 A.4步骤2A:日本青肝脏的切除 A.4.1将受试鱼从试验容器中移出 采用小的捞网将受试鱼从试验容器中移出,小心不要将受试鱼掉人其他试验容器中 aa b)受试鱼移出时采用以下顺序;对照、溶剂对照(如使用),最低浓度、中间浓度、最高浓度和阳性 对照 另外,在雌鱼移出前,所有的雄鱼都应已移出此试验容器; 每尾受试鱼的性别根据外部第二性征来确定(如臀鳍的形状); 将受试鱼放在一个容器内以便转移,运送到工作台以备切除肝脏用;检查试验容器和转移容器 的标签正确,确认试验容器中移出的鱼的数目正确保证留在试验容器中的鱼的数目与预期 相符 如果鱼的性别无法由外观确认.将所有受试鱼从试验容器中移出 在这种情况下,鱼的性别应 由在显微镜下观察性腺或第二性征来确定 A.4.2肝脏的切除(图A.l图A.8): 用小捞网将受试鱼从容器中转移到麻醉溶液中 a b 在受试鱼麻醉后,用慑子将受试鱼转移到滤纸(或纸巾)上 当夹取鱼时,锻子接触头侧部 防 止弄断尾巴; 在滤纸(或纸巾)上擦拭干受试鱼表面水 c d 将鱼腹部朝上放置 然后用解剖剪在腹部颈部区域和中间-腹部区域切出小的横向切口; 将解剖剪伸人小切口,沿着腹部中线,从接近钯覆盖物尾部的一点到肛门的头盖边,切开腹部;
GB/T35515一2017 小心不要将解剖剪伸人太深,防止毁坏肝脏和性腺; f 在体视显微镜下进行操作; 将受试鱼腹部朝上放置在纸巾上(另准备玻璃盘或载玻片); 8 h)用精密锻子将腹腔扩展,取出腹内器官;必要时可通过移去腹腔的一边来去除内部器官; 用另一对精密剪刀将肝和胆囊的连接部分暴露出来 然后抓住胆管,切除胆囊 小心不要碰 碎胆囊; 抓住食道,采用同样方式从肝上切除胃肠道;小心不要使得胃肠道渗漏;从肛门切除尾部胃肠 道,移除腹腔上的胃肠道; k 从肝脏外围修剪脂肪和其他组织 小心不要刮伤肝脏 采用精密锻子抓住肝脏人口部分,从腹腔内移去肝脏; 将肝脏放置在载玻片上 如果需要的话,采用精密慑子,从肝脏表面移去另外的脂肪和外部 m 组织: 称量肝重 在工作单上记录数值(精确至0.mg) 在微量管的标签上确认相关信息 n 把装有肝脏的微量管盖上盖 于冷却的架子上(或冰架上)储存; O 在切除了肝脏后,清洗解剖仪器或换用新的仪器 p 摘取转移容器内所有鱼的肝脏 在转移容器中所有鱼的肝脏摘取后(如所有的雄鱼或雌鱼在一个试验容器中),将所有的肝脏 样品放人试管中,贴上标签以便确认,并储藏于冷藏室中 当肝脏样品在切除后马上用于预处 理试验时,样品转移至另一个处于冷却架子上(或冰架上)的工作台 A.4.3在肝脏切除后,鱼的尸体可用于第二性征的测量 A.44标本;如果在切除受试鱼的肝脏后并不马上用于预试验,将取自受试鱼的肝脏标本储藏于 一70C 图A.1用剪刀沿着胸鳍前剪开
GB/35515一2017 图A.2用剪刀沿着腹部中线伸入腹部离肛门头部大约2mm处 肝肌 图A.3采用手术钳撑开腹壁,暴露肝脏以及其他内部器官(或者将腹壁横向固定
GB/T35515一2017 图A.4采用手术钳缓慢分离和切除肝脏 图A.5采用手术钳缓慢摘取肠道 10
GB/35515一2017 图A.6肠道以及任何肠系膜的附属物的终端采用剪刀切割 图A.7雌鱼)对于雌鱼过程相同 11
GB/T35515一2017 图A.8完成整个过程 A.5步骤2B:日本青(Oyziaslatipes),肝的卵黄蛋白原测定的预试验 A.5.1试验前准备 从ELAsA试剂盒中拿出匀浆缓冲液用瓶,用碎冰冷却(溶液温度<4C) 如果采用从EnBio ELISA系统中的匀浆缓冲液,在室温下溶解溶液.然后用碎冰冷却瓶 A.5.2计算匀浆缓冲液 基于体重计算来自肝脏的匀浆缓冲液的体积(在每毫克质量的肝脏中加人504L匀浆缓冲液) 例 如,如果肝脏质量是4.5mg,肝脏的匀浆缓冲液的体积是225AL 对于所有肝脏样品制备一系列匀浆 缓冲液 A.5.3制备肝脏样品 为预试验制备肝脏样品 在预试验前,从冷冻器中取出装有肝脏样品的1.5m微量管 a 雄鱼肝脏的预试验应在雌鱼之前进行,以防止卵黄蛋白原的污染 另外,试验组的预试验应按 b 如下顺序进行;对照,溶剂对照(有必要时),最低浓度,中间浓度,最高浓度和阳性对照; 在给定时间,从冷冻器中取出的装有肝脏样品的1.5mL微量管数目不超过同时能够进行离心 的数目 d 按照冰架上样品标本的编号,对含有肝脏样品的1.5ml的微量管进行排序(不必要溶解 肝脏) 12
GB/35515一2017 A.5.4预试验的操作 A.5.4.1加入匀浆缓冲液 加人匀浆缓冲液步骤如下 检查用于特定肝脏样品匀浆缓冲液体积的列表,调整微量吸管(体积范围为:100Al1000L a 至适当体积 在微量吸管上装上干净的洗头吸头; 从试剂瓶中取出匀浆缓冲液,在装有肝脏样品的1.5mL微量管中加人缓冲液; b 在所有装有肝脏的1.5mL微量管中加人匀浆缓冲液 在新的样品中不需要更换移液器吸头 然而,如果吸头被污染,或者怀疑被污染,应该更换吸头 A.5.4.2肝脏样品的匀浆 肝脏样品的匀浆步骤如下 在微量管匀浆器中接上一个新的匀浆杆; a b)将匀浆杆插人1.5mL微量管中 扶住微量匀浆器,使得肝脏样品挤压在匀浆杆的表面以及 1.5ml微量管的内壁之间; 启动微量管匀浆器10 在操作中采用碎冰冷却1.5mL微量管 一20s 将匀浆杆从1.5mL微量管中提起,停顿约10、 然后对悬浮液状态进行目测检查" d 如果在悬浮液中可观察到肝脏样品的尾状,重复操作c)和d),直至制备令人满意的肝脏匀 浆液; f 在冰架上冷却悬浮的肝脏匀浆液,直至离心 对于每个匀浆,更换一个新的匀浆杆; g h)根据上面描述的程序采用匀浆缓冲液对所有肝脏进行匀浆 A.5.4.3离心 对悬浮的肝脏匀浆液进行离心,步骤如下: 确认冷冻离心机面板的温度设定<5C; aa 5 将装有悬浮的肝脏匀浆液的1.5ml微量管插人离心机的转子中(如果有必要,进行平衡校正) 对悬浮的肝脏匀浆液在<5C,13000g离心10min 然而,如果悬浮物足够完全分离,可对 离心力和时间进行必要的校正 在离心后,检查悬浮液已完全分离(表层;油脂,中间层;悬浮物,底层;肝脏样品;如果分离不 完全,在同样条件下再次离心悬浮液 将所有样品从离心机中取出.按顺序排放在冰架子上;小心不要使得已分离的各层再次混合在 -起 A.5.4.4收集悬浮物 悬浮物的收集步骤如下 在试管架上放置四个0.5mL的微量管,准备储存悬浮液; a b 每个悬浮液收集30AL(分离后的中间层),放人一个0.5ml的微量管中 注意不要收集表层 的油脂或者底层的肝脏样品 采用上述相同的方法,收集悬浮液,分散至另外两个0.5ml的微量管中 d 收集剩下的悬浮液(如果可能，>1004L) 然后分散至剩下的那个0.5ml微量管中 注意不 要收集表层的油脂或者底层的肝脏样品; 13
GB/T35515一2017 盖上0.5mL微量管的盖子,在标签上写上悬浮液体积 然后在冰架上快速冷却微量管; e f 对于每个悬浮液,更换一个新的移液器吸头 如果大量液体吸附于枪头,快速更换一个新的 避免油脂污染肝脏提取液; 根据上述程序,分散所有离心后的悬浮液至四个0.5mL微量管中; 8 h)在分散了悬浮液至0.5mL微量管中后,将所有管放人试管架上,贴上标签,然后在冷冻器中快 速冷冻;如果在预试验后马上进行VTG浓度测量,则可在试管架上保持一个0.5mL的微量 管(装有30AL悬浮液)冷却,在进行ELAsA试验时转移至工作台上;在这种情况下,试管架 上剩下的微量管在冷冻器中冷冻 在收集完悬浮液后,完全扔弃残留物 A.5.5样品的储存 样品储存于一70笔,直至准备用于ELISA试验 A.6步骤3A:斑马鱼,尾部静脉/动脉采血 在麻醉之后将尾部横向切断,用肝素纳润洗的毛细管从尾部静脉/动脉进行血液收集 龈据鱼的大 小,取血体积范围为5aL~15aL 在微量毛细管中加人同样体积的抗蛋白酶肽缓冲液(在PBS缓冲液 中,6L/mL),通过离心(600g,离心5min),将血浆从血液中分离出来 将血浆收集到试验试管中,储 存在一20C中待测 A.7步骤3B斑马鱼,心脏穿刺法收集血液 为避免血液的凝固和蛋白质的降解,收集的样品中放人含肝素纳(1000units/mL.)和蛋白酶抑制 剂抑肽酶(2TIU/mL)的磷酸盐缓冲液(PBS) 血液取样推荐使用有固定细针头的注射器(1mL) 注 射器应预先充满缓冲液(约100AL.) 血液样本通过心脏穿刺法采集 首先，鱼采用MS-222 100mg/L)麻醉 在穿刺心脏时,用很小的压力推压注射器的活塞 收集的血液体积范围在20L 40l范围内 在心脏刺穿后，血液/缓冲液混合液装人试管中 血液中的血浆通过离心(20min. 5000g)分离,储存于-80C待测 A.8步骤3cC;斑马鱼,头和尾的匀浆 头和尾的匀浆步骤如下 鱼进行麻醉实施安乐死; a b) 如图A.9所示,对鱼头和鱼尾进行切分 注意在处理每尾鱼时,所有的解剖工具和解剖板都应 清洗干净(例如用96%的乙醇),防止污染; 对每尾鱼头部和尾部合并称重,体重测量精确到mg; d 称重后,放置于试管中例如,1.5ml的离心管),进行匀浆; 匀浆后,添加组织质量4倍的冰冻匀浆缓冲液 匀浆缓冲液组成为:12mLTris-HCl 50mmol/LTris-HClpH7.4)和120AlL蛋白酶抑制(1%蛋白酶抑制剂)的混合物 匀浆缓 冲液当天配制当天使用 在冰上进行操作 继续匀浆直至混合物匀质化 每尾鱼换用新的 匀浆杆 fD 试样在4,50000g条件下离心30min; g将移液器的尖端伸人表面的脂肪层下,吸取无脂肪或颗粒部分的上清液,吸取20AL悬浮液分 14
GB/35515一2017 散到至少两个试管中; h 试管储存于-80C待测 用fvTG渊试 用fvTG测试 用于性腺组织学 在后端切N 在背蜻后端切割 图A.9斑马鱼鱼头鱼尾的切分 15
GB/T35515一2017 录 附 B 资料性附录) 检测特定内分泌活性物质对黑头呆鱼和青鳞的第二性征的评估 B.1黑头呆鱼第二性征的评估 B.1.1概述 B.1.1.1成年黑头呆鱼在内分泌干扰物检测中潜在的重要的物理外观特征包括身体颜色(如亮/暗). 颜色图案(如存在或缺乏垂直尾纹),体型如头部和胸部形状,腹部的鼓胀),和特殊的第二性征(如珠星 的数目和尺寸,背垫和产卵器官的尺寸) B.1.1.2珠星位于繁殖活性的雄性黑头呆鱼的头部(背垫),通常分布为双边对称样式 对照雌鱼和幼 年的雄鱼和雌鱼表现出没有珠星的发育 在雄鱼眼睛和鼻孔周围最多有8个单独的珠星 数目最多和 尺寸最大的珠星位于鼻孔下面及嘴巴上面紧接的两个平行线上 许多鱼类在下颁有珠星群,那些最接 近嘴巴的珠星通常单独成对出现,而大多数腹部由最多4个珠星组成 珠星的实际数目通常很少大于 30(范围在18~28之间 显著的珠星(在数量上)体现为一个单独的、相对圆的结构,高度约等于半径 大多数繁殖活跃的雄鱼也有或至少有一些扩大和突出的珠星,使他们作为单独的结构难以区分 B1.1.3某些类型的内分泌干扰化学品可能会导致异性的某些第二性征发生异常,例如,雄激素受体 激活剂,173-甲基睾丸索或178-去甲雄三熔醇酮,可能会导致雌性黑头呆鱼产生珠星,而雌激素受体激 活剂可能会减少雄性珠星的数量或尺寸 B.1.1.4黑头呆鱼珠星的特征描述,是根据美国环境保护署设在明尼苏达的德卢斯实验室所使用的程 序制定的 具体产品和/或设备可用同类可获得的材料代替 最佳的浏览方式是使用照明放大玻璃或 3倍的照明解剖镜 查看鱼背侧和头部朝前(鱼头朝向观看者) 将鱼放在小Petri培养皿中(例如,直径为1001 mm),头部朝前,腹部朝下 聚焦以识别珠星 a 轻柔缓慢的将鱼从一边翻到另一边来确定珠星区域 对珠星数计数和评分; b)在Petri培养皿中将鱼背部朝前,重复观察腹侧头表面; 每个鱼的观察在2nmin内完成 c B.1.2珠星的计数和分级 B.1.2.1已经确定了六个具体领域,来评价成年黑头呆鱼珠星的存在和发育 模板的形式是为了绘制 缺乏、 现有珠星的位置和数量,见图B.1 记录珠星的数目和尺寸,对每个生物体定量分级为;0 扩大和3明显,见表B.1 存在、2 B.1.2.2等级0表示缺乏任何珠星 等级1表示存在,是确定为有一个单独的点的任何珠星,其高度几 乎相当于它的半径(直径) 等级2表示扩大,是从外观上看起来像星号、从组织上确定的珠星,通常有 一个大的径向槽沟或从中心收缩 珠星高度往往有缺口,但有时可以呈圆形 等级3表示明显,通常是 相当大和圆,结构上较少定义 有时这些珠星连接起来,形成一个单独的个体或组合群区域(以下所述 的B,C和D) 颜色和设计类似于等级2,但有时难以区分 利用这种分级体系,拥有珠星数在1820 之间的普通雄鱼参比的珠星评分为<50 16
GB/35515一2017 图B.1黑头呆鱼珠星的数目和尺寸 B.1.2.3在特殊的等级领域,某些鱼珠星的实际数目可能大于模板评级框,见表B.1 如果发生这种情 况,其他等级数字可被标记在框内的右边或左边 因此,该模板没有显示对称性 可在一个单独的框中 对两个珠星进行双标记分级评分,采用绘制沿着嘴的平面的水平面的垂直配对的或连接的珠星的其他 技术 B.1.3绘制区域 A B.1.3.1 -珠星位于眼周围 沿着眼部前边沿绘制背部到腹部区域 通常在成熟雄鱼对照中有多 个,雕鱼对照中没有，一般成对(每只眼睛附近一个)或在暴露于雄激素的雕鱼中单个 B.1.3.2 B 抄 -珠星位于鼻孔之间感应管道孔),通常在发育的水平升高的雄鱼对照中成对(2- 大或3 明显) 有时在对照雌鱼中不存在,雌鱼暴露于雄激素会发展 B.1.3.3 -珠星位于紧靠鼻孔前部,与嘴平行，一般在成熟的对照雄鱼中增大或明显,在较少发育 的雄鱼或雄激素处理的雌鱼中存在或增大 珠星位于嘴线的平行处 一股在对照堆鱼中分级发育,在雕鱼对照中缺乏,但在雄激素 B.1.3.4 暴露的雌鱼中存在 珠星位于下颗,靠近嘴,通常很小以及一般成对,在对照或处理的雄鱼,以及处理的雌鱼 B.1.3.5 E 有所不同 -珠星位于E的腹侧 通常很小并成对,在雄鱼对照和雄激素暴露的雌鱼中存在 F B.1.3.6 17
GB/T35515一2017 表B.1黑头呆鱼珠星模板 珠星模板 评分数 存在 编号 日期 扩大 总评分 明显 X1 X XI1 XI B Xl N x1 XI1 X N X X X X X xXI X1 x x X X Xl XT XI XI XI XI E XT X1 N XI X1 XI1 珠星模板 评分数 编号 存在 扩大 日期 总评分 明显 XI X N X XN X1 X1 XI1 X X1 X1 X1 X X！ XI X1 XI1 X1 X1 XT X1 XI X1 XI XI XI1 X1 XI E X X X1 X1 B.2青峭的第二性征的评估 B.2.1对青鳍的第二性征 -乳突物的测定的描述 乳突物通常只出现在成年雄鱼身上,并且发现于 18
GB/35515一2017 从臀鳍后尾部开始算起的、从第二个到第七个或第八个鳍尾部位,见图B.2和图B.3 但是,突起很少出 现于臀鳍后尾部的第一个鳍尾上 以下是第一个鳍尾突起的测量方法(鳍尾数目是指从臀鳍后尾部开 始的顺序 在肝切除后,参见附录A,鱼体放在含有大约10ml的10%中性福尔马林缓冲液的圆锥型试 管中(上面:头,下面:尾巴) 如果性腺固定在10%的中性福尔马林缓冲液以外的溶液中,在 臀鳍前部和肛门之间用剃刀沿着鱼体横向切断,注意不要损害生殖孔和性腺本身,见图B.4 将鱼身的头盖部放人固定剂溶液中来保存性腺,将鱼身的尾部如上所述放人10%的中性福尔 马林缓冲液中; b 在将鱼身放人10%的中性福尔马林缓冲液后,用毁子夹起臀鳍的前部并伸展约30s保持臀鳍 打开 当用锻子夹起臀鳍时,小心地夹住臀鳍的前部区域不要抓伤乳突物 在保持鳍打开30s后,将鱼身在室温下储存于10%的中性福尔马林缓冲液中,直到进行乳 突物测量(测量至少在固定24h后开始进行) B.2.2测量方法: 在将鱼身固定在10%中性福尔马林缓冲液中至少24h后,从圆锥型试管中取出鱼体,在过滤 纸上(或用纸巾)擦拭福尔马林， 将鱼腹部朝上放置 然后用小型解剖手术刀仔细的切开臀鳍(最好随着小数量的鳍尾切开 b 臀鳍); 用错子夹起已切断的臀鳍的前部区域,放置在滴有几滴水的玻璃片上 然后在臂睛上盖上玻 璃片 在用子夹取臀鳍时要小心不要划伤乳突物 用显微镜(正置显微镜或倒置显微镜)的计数器对乳突物的接合板的数量进行计数 当一个小 突起的形成在接合板的后缘是可见的时,乳突物可被识别出 记录每个鳍尾上乳突物的接合 板的数目(例如,第1个鳍尾:0,第2鳍尾;10,第3个鳍尾:12,等)和每尾鱼的突起的总数 如 有必要,拍下臀鳍的照片,并在图片中数出乳突物的接合板的数目; 在测量完成后,将臀鳍放人圆锥型试管中储存 a 雄性 性 图B.2臀鳍形状和尺寸的性别差异 19
GB/T35515一2017 接合板 轴空间 过稻 接合版 角质鳞条 图B.3臀鳍线的结合板上的突起过程 B.2.3图B.4是鱼身的照片,显示了当性腺固定在除了10%的中性福尔马林缓冲液以外的固定液中时 的切割点 在这种情况下,剩下的身体用切刀(红色线)在臀鳍前部区域和肛门之间切割开,且鱼身的头 部放在为性腺准备的固定溶液中,鱼身的尾部放在10%的中性福尔马林缓冲液中 切点 臀 肛门 图B.4带有切割点的鱼身照片 20
GB/35515一2017 附录 C 资料性附录) 鱼类内分泌筛选试验的实验条件 鱼类内分泌筛选试验的实验条件见表C.1 表C.1鱼类内分泌筛选试验的实验条件 黑头呆鱼Fatheadminnow 青Medaka 斑马鱼Zebrafish 推荐物种 Pimebhalesbromelas) Oryziaslaties Daniorerio 试验类型 流水式 流水式 流水式 水温 25C士2 25"C士2 26C土2C 光照量 荧光灯(宽谱》 荧光灯(宽谱 荧光灯(宽谱 AE 0;E:/(MF 10AE/(MF s) s) s一 204E/Ms),540lx一 20E/(M's),540lx~ 20E/(Ms),540lx 光照密度 000lx,或50ft-e100ft-e lx,或50fte~100fte 000lx,或50fe 1000lx 环境实验室水平 环境实验室水平) 100ft-c(环境实验室水平 光照周期(昼/夜交 12h16h 12h16h 替是可选的,但并 16h光照/8h黑暗 光照/12h8h黑暗 光照/12h8h黑暗 不一定完全必要 小于5g/1 小于5g/1 承载率 小于5从/儿 试验容器大小 10L(最小) 2L(最小 5L(最小 试验溶液体积 8L(最小 1.5L(最小 4L(最小 试验溶液体积更换 每天最少6次 每天最少5次 每天最少5次 试验用鱼的推荐鱼龄 见 6.3 见6.3 见6.3 1.5士20% 雕性 雕性0.35士20% 雌雕性0.65士20% 成鱼的大约醒重/s" 雄性;2.5士20% 雄性:0.35士20% 雄性:0.4士20% 6尾2尾雄鱼 10尾(5尾雄鱼 10尾5尾雄鱼 每个试验容器中鱼的数目 和4尾雌鱼) 和5尾雕鱼 和5尾雌鱼) 处理数目 3(加适当对照 3加适当对照 3(加适当对照 每个处理的容器数量 最少4个 最少2个 最少2个 6尾成年雕鱼和8尾雄鱼 尾成年雌鱼和10尾雄鱼 尾成年雌鱼和10尾雄鱼 10 10 每个试验浓度的鱼的数目 每个重复容器中 每个重复容器中 每个重复容器中 尾雌鱼和2尾维鱼 5尾雌鱼和5尾雄鱼) 5尾雌鱼和5尾雄鱼 每天喂海虾无节幼体两或三 每天喂活的或冷冻的或无 每天喂海虾无节幼体 驯养环境 节幼体海虾两或三次随意). 次(随意),商业购买的饵 两或三次(随意),商业 商业购买的饵料或以上混合 料或以上混合 购买的饵料或以上混合 在溶解氧DO浓度低于60%在溶解氧D0浓度低于60%在溶解氧O浓度低于60% 曝气 空气饱和度时才需要曝气 空气饱和度时才需要曝气 气饱和度时才需要曝气 空 洁净表面水,井水或再生 活净表面水,井水或再 洁净表面水,开水或再生 稀释水 水或脱叙自来水 水或脱叙自来水 生水或脱氯自来水 21
GB/T35515一2017 表c.1(续 黑头呆鱼Fatheadminnow 青Medaka 斑马鱼Zebrafish 推荐物种 (Pimnephalespromelas) (Orysiaslaties) Daniorerio 预暴露期 建议7d 建议7d 建议7d 化学品暴露期 21d 21d 21d 生存 生存 生存 行为 行为 生物终点 行为 第二性征 第二性征 V'TG -VTG VTG; 溶解氧大于60%的空气饱和溶解氧大于60%的空气饱和溶解氧大于60%的空气饱和 度;水温平均温度25笔士 度;水温平均温度24C士 度;水温平均温度26C士 2;对照组鱼群死亡率 2C;对照组鱼群死亡率 2;对照组鱼群死亡率 质量控制和质量保证 90%;每个测量水平的受试90%;每个测量水平的受试90%;每个测量水平的受试 平均浓度在测量的平均 平均浓度在测量的平均浓 平均浓度在测量的平 浓度的20%以内 度的20%以内 均浓度的20%以内 22
GB/35515一2017 录 附 D 资料性附录 斑马鱼和黑头呆鱼的产卵基板 D.1斑马鱼产卵基板 D.1.1产卵托盘;全玻璃仪器盘,例如220mm×150mm×55mm(长×宽×高),表面覆盖有可移动的 不锈钢金属网格(网宽2mtm) 网格应在边缘下某一水平处覆盖仪器盘开口 图D.1斑马鱼产卵基板 D.1.2产卵基板固定在托盘上,可放绿色塑料作为人工水生植物装饰(注意;应考虑受试物在塑料材料 上可能的吸附). D.1.3托盘和网格之间的距离至少应为30mm,以确保产卵不会超出托盘进行 托盘上产的卵落人网 格中,可在光照开始后45min60min的时间内收集 透明的卵不粘连易分辨,在光源下计数 每个 容器中有5尾雌鱼,每天产卵的数量为20个时视为低产量,到100时视为中等,100个以上的视为高产 量 移除产卵托盘,收集卵,产卵托盘可傍晚尽量晚时或清早尽量早时再次放人试验容器中 再次放人 的时间间隔不应超过1h,否则产卵底质可能作为一种暗示引发单体在非常时期的交配和产卵 如果 需要晚些时间放人产卵托盘,应在光照开始后至少9h进行 D.2黑头呆鱼产卵基板 D.2.1混合塑料、陶瓷、玻璃或不锈钢的产卵盘和托盘放置于每个试验容器中例如,80mm长的灰色 半圆形排水材料,坐落于130mm长的唇型盘),见图D.2 D.2.2产卵盘进行打磨以提高粘附性 托盘也应进行筛选,防止鱼进人落下的卵中 23
GB/T35515一2017 图D.2黑头呆鱼产卵基板 D.2.3该基板的设计是为了装载那些不粘附于陶瓷表面因而下降到容器底部的卵(或那些直接产在塑 料基地平板上的卵) 所有产卵基板在使用前应在稀释水中过滤至少12h 24
GB/35515一2017 录 附 E 资料性附录 可接受的稀释水的一些化学特性 可接受的稀释水的一些化学特性见表E.1 表E.1可接受的稀释水的一些化学特性 化学品 浓度 颗粒物质 20mg/I 总有机碳量 2mg/I 非离子氨

化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法GB/T35515-2017

随着化学品的广泛应用，其对水环境和水生生物的影响也越来越受到关注。其中，化学品对鱼类的内分泌系统影响成为研究热点之一。

为了评价化学品对鱼类内分泌系统的影响，国家标准GB/T35515-2017制定了化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法。

试验背景

鱼类内分泌系统是一个复杂的调节系统，包括多种内分泌腺和激素。而化学品中的一些物质具有类似于鱼类内源性激素的结构，会干扰鱼类正常的内分泌调控机制，从而影响其生殖发育、行为和免疫等方面。

试验原理

此试验方法是通过检测鱼类在化学品暴露下的生殖细胞和性腺发育状态来评估化学品对鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性的影响。其中，雌激素和雄激素对鱼类的生殖发育起到重要作用，而芳香酶则参与了激素合成过程中的关键环节。

试验对象

试验对象为七鳃鳗（Oryzias latipes），这是一种常见的小型鱼类，广泛分布于世界各地。

试验方法

试验过程中需要使用标准水体，并在试验开始前对水体进行化学分析，以确定其基本性质。将不同浓度化学品加入到水中，让试验对象在其中生活一段时间后，观察其性腺发育状态和生殖细胞数量等指标，统计相关数据。

结果解读

通过试验可以得出化学品对鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性的影响指标，包括性腺发育状况、生殖细胞数量、半数致抑制浓度等。这些指标可以评估化学品对鱼类内分泌系统的影响，从而推断其对水环境和水生生物的生态风险。

综上所述，GB/T35515-2017制定的化学品鱼类雌激素、雄激素和芳香酶抑制活性试验方法是一种科学、可靠的评估化学品对水生生物内分泌系统影响的方法，具有重要的实际应用价值。

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