国家标准 GB/T3341g一2016 环氧乙炕灭菌生物指示物检验方法 TIesmethodofbiologiealindicatorforethyleneoxidesterilizationprcesses 2016-12-30发布 2017-07-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T33419一2016 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由卫生和计划生育委员会提出并归口本标准起草单位:江苏省疾病预防控制中心、疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所、国家卫生计生委卫生和计划生育监督中心、徐州市疾病预防控制中心标准起草人:徐燕、孙俊、吴晓松、陈越英、张流波、段亚波、史绍毅、王洪敏、黄靖雄、谈智、张剑、王玲,孙巍、张伟,褚宏亮、常桂秋
GB/T33419一2016 环氧乙院灭菌生物指示物检验方法范围本标准规定了环氧乙烧灭菌生物指示物的术语和定义、技术要求和检验方法本标准适用于对环氧乙烧灭菌生物指示物的检验规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日朋的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB18281.1医疗保健产品灭菌生物指示物第1部分:通则 GB18281.2医疗保健产品灭菌生物指示物第2部分;环氧乙烧灭菌用生物指示物 GB/T24628医疗保健产品灭菌生物与化学指示物测试设备卫生部消毒技术规范(2002年版术语和定义下列术语和定义适用于本文件生物指示物biologiealindicator;B1 对指定条件下的特定灭菌程序具有一定抗力,并装在内层包装中可供使用的染菌载体包含菌片和自含式生物指示物 3.2 载体 carier 试验微生物的支持物 3.3 指示微生物 testorganism 用于制备染菌载体的微生物 3.4 活菌计数viabletestorganismcount 在规定的培养条件下,测定细菌悬液,染菌载体等样本中含有的活菌数量通过计算长成的单个菌落数,而得到单位体积菌悬液中或染菌载体上的存活试验菌菌数 3.5 D值 Dvalue 在设定的条件下,杀灭微生物数量达90%所需的时间注，单位为分(min). 3.6 存活曲线 survivOr”curve 在设定的条件下,微生物的存活情况与对灭菌介质暴露变化的关系曲线
GB/T33419一2016 菌落形成单位 coony-formingunit;CFU 在活菌培养计数时,由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落,以其表达活菌的数量 3.8 survival-killwindow 存活-杀灭区间在规定的条件下灭菌处理时,生物指示物从全部长菌(存活暴露)过渡到全部不长菌(杀灭暴露)的暴露程序 3.9 alindicator 自含式生物指示物self-containedbiol logica 内层包装中含有细菌复苏生长所需培养基的生物指示物 3.10 raltime;SsT 存活时间 surv 用于生物指示物抗力鉴定时,受试指示物样本经杀菌因子作用后全部样本有菌生长的最长作用时间 3.11 杀灭时间killingtime;KT 用于生物指示物抗力鉴定时,受试指示物样本经杀菌因子作用后全部样本无菌生长的最短作用时间技术要求 4.1 指示微生物 4.1.1菌种 ATCC9372 环氧乙烧灭菌指示微生物应采用枯草杆菌黑色变种Bacilla、atrophaeus NCTc10073,NCIMB8058，DSM2277,NRRL.B-4418,CIP77.18)芽胞 4.1.2菌量回收菌量大于等于1.0×10CFU/片,回收菌量同时应在制造商标明菌量的一50%+300%范围内 4.1.3抗力当暴露于环氧乙烧浓度600mg/儿士30mg/L温度54C士1C,相对湿度60%士10%时,D值大于等于2.5min,测试的D值应在制造商规定的D值士20%范围内 4.2载体符合GB18281.1和GB18281.2的要求;同时,暴露于温度大于等于55,环氧乙炕浓度大于等于 800mg/L,相对湿度大于等于70%,暴露时间大于等于6h等条件下灭菌过程中不会变形,熔化、腐蚀和其他损坏 4.3培养基 4.3.1培养基和培养条件应能稳定地生产出符合4.1和GB18281.1和GB18281.2性能要求的试验菌
GB/T33419一2016 悬液培养基应不影响试验菌的稳定性,同时要与染菌载体和生物指示物制造工艺和材料相兼容 4.3.2恢复培养基 a)使10CFU100CFU的微生物恢复生长; b)使损伤的微生物生长; c)经过环氧乙婉灭菌处理后应确保可以抵消任何可能影响指示微生物活性的化合物,并在有效期内性能和颜色不发生改变生物指示物的设计,应有利于初始微生物数量在储存、运输和装卸过程中的基本稳定并防止外 4.3.3 界微生物对菌片的污染 4.4稳定性生物指示物存放至标签和说明书规定的条件及有效期限后所有技术参数应符合4.1、4.2、4.3 4.5生物指示物抗力测定仪要求生物指示物抗力测定仪应符合GB/T24628的要求,其余要求见附录A 检验方法 5.1 活菌计数 5.1.1通过菌落形成单位检测方法统计菌片或自含式生物指示物上的试验活菌这种方法常用于预期回收菌量在50CFU以上的情况 5.1.2本方法适用于初始活菌数(未处理的样品)的检测以及利用存活曲线(处理过的样品)检测D值 5.1.3测定回收菌量时,最小检测数量应每批量/批次至少使用4个测试样品,检测方法见附录B 5.1.4相关使用材料及配置方法见《消毒技术规范》2002年版 5.2抗力试验 5.2.1测试抗力时应使用生物指示物抗力测试仪,要求见附录A 5.2.2D值测定应至少使用以下两种方法 a)存活曲线法测定D值(见附录C); b)部分阴性分析法测定D值(见附录D); 验证法测试D值将a)或b)测试出的D值和5.1的菌量进行计算,计算出ST值和KT值,进行试验验证(见附录E). 5.3恢复培养基对少量菌恢复能力的测试每个样本的恢复培养基中,接种10CFU~100cFU的枯草杆菌黑色变种芽胞,同时设置阴性对照和阳性对照培养至规定时间后观察变色情况,如果恢复培养基有菌生长,并且阴性对照无菌生长和阳性对照有菌生长,判断恢复培养基合格 5.4材料对灭菌过程兼容性测试按GB18281.1进行 5.5稳定性试验取包装完好的同批次生物指示物放置于制造商建议的保存条件下,存放至标签和说明书规定的有效期限,取出再次进行评价,生物指示物应满足4.1、4.2、4.3.
GB/T33419一2016 附录A 规范性附录抗力测定仪要求及抗力试验 A.1抗力测定仪要求 A.1.1参数要求时间常数精确度士1s,分辨率1s;温度范围25C一80C,精确度士0.5,分辨率0.1C,响应时间小于等于500ms;真空度范围0kPa100kPa,精确度士1.0kPa,分辨率0.1kPa,响应时间小于等于 30ms;压力范围100kPa一200kPa,精确度士3.5kPa,分辨率0.1kPa,响应时间小于等于30ms;相对湿度范围20%一90%,精确度士5%,分辨率1%,响应时间15000ms;环氧乙烧浓度范围25mg/L 1200mg/L,精确度为士设定浓度的5% A.1.2记录范围抗力测定仪应能自动记录上述参数,不少于10s一个数据点相对湿度和环氧乙烧浓度可由传感器直接测量,或者由压力参数推算 A.1.3其他要求抗力测定仪应配备有抽真空装置,让反应室的真空度低于10kPa,以便在通人环氧乙婉之前充分排除室内空气,并与暴露阶段结束时把环氧乙烧全部排出,其中通人环氧乙婉气体达到规定的气体浓度,所需时间小于等于60s,排出环氧乙烧气体达到真空(10kPa),所需时间亦小于等于60s 周期结颗粒束时输人的空气应经滤器滤过,该滤器应能清除不少于99.9%的0.5Mm A.2抗力试验放置样品于合适的载样器材上 A.2.1 A.2.2预热抗力测定仪反应室至选定测定条件(30C或54C) A.2.3放置已有样品的载样器材于反应室内,关闭反应室并开始试验过程 A.2.4按以下顺序进行操作反应室抽真空,达10kPa士0.5kPa(或根据制造商提供的信息》5 a b)充人足量水蒸气,使反应室内相对湿度达到60%士10%,维持该条件30min士1min,样品应在充人水燕气之前加温到露点以上以避免潜在的水汽凝结; 往室内通人环氧乙烧,在60s内使浓度达到规定浓度600mg/L士30mg/L,在零气体暴露周期不需要通人环氧乙烧; 在规定的暴露时间士5s保持测试条件，在暴露阶段结束时反应室抽真空,在1.5min内达到10kPa,接着注人经滤过的空气或惰性气体(如氮气),达到外界气压; f重复e)步骤4次在上述周期结束时,将指示物从抗力仪中迅速移出,并按要求进行处理
GB/T33419一2016 附录 B 规范性附录活菌培养计数方法 B.1在无菌试管内加人5mL含有0.5%吐温-80的0.03mol/L磷酸盐缓冲液,加人适量无菌玻璃珠将待计数染菌载体投人试管,用电动混匀器振荡直至染菌载体被完全打碎,制成菌悬液 B.2将无菌试管按需要数量分组排列于试管架上,每管加人4.5mL含有0.5%吐温-80的0.03mol/L 磷酸盐缓冲液各组由左向右,逐管标上10-,10-,10 B.3将菌悬液样本用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,随即吸取0.5mL 加至10-" 管内 B.4将10-'管依前法用电动混匀器混合20s,或在手掌上用力振打80次,混匀,再吸取出0.5ml 加人 10-"管内如此类推,直至最后一管必要时,还可作某稀释度的1:1或1:4稀释 B.5选择适宜稀释度试管(以预计生长菌落数每平板为15CFU300CFU者为宜),吸取其中混合均匀的悬液1.0m加于无菌平皿内每一稀释度接种2个平皿,一般需接种2个~3个不同稀释度 B.6将40C45C熔化的培养基,倾注于已加人样液的平皿中,每平皿15mL20mL B.7将平皿盖好,即刻轻轻摇动混匀,平放待琼脂凝固后,翻转平皿使底向上,置36C士1C恒温培养箱内培养 B.8培养至72h计数菌落数一般以肉眼观察,必要时用放大镜检查以每平板菌落数在15CFU~ 300CFU的稀释度为准记录结果 B.9根据稀释倍数和接种量计算每一染菌载体上的平均菌落数
GB/T33419一2016 附录c 规范性附录存活曲线方法测定D值 C.1总则本方法是建立在通过直接计数菌落形成单位(CFU)检测存活试验菌的数量上,利用活菌计数法检测存活被测微生物的数量这种方法可行的最低限约为5×10CFU,见附录B C.2步骤 C.2.1测试样本应暴露于规定的暴露条件 C.2.2应至少有5次暴露,而且应包括以下几方面 a)有1次暴露中样本未经环氧乙婉处理(0暴露时间注:环氧乙烧可不存在或由惰性气体或介质替代 b) 至少有1次暴露使活菌数降低到最初接种量的0.01%减少4lg) e)至少有3次暴露介于a)和b)情况之间 c.2.3每次测定中每次暴露所用的试验样本应不少于4个,每次暴露应采用相同的数量试验样本 c.2.4每次暴露2h内,应对测试样本进行处理,让试验菌从载体上脱落见附录B C.2.5用所得的全部存活菌数的常用对数值,对时间(min)作图,用最小二乘法进行回归分析,确定最佳线性曲线回归分析时不应包括原先菌落数0.5lg范围内的存活数据点计算所得直线斜率的负倒数值即等于以分钟表示的指定暴露条件下的D值.同时所得线性曲线相关系数应不小于0.8
GB/T33419一2016 附录D 规范性附录部分阴性分析法测定D值 D.1总则本方法是通过直接观察指示微生物在液体培养基中的生长情况,来间接确定试验菌的存活情况 D.2检测方法 D.2.1 Holcomb-- n-karber法(IHIsKP) -spearman D.2.1.1试验次数与样本数量要求至少应进行5组试验,至少包括1组所有样本出现生长情况的试验、2组部分样本出现生长情况的试验,2组经过连续暴露后没有观察到出现生长情况的试验每组试验最少使用20个样本 D.2.1.2样本培养要求样本经过暴露后应按照制造商指定的方法培养根据试验菌的特点,液体培养基的浑浊度、培养基表面的生长情况或试管底部沉淀物将表明试验菌的生长情况如果生长培养基属于生物指示物的一部分,如自含式生物指示物,则应按照制造商提供的使用说明判断试验菌是否出现生长情况(通过观察 pH值颜色变化,从而显示自含式生物指示物中试验菌的生长情况 D.2.1.3利用IHSKP计算 D.2.1.3.1此计算方法是建立在应至少有5组暴露试验,而且应包含以下条件 -其中1组样本应是全部测试菌生长; 其中2组样本应有部分样品生长; 其中2组样本应是全部不生长菌(见表D.1) 表D.1IISKP计算时所需要的样本数据灭菌剂暴露时间(e) 暴露样本数量(n 无菌生长的样本数量(r) (U 12 1 1M4 sU-) 1 l.(UR r6(r=n6
GB/T33419一2016 表D.1(续灭菌剂暴露时间(o) 暴露样本数量(n) 无菌生长的样本数量(r) r7(r=n7 注.定又为所有测试样本均出现生长悄况的暴露组中,暴露在灭离剂下的最长暴露时间一,是部分阴性区域的增加时间;/和/是所有样本均没出现生长情况的连续暴露时间(UK为最终暴露,UK-为在UK之前的一次暴露》如果未出现阴性单元,即,未出现阴性试样(r=0),且所有单元在暴露时间前出现生长情况;同时,在暴露时间4，之后的过程中全部为阴性试样(=n)),即未出现生长情况,则测试有效 D.2.1.3.2对于暴露在灭菌剂下的暴露时间t,因子X，和?分别按式(D.1、式(D.2)计算十lD X，= (D.1 式中; 用于计算U，的因子; 第i次暴露时间十1 ' (D.2) Y，=！ n十1 式中 -用于计算U，的另一因子; 在暴露时间时出现未生长试样的数量在暴露时间，下暴露的数量在，时间下,所有样本表现出生长,所以》- 从以上X，和，的计算值中,在第i次暴露时间的U，值可以按式(D.3)计算 =X.了 (D.3 U 式中 U -第i次暴露时间下时间与未存活样本的关系值; 用于计算U，的另一因子; 用于计算U，的因子 X D.2.1.3.3任何试样的平均无菌时间Uk,可以通过对每一次暴露时间,i=1k的U值的求和来计算[见式(D.4] D.4 Usk Us 平均无菌时间; 每次暴露时间下时间与未存活样本的关系值 U D.2.13.4D值用式(D,5)计算: Uns (D.5) D gN 十0.2507 式中: D -D值 UHsk -平均无菌时间; 每批生物指示物的回收菌量的平均数,用活菌培养计数方法计算(见附录B). N
GB/T33419一2016 注lg(Eauler常量)=lg(0.5772)=-0.2507 D.2.1.3.5当暴露时间间隔d是一个常量,在每一个暴露时间下,测试样品数量n也是一样的,平均无菌时间的U可以用式(D.6)计算 d 了 UsK=UK一 D.6) D.2.2LimitedHolcomb- nan-karber法(LHSKP spearm D.2.2.1LHSKP计算方法的建立条件与HSKP相同,见D.2.1.3.1 计算公式见式(D.6). D.2.2.2Um 1tsK" D.2.2.3D值计算公式见式(D.5). D.2.2.4LHSKP法需要暴露时间间隔为恒定,并且每次试验样本的数量应相同
GB/T33419一2016 附录 E 规范性附录验证法测定D值 E.1应分别使用不少于50个相同的样本,通过存活时间和杀灭时间证实D值 E.2样本暴露后应按照制造商给出的方法进行培养 E.3存活时间(ST)和杀灭时间(KT)用式(E.1)、式(E.2)计算: ST>(IgN 一2)×D值 E.1 K丁

环氧乙烷灭菌生物指示物检验方法GB/T33419-2016

环氧乙烷（EO）是一种常用的医疗器械和药品灭菌剂，具有广谱、高效、快速、无腐蚀性等优点，在医疗卫生领域得到广泛应用。然而，在使用环氧乙烷进行灭菌时，需要对其进行验证，以确保灭菌效果符合要求。

GB/T33419-2016《医疗器械环氧乙烷灭菌生物指示物》是中国国家标准，规定了环氧乙烷灭菌生物指示物的检验方法。其中，生物指示物是指一种含有特定微生物的灭菌指示物，用于验证灭菌过程是否有效。生物指示物的制备和检验方法关系到灭菌效果的准确评价。

生物指示物制备方法

生物指示物的制备方法应该符合以下要求：

使用标准菌株，如芽孢杆菌等；
在无菌条件下进行制备；
将含有标准菌株的载体和环氧乙烷灭菌器内被灭菌器内部温度所能承受的最高温度一起置于灭菌器内；
按规定程序处理，达到灭菌的目的；
取出灭菌后的生物指示物，进行培养检验，判断是否存活。

生物指示物检验方法

生物指示物的检验方法应该符合以下要求：

生物指示物接受灭菌剂的程度应该能够反映真实情况，不得低于已知的安全范围；
对生物指示物的检测应该遵循GB/T6903中有关微生物学检验方法的要求；
对于阳性结果，应该进一步确认，以避免假阳性的发生；
对于阴性结果，应该进行复检，并指出可能存在的原因。

综上所述，对于使用环氧乙烷进行灭菌的设备和药品，应该按照国家标准GB/T33419-2016中的要求制备和检验生物指示物，以确保环氧乙烷灭菌的有效性和安全性。