H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法

国家标准 GB/T19438.3一2004 H7亚型禽流感病毒荧光RI-PCR 检 测方法 Methodofreal-timeRT-PCRforthedeteetion oftheavianinflenzavirussubtypeH7 2004-02-14发布 2004-02-15实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标雅化管理委员会国家标准
GB/T19438.3一2004 前 言 GB/T19438一2004《禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》分为以下四个部分: GB/T19438.1一2004《禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.2一2004《H5亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.3一2004《H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》; GB/T19438.4一2004《H9亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测方法》 本部分的附录A为资料性附录 本部分由国家质量监督检验检疫总局提出 本部分起草单位;北京出人境检验检疫局,深圳市匹基生物工程股份有限公司 本部分主要起草人:高志强、张鹤晓、郭晋优、刘继红、吴丹
GB/T19438.3一2004 H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR 检 测方法 范围 本部分规定了荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的操作方法 本部分适用于活禽及其产品中H7亚型禽流感病毒的检测 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分 GB/T19438.1一2004 禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法 缩略语 下列缩略语适用于本部分 3.1 荧光RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链式反应 Ct值 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数 RNA 核糖核酸 3. Taq酶 TaqDNA聚合酶 3.5 PBS 磷酸盐缓冲盐水 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯 原理 采用TaqMan方法,通过比对禽流感病毒血凝素基因,设计一对仅在H7亚型禽流感病毒血凝素基 因间保守的特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针 探针的结合部位位于目的扩增片段内部 其 中5'端标记FAM荧光素为报告荧光基团(R),3'端标记的TAMRA荧光素(Q)在近距离内能吸收5'端 荧光基团发出的荧光信号,称为淬灭荧光基团 反应在退火时,引物和探针同时与目的基因片段结合，
GB/T19438.3一2004 探针上R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时， Taq酶发挥5'-3'的外切核酸酶功能,将探针降解 这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再 为Q所吸收而被检测仪所接收 随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应 关系 试剂和材料 5.1试剂 除特别说明外,本标准所用试剂均为分析纯,所用液体试剂均须使用无RNA酶的容器(用DEPC 水处理后高压灭菌)进行分装 5. .1.1H7亚型禽流感病毒荧光RT-PCR检测试剂盒';试剂盒的组成、说明及使用注意事项参见附 录A 5.1.2三氯甲炕 1.3异丙醇 5. 1.475%乙醇,用新开启的无水乙醇和无RNA酶的水配制 5. 0.01mol/L(pH7.2)的PBS;配方见GB/T19438.12004中附录A 121C士2C,15min 5. 高压灭菌后,无菌条件下按10000IU/mL加人青霉素和链霉素 仪器设备 高速台式冷冻离心机;要求最大离心力在12000r/nmin以上 5.2. 5.2.2荧光cR仪 计算机 5.2.42C8C冰箱 5.2.5 20C冰箱 L~20o 5.2.6微量加样器:0.5Al10AL;5AL20AL;20 L;200AL1000L 混匀器 5.2.8可移动紫外灯:要求近工作台面 样品的采集与前处理 采样过程中样本间不得交叉污染,采样及样品前处理过程中须戴一次性手套 6.1 取样工具 需要下列取样工具 棉拭子 剪刀、锻子; Eppendori管; 研钵 以上取样工具必须经121C士2C,15min高压灭菌并烘干 6.2采样方法 6.2.1活禽样品 取咽喉拭子和泄殖腔拭子,采集方法为 对于咽喉拭子,采取时要深人喉头及上颗裂来回刮3次5次取咽喉分泌液; 取泄殖腔拭子时,将拭子深人泻殖腔转一圈沾取粪便; 1 由指定单位提供,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不表示对该产品的认可 如果其他等效产品具 有相同的效果,则可使用这些等效产品
GB/T19438.3一2004 将咽喉拭子和泄殖腔拭子一并放人盛有1.0mlPBS的Eppendor管中备用 6.2.2肌肉或脏器样品 用无菌的剪刀,毁子取待检样品2.0g于研钵中充分研磨,加10mLPBS混匀,l000g离心10 min 后,取上清液转人Eppendorf管中备用 6.2.3血清或血浆 用无菌注射器直接吸取至Eppendorl管内备用 6.2.4保存与运送 采集或处理的样本在2C8C条件下保存应不超过24h,长期保存须在一70C以下,但应避免 反复冻融(冻融不超过三次) 样品采集后,将采集的样品密封并编号,采用保温壶或泡沫箱加冰密封尽快运送到实验室 操作方法 实验室的设置与管理 实验室的设置与管理见GB/T19438.1一2004中附录C 7.2样本的制备 7.2.1在样本制备区进行 7.2.2样本的制备程序 7.2.2.1取n个1.5mL灭菌Eppendorf管,其中"为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之 和,对每个管捕号标记. 7.2.2.2每管加人600L裂解液,然后分别加人待测样本、,阴性对照、阳性对照各200L,一份样本 换用一个吸头;再加人20L三镇甲烧,混匀器上剧烈震荡混匀句5 于4C条件下,12o0rm肉 心15min -20C预冷). 7.2.2.3取与7.2.2.1中相同数量的1.5ml灭菌Ependo「管,加人500L异丙醇( 对每个管编号标记 吸取7.2.2.2离心后各管中的上清液转移至已加人异丙醉的相应管中,上清液至少吸取 7.2.2.4 00AL.,不要吸出中间层,颠倒混匀 7.2.2.5于4C条件下,12000r/min离心15min,注意固定离心管方向,即将离心管开口朝离心机 转轴方向放置 轻轻倾去上清液,倒置于吸水纸上,沾干液体,不同样品须在吸水纸不同地方沾干 7.2.2.6加人600L75%乙醇,颠倒洗涤 于4C条件下,12000r/min离心15min 轻轻倾去上清 液,倒置于吸水纸上,沾干液体 7.2.2.74000r/min离心10s将管壁上的残余液体甩到管底部.用微量加样器将其吸干,一份样本换 用一个吸头,吸头不要碰到有沉淀一面,室温干燥3min 不宜过于干燥,以兔RNA不溶 7.2.2.8加人11lDE:PC水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min离心5s,冰上保存备用 提取的RNA须在2h内进行RT-PCR扩增,长时间保存,须置于一70C条件下 靶核酸的反转录和扩增 7.3.1扩增试剂准备与配制 7.3.1.1在反应混合物配制区进行 7.3.1.2从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液、Taq酶,待反应液室温下融化后,2000r/min离心 55 s 设所需PCR反应数为n,其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和 每个测试反 应体系需使用15LRT-PCR反应液及0.25LTaq酶 计算各试剂的使用量,加人一试管中,向其中 加人0.25×n颗RT-PCR酶颗粒,充分混合均匀,向每个PCR管中各分装15L,转移至样本处理区 7.3.2加样 7.3.2. 在样本处理区进行
GB/T19438.3一2004 7.3.2.2在各设定的PCR管中分别加人7.2.2.8制备的RNA溶液各10AL,盖紧管盖后,500r/min 离心30s 7.3.3荧光RI-PCR反应 7.3.3.1在检测区进行 7.3.3.2将7.3.2.2中加样后的PCR管放人荧光PCR检测仪内并记录样本摆放顺序 7.3.4反应参数设置 荧光RT-PCR检测H7亚型禽流感病毒的反应参数为 第一阶段,反转录42C/30min; 第二阶段,预变性92C/3min 第三阶段,92/10s,45C/30s,72C/1min n,5个循环 第四阶段,92C/10s,60C/30s,40个循环,荧光收集设置在第四阶段每次循环的退火延伸 时进行 结果判定 8.1结果分析条件设定 8.1.1读取检测结果，闵值设定原则以阔值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点， 8.1.2不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整 8.2质控标准 阴性对照的检测结果应没有特异性扩增,阳性对照的Ct值应小于28.0. 8.3结果描述及判定 8.3.1阳性 C值小于等于30.0,而且出现明显的扩增线,表明样品中存在H7亚型禽流感病毒 8.3.2阴性 无Cct值并且无扩增曲线.表明样品中无H7亚型禽流感病毒 有效原则 C值大于30.0的样本须重做,重做结果无C值者为阴性,否则为阳性
GB/T19438.3一2004 附 录A 资料性附录 H7亚型禽流感病毒荧光T-PCR试剂盒组成,说明,功能及使用时的注意事项 试剂盒组成 A.1 每个试剂盒(规格为48反应/盒)包括以下成分 裂解液 30mlX1盒 DEPC水 mLX1管 1 H7亚型禽流感病毒RT-PCR反应液 750L×1管 RT-PCR酶 颗/管×12管 Taq酶 12L×1管 阴性对照 lmL.X1管 阳性对照(非感染性体外转录RNA lmL×1管 A.2说明 A.2.1裂解液的主要成分为异硫酸呱和酚,为RNA提取试剂,外观为红色液体,于4C保存,其他 试剂保存于-20C A.2.2DEPC水,是用1%DEPC处理后的去离子水,用于溶解RNA A.2.3RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子 A.3使用时的注意事项 A.3.1 由于阳性样品中模板浓度相对较高,检测过程中不得交叉污染 A.3.2反应液分装时应避免产生气泡,上机前检查各反应管是否盖紧,以免荧光物质泄露污染仪器 A.3.3RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活,必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量 剩余部分立即放回干燥器中