GB/T35527-2017
化学品沉积物中底栖寡毛纲环节动物生物蓄积试验
Chemicals—Bioaccumulationinsediment-dwellingbenthicoligochaetes
- 中国标准分类号（CCS）A80
- 国际标准分类号（ICS）13.300;11.100
- 实施日期2018-07-01
- 文件格式PDF
- 文本页数32页
- 文件大小2.74M
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化学品沉积物中底栖寡毛纲环节动物生物蓄积试验
国家标准 GB/T35527一2017 化学品沉积物中底栖寡毛纲 环节动物生物蓄积试验 Chemicals一Bioaceumulation insediment-dwelngbenthieoligoehaetes 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/35527一2017 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准与经济合作与发展组织(OECD)化学品测试导则No.315(2008年《沉积物中底栖寡毛纲环 节动物生物蓄积英文版)技术性内容一致
本标准由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口
本标准起草单位:广东省微生物研究所、环境保护部固体废物与化学品管理技术中心、南京环境科 学研究所、检验检疫科学研究院、广东中科英海科技有限公司、浙江省农业科学院
本标准主要起草人:梅承芳、陈进林,梁笑婷、刘纯新、邓桂荣、王蕾、刘新洋、陈会明、梁秋、王彦华
GB/T35527一2017 引 言 摄食沉积物的深水底栖动物易暴露于沉积物中含有的化学物质
在沉积物摄食者中,寡毛纲环节 动物在水生生态系统的底层扮演着重要角色
它们栖居在沉积物中,是较为恶劣环境下生存的众多物 种的代表
通过在沉积物中的生物扰动或被捕食,寡毛纲动物可对其他生物如底栖鱼类)对化学物质 的生物利用度产生重要影响
与浅水底栖生物不同的是,深水底栖寡毛纲动物在沉积物中具有掘洞行 为,并摄食沉积物表层下的沉积物颗粒
因此,这些生物可通过多种途径暴露于化学物质,包括直接接 触、摄食含有受试物的沉积物颗粒、吸取孔隙水和上覆水等
目前在生态毒理测试中常用的底栖寡毛纲 物种参见附录A
描述某物质生物蓄积性的参数首先包括蓄积系数(BAF),其次是沉积物吸收速率常数(k,)和清除 速率常数(k
.)
一般情况下,为了评估易于分布在沉积物内部或表层的化学物质的生物蓄积性,应采取特定的测试 [l] 方法 本试验方法适用于评估与沉积物相关的化学品在深水底栖寡毛纲蠕虫中的生物蓄积性
通过将受 试物漆加到沉积物中的方式来模拟自然界中含化学物质的沉积物
本试验方法基于现有的沉积物毒性和生物蓄积试验方法中刀,并参考了其他相关文件,包括国际研 讨会的成果时以及国际比对试验的验证结果g7 IN
GB/35527一2017 化学品沉积物中底栖寡毛纲 环节动物生物蓄积试验 范围 本标准规定了化学品沉积物中底栖寡毛纲环节动物生物蓄积试验的术语和定义受试物必备资料 和信息、试验原理、参比物、仪器设备、试验系统、试验程序、试验有效性、数据与试验报告
本标准适用于稳定的中性有机化合物(lgK值在3.0~6.0之间,0,易于与沉积物结合,极强的 滚脂性物质(lgK.大于6.0),稳定的金属有机化合物(易于与沉积物结合)"和已知在生物体内具有 生物蓄积性的化学物质(如表面活性剂或高吸附性物质,即高K物质)
若在试验设计上未对诸如底栖基质和水的体积、生物组织样品的大小等参数进行修改,本标准不适 用于金属及其他微量元素的测试时 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件
凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件
GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验 化学品快速生物降解性改进的MII试验(I) GB/T21802 GB/T21803化学品 快速生物降解性DOC消减试验 化学品蚯蚓急性毒性试验 T GB 21809 化学品快速生物降解性;密闭瓶法试验 GB/T2183 化学品 GB 21845 水溶解度试验 21852化学品分配系数(正辛醉-水)高效液相色谐法试验 GB 化学品分配系数(正辛醇-水)摇瓶法试验 GB 21853 21855化学品与pH有关的水解作用试验 GB 21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验 GB GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验 GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的燕气压力和温度关系及初始分解温度的方法 GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-Pa至10Pa范围内的测定静态法 GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平 衡法 GB/T27853化学品水-沉积物系统中好氧厌氧转化试验 GB/T27860化学品高效液相色谱法估算土壤和污泥的吸附系数 GB/T27861化学品鱼类急性毒性试验 GB/T35523化学品地表水中好氧矿化生物降解模拟试验 AsTME13911994毒理测试用沉积物的收集、存储、表征和操作方法(Standardguide forcol letion，storage.charaeterisation，andmanipulationofsedimentfortoxicoogiealtesting) AsTME1688;2000a底栖无脊椎动物对沉积物相关污染物的生物蓄积性测试标准导则 Standardguideforthedeterminat ofsediment-associatedcontaminantsby on ofthebioaccumulation
GB/T35527一2017 benthic tebrates invert OECD化学品测试导则No.104燕气压(Vapourpressure) Solutions) OECD化学品测试导则No.115水溶液的表面张力(SurlaceTension 1ofAqeous OECD化学品测试导则No.310快速生物降解性密闭瓶cO法(顶空试验[ReadyBiodegradl ability-co.insealedvessels(HHe Test eadspace USEPA600/R-99/064:2000采用淡水无脊椎动物测定沉积物相关污染物的毒性和生物蓄积性 oxicity andbioaccumulationofsediment-associatedcontaminants 的方法(Methodsformeasuringthe withfreshwaterinvertebrates) 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1 人工沉积物artificialsediment 配制或合成的沉积物,是模拟自然沉积物物理组分的混合物
3.2 生物蓄积bioaccummulation 相对于周围环境介质中的受试物浓度,生物体内受试物浓度的增加
生物富集和生物放大过程均 能引起生物蓄积
3.3 生物蓄积系数bioaceummulationfactor BAF 在生物蓄积试验吸收阶段的任一时间点,受试生物体内的受试物浓度(C.,以8/ke湿重或干重表 示)与环境介质中受试物浓度(c.,以g/k湿重或干重表示)的比值
BAF的单位为kg沉积物/ke8 [13 蠕虫 3.4 动态生物蓄积系数kineticbioaccumulationfactors BAFK 由沉积物的吸收速率常数和清除速率常数(k
和k.
)的比值计算得到 3.5 生物富集biocncentration 受试生物仅通过体表吸收受试物,使其体内受试物的浓度相对于周围介质中该物质浓度的增加
3.6 生物放大作用biomagnifieation 受试生物主要通过捕食被受试物污染的食物或者猎物,使其体内受试物的浓度相对于食物或猎物 中该物质浓度的增加
注生物放大作用可导致受试物在食物网中迁移或累积
3.7 生物-沉积物蓄积系数bioti一sedimemtaceumulationfaetor BSAF 在稳定态下,受试生物体内经脂肪校正的受试物浓度除以沉积物中经有机碳校正的受试物浓度
其中,C
以g/kg生物体脂肪含量表示,C
以g/kg沉积物TOC表示
GB/35527一2017 3.8 调节期cnditoningperiod 在加人受试物之前,使沉积物中的微生物组成达到稳定并去除氨的过程
注通常情况下,调节期后弃除上覆水 3.9 清除 elimination 通过主动或被动的方式使受试生物体组织中受试物减少的过程
注:该过程不依赖于周围环境介质中受试物存在与否
3.10 清除阶段 elimimationphase 随着受试生物从受污染的基质中被转移到不含受试物的基质中,受试生物清除体内受试物(或受试 物的净损失)所需的时间
3.11 清除速率常数eliminatiorateconstant 随着受试生物从受污染的基质中被转移到不含受试物的基质中,受试生物体内受试物浓度下降率 的数值,以d-表示
3.12 平衡期equilibrationperiodl 在沉积物中添加受试物后但未引人受试生物之前,受试物在固相、孔隙水和上覆水之间达到分配稳 定所需的时间
3.13 正辛醇-水分配系数oetanolwaterpartitonngcoefieient 达到平衡时,受试物在正辛醉中的溶解度与其在水中溶解度的比值
注1:也可表示为P 注2可用K.的对数(lgK)来表示水生生物对受试物的生物蓄积潜力 3.14 有机碳-水分配系数organiccarbon-waterpartitioningcoefficient K
达到平衡时,受试物在沉积物有机碳组分中的浓度与其在水中浓度的比值
3.15 上覆水overlyingwater 在试验容器中覆于沉积物上层的水
3.16 稳定态steadystate 平台期plateau 暴露阶段时吸收过程和清除过程同时达到平衡的状态
注达到稳定态时,各采样点的BAF对时间绘制的曲线与时间坐标轴平行且连续3次每次至少间隔2d取样时 测得的BAF变化不超过士20%,且BAF数值在统计学上无显著性差异
对于吸收缓慢的受试物,较为理想的 [ 采样间隔时间为7d" 3.17 孔隙水 porewater 沉积物或土壤颗粒空隙中的水
GB/T35527一2017 3.18 沉积物吸收速率常数 sedimentuptakerateconstant 沉积物中的受试物中被吸收,受试生物体内的受试物浓度增长的速率值
注人，表示为丛沉积物/(kg朝虫d') 3.19 加标沉积物spikedsediment 添加了受试物的沉积物
3.20 稳态生物蓄积系数steadstatebioaccumulationfactor BAF
达到稳定态时的BAF值,并且在相当长的一段时间内不会发生显著变化,同时受试物在周围介质 中的浓度(C,,以g/kg沉积物湿重或干重表示)趋于恒定
3.21 吸收或暴露阶段uptaker phase exp0sure 受试生物暴露于受试物的时间
受试物必备资料和信息 4.1目前仅建立了少数有效的关于生物蓄积过程的定量构效关系(Q5AR),其中应用最为广泛的是 针对稳定有机物的生物蓄积性和生物富集性与其亲脂性(表示为辛醇-水分配系数的对数lgK)之间 的相关性,该方法建立的初衷是为了描述受试物在水和鱼体之间的分配关系
已利用该方法建立了关 于沉积物分布的相关性.11 gK-lgBCF相关性作为主要的QsAR方法,有助于初步估算沉积物 中化学品的生物蓄积潜力
BAF可能受到受试生物的脂肪含量以及沉积物中总有机碳含量(TOC)的 影响
因此,有机碳-水分配系数(K.)也应作为评价沉积物中有机化合物生物蓄积性的一项重要指标
4.2在开展试验前应获知安全防护措施、适当的储存条件、稳定性和分析方法等受试物相关信息
由 受试物的物理化学特性所决定的难测试物质的试验方法可参考相关文件.m
在开展水生寡毛纲动 物的生物蓄积性试验之前,应了解受试物的以下信息 通用名、化学名(最好是IUPAC名,结构式.CAs登记号、纯度; a 水溶解度,试验方法按GB/T21845 b 分配系数(正辛醇-水,K),试验方法按GB/T21852和GB/T21853, 沉积物-水分配系数(K
或K),试验方法按GB/T27860; d 与pH有关的水解作用试验方法按GB/T21855; o 在水中的光转化作用; 蒸气压,试验方法按GB/T22052.GB/T22228、GB/T22229和OECD化学品测试导则 g No.104 快速生物降解性,试验方法按GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803,GB/T21831、 h GB/T21856,GB/T21857和OECD化学品测试导则No.310: 表面张力,试验方法按OECD化学品测试导则No.115; r\w" 临界胶团浓度[n k 在水环境中的生物降解性,试验方法按GB/T27853,GB/T35523; D 亨利常数(必要时
4.3使用放射性同位素标记的受试物有助于分析水,沉积物和生物样品,还可对降解产物进行定性和
GB/35527一2017 定量分析
本标准规定使用经过比对试验可验证的C标记化合物
若测定放射性残留的总量,则 BAF的计算应基于母体化合物和所有留存的降解产物
在吸收阶段结束时或生物蓄积达到稳态时,通 过定性和定量分析母体化合物及其降解产物在生物样品中所占的比例,可将代谢试验与生物蓄积试验 结合在一起
任何情况下,BAF的计算都应以生物体内母体化合物的浓度为基础,而不仅仅是基于总 放射性残留
4.4除了受试物的性质,还应提供其对寡毛纲生物的毒性信息,例如影响吸收阶段必要时间的半数致 死浓度(ICm),以确保所选择的暴露浓度远低于化合物的毒性水平
若可行,应首先考虑长期试验中得 到的亚致死终点(EC值)
若无法获得以上数据,可参考与生物蓄积试验条件相同的急性毒性试验获 得的信息,或其他替代物种的毒性试验数据
4.5分析方法应具有一定的精密度、准确度和灵敏度,从而用于受试物在试验溶液、沉积物和生物体内 的定量分析
应具备生物样品制备与保存的详细信息以及受试物的安全数据表
此外还应了解受试物 在水、沉积物和蠕虫组织中的分析检出限
若使用放射性同位素标记的受试物,应了解比放射活性(如 mol),放射性同位素标记的原子在受试物分子中的位置以及杂质所占的放射性百分比等相关信息
Bq/ 受试物的比放射活性应足够高,以检测到足够低的受试物浓度 4.6有关沉积物特性的信息包括:沉积物的来源或组成成分、孔隙水的pH值和氨浓度(天然沉积物、 TOc,粒径分布(砂粒、粉粒和黏土的百分比)和干重百分比等
试验原理 5.1生物蓄积试验分为两个阶段;吸收(暴露)阶段和清除(暴露后)阶段
在受试物吸收阶段,往添加 有受试物的沉积物中加人配制水(即培养基)直至没过沉积物的顶部,经过适当的平衡后,放人蠕虫开始 暴露[
同时采取相同的试验条件设置不含受试物的对照组
5.2在清除阶段,将蠕虫转移到不含受试物的沉积物-水系统中,以获得受试物在生物体内的排泄速 率In.的
通常需要进行清除阶段的试验,除非在吸收阶段发现蠕虫对受试物的吸收作用不显著(例如 对照组与处理组中蠕虫体内的受试物浓度无统计学意义上的差异)
若在吸收阶段尚未达到稳定状态 则可利用清除阶段的试验结果确定动力学参数;BAF、吸收和清除速率常数
在吸收阶段和清除阶段 均应对蠕虫体内受试物浓度的变化情况进行监测 5.3在吸收阶段,定期测定受试物的浓度变化直至BAF达到稳定态
吸收阶段的试验时间默认为 28d,经验表明对于 14d的吸收阶段足以达到稳定态6, 些稳定的中性有机物,12d 5.4即使吸收阶段在28d内仍未达到稳定态,也可将暴露的寡毛纲蠕虫转移至含有相同培养基但不 含受试物的试验容器中开始清除阶段的试验
当蠕虫体内的受试物浓度仅为28d吸收阶段测定浓度 的10%时,或者清除阶段已达到 ,可结束清除阶段试验
清除阶段结束时蠕虫体内 到最长试验时间(10d). 受试物的残留量应作为附加终点予以报告,即非清除残留(NER)
BAF.可通过稳态时受试物在蠕虫 C.,)和沉积物(c.)中的浓度之 若 是人,与人
的比值假定其符合一级动力学模型》. 吸收阶段在28d内未达到稳定状态,BAF可通过吸收和清除速率常数计算(见附录B)
若一级动力 学模型不适用,应采用更加复杂的模型(见附录B)" 5.5若吸收阶段在 28d内仍未达到稳定态,可适当延长蠕虫暴露组吸收阶段的试验时间,同时增加测 定直至达到稳定态
此时清除阶段仍然可在吸收阶段的28d开始,与吸收阶段的延长试验同时进行
5.6采用计算机模型计算k.,k.(或其他更复杂模型中得到的相关常数,BAFK,若可行,同时计算每个 参数的置信限(见附录B)
任何模型的拟合度可由相关系数或决定系数来确定,系数接近1表示拟合 度好
5.7为减少高亲脂性有机物试验结果的可变性,生物蓄积系数还可表示为与受试生物脂肪含量和沉积 物TOcC相关的形式即生物-沉积物生物蓄积系数,或每千克沉积物T0C每千克蠕虫脂肪含量的
GB/T35527一2017 BSAF)
该方法以水生态系统中实践和理论的相关性为基础,即对于某些类别的化合物,物质潜在的 ,20 生物蓄积能力与其亲脂性之间存在明确的相关性,如对于模式生物鱼类,该相关性已得到确认a.1" 受试鱼体内的脂肪含量与观察到的上述化合物的生物蓄积性密切相关
对于底栖生物而言,也存在类 似的相关性[a.打
若能获得足量的蠕虫组织,可使用与分析受试物浓度相同的生物材料来测定其脂 肪含量
然而更为可行的做法是,至少在吸收阶段开始时或最好在吸收阶段结束时,使用驯养条件下的 对照生物来测定脂肪含量,以对BAF值进行标准化校正
参比物 6 可选用氧化钾或硫酸铜作为参比物
应定期(如每个月)进行参比物毒性试验(试验时间为96h 仅在水中暴露),以确定试验生物的健康状态
若来定期进行参比物毒性试验,则应使用参比物来检蠢 用于生物蓄积试验的整批试验生物的健康状况
此外,脂肪含量也可作为反映试验动物健康状况的参 考信息
仪器设备 应注意避免使用易溶解的、能吸附受试物的、可释放其他物质并对受试生物有不良影响的材料所制 成的试验设备
可使用由惰性化学材料制成的标准矩形或圆柱形容器,其容积应满足生物承载量(如受 试蠕虫的使用量)的需求
试验中应避免使用由塑料软管制成的水管或气管
任何与试验介质接触的 设备均应由特氟隆、不锈钢和/或玻璃制成
对于具有高吸附性的受试物,如人工合成的拟除虫菊酯,应 使用硅婉化玻璃容器,并且这些容器应在使用后弃除不用
对于放射性标记的受试物和挥发性化合 物,应注意避免受试物逸出
同时,应配置含有适量吸收剂的吸收装置(如玻璃气体洗瓶),从而确保所 有从试验容器中挥发的物质均被吸收[的
试验系统 8 8.1受试生物 水生寡毛纲环节动物的多个物种均可用于本试验,最常用的试验物种参见附录A
为了获得足够数量的蠕虫用于生物蓄积试验,蠕虫应在实验室进行长期的单物种培养(参见附录 )[6,7,15,2120 A 8.2试验用水 沉积物上覆水的水质应确保受试生物在驯养期和试验期内存活且不出现任何外观或行为异常
宜 使用规定的配制水作为试验的上覆水以及蠕虫在实验室的培养用水[1叮,配制方法见GB/T27861
许 多物种在配制水中均能够正常生存,生长和繁殖们,采用配制水可最大可能地实现试验和培养条件的标 准化
测试的水质指标至少应包括pH值、电导率和硬度
使用前分析试验用水中的微量污染物可为 试验提供有用的信息(参见附录C) 试验期间应维持水质的稳定
上覆水的pH值范围为6一9,试验开始时水的总硬度范围为 [s,9
,见GB/T27861
若预计水中总硬度离子可能会与受试物发生 90mg/L400mg/I(以碳酸钙计" 反应,则应选用更低硬度的试验用水(参见附录o)
GB/35527一2017 8.3沉积物 8.3.1 总则 沉积物的质量应能满足试验生物在驯养和试验期间的正常生存和繁殖,并且无任何外观和行为异 常
蠕虫在沉积物中有掘洞习性,掘洞行为可对暴露产生影响,从而影响BAF
因此,应记录受试生物 在沉积物中的趋避或掘洞行为，上覆水的浊度应不影响上述行为的观察
放人试验容器后的24h内 对照组和处理组的蠕虫应开始掘洞
若观察到蠕虫未能持续掘洞或从沉积物中趋避(如在超过吸收阶 段 -半的时间内观察到超过20%的蠕虫 蠕虫出现上述现象),则表明试验条件不合适或受试生物不健康,还 有可能是受试物浓度的原因引起了该行为
此时应停止试验,改进试验条件后重新开展a.
若能观 察到沉积物表面有无排泄物颗粒,则可表明蠕虫是否摄取了沉积物,应予以记录,并可考虑将其用于与 暴露途径有关的试验结果的解释分析
因为难以确保一年四季都能采集到符合要求的天然沉积物,所以宜采用人工沉积物(GB/T21809) 用于蠕虫的试验和实验室培养
此外,天然沉积物中的土著生物和可能存在的微量污染物将影响试验 结果
多个试验物种可在人工沉积物中正常生存、生长和繁殖 人工沉积物的基本特性应至少包括沉积物的组成及来源、粒径分布(砂粒、粉砂粒、黏土的百分 比),TOc,水分和pH值
氧化还原电位为可选的测试参数
来自无污染区域的天然沉积物也可用于 试验和/或培养受试生物
天然沉积物的基本特性应至少 少包括;采集地点、pH值、孔隙水中的氨含量 TOC、粒径分布(砂粒,粉砂粒,黏土的百分含量)和水分含量
若预判沉积物中氨的浓度可能会升高 则在加人受试物之前应将沉积物置于与随后的试验相同的条件下平衡7d
在该平衡调节过程结束时 弃除沉积物中的上覆水
使用前可分析沉积物或其组分中的微量污染物以提供有用的信息
8.3.2沉积物的制备与贮存 天然沉积物在实验室使用前应按照相关方法(AsTME1391、AsTME1688和USEPA600/R 99/064)进行处理
人工沉积物的制备方法参见附录D. 天然沉积物在实验室的贮存时间越短越好
在4C士2C黑暗条件下最长可保存8周，且沉积物 的贮存容器上方不应留有顶部空间(参见附录D)
8.4受试物的添加 将受试物添加到沉积物中
添加操作涉及将一种或多种沉积物组分与受试物混合
例如,将石英 砂或其中一部分(如每个试验容器取10g石英砂)浸泡在溶解有受试物的有机溶剂中,待有机溶剂慢慢 挥发完全后,将包覆有受试物的组分与湿的沉积物混匀
制备沉积物时,应考虑受试物与砂粒混合物中 砂粒的含量,即沉积物应含有尽可能少的砂粒
对于天然沉积物,可采用上述处理人工沉积物的方式添加受试物,即将受试物加人到部分干燥的沉 积物中;或通过搅拌将受试物 的沉积物混合均匀,随后挥发去除所用的助溶剂
适用于直接添加到 与湿 湿的沉积物中的有机溶剂包括乙醇、甲醇、乙二醇单甲酥、乙二醇二甲酥、二甲基甲酰胺和三甘醇[l.3们 溶剂的毒性、挥发性和受试物在溶剂中的溶解性是选择助溶剂时主要的考虑因素[
应确保受试物完 全均匀地分布在沉积物中
对于已添加了受试物的沉积物,应采集多份沉积物样品用于测定受试物的 浓度,以确定受试物分布的均- 制备好含上覆水的沉积物后,将其置于与试验相同的温度和曝气条件下,使受试物在沉积物与水相 之间分配达到平衡
平衡所需的时间由沉积物和受试物的具体性质决定，一般为几个小时到几天,极少 L22,31门 数情况下可长达数周(4周~5周 本标准中无需等待平衡,但宜采用48h至7d的平衡期
可 根据不同的研究目的,如当模拟环境条件时,加人受试物后的沉积物可能需要平衡或老化更长的
GB/T35527一2017 时间 g 试验程序 9.1预试验 为了优化正式试验的试验条件,如受试物浓度的选择、吸收阶段和清除阶段的试验时间,可先开展 预试验
在预试验中应观察和记录蠕虫的行为,如由于受试物和/或沉积物本身的原因而引起的蠕虫自 沉积物中趋避
预试验中蠕虫的趋避行为可作为亚致死参数,用于估算生物蓄积试验中受试物的浓度
9.2暴露条件 9.2.1吸收阶段的持续时间 在吸收阶段,将受试生物暴露于受试物
在吸收阶段开始后的4h一2h内采集第一个样品
吸 收阶段应持续进行28d”,但若能证明吸收已经达到稳定态,可提前结束
当满足下列条件之一,则表 明已达到稳态 a 每个采样点的生物蓄积系数对时间的绘制曲线与时间坐标轴平行 至少间隔2d取一次样,连续3次测得的BAF值变化不超过士20%; b 连续3次取样测得的BAF值无显著性差异(基于统计学比较,如方差分析和回归分析)
若纷 c 过28d仍未达到稳定状态,也可结束吸收阶段并开始清除阶段
BAF
可通过吸收和清除速 率常数进行计算(见第5章)
9.2.2清除阶段的持续时间 清除阶段开始后,由于在初期生物组织中受试物的残留浓度可发生快速变化,应在4h一24h内采 集第一个样品
当受试物浓度低于稳奋受试物浓度的10%或者请除阶段已达到最长试脸时间10d时 可结束清除阶段
清除阶段结束时蠕虫体内的受试物残留水平应作为第二终点予以报告
此外,应控 制试验时间以确保试验期间蠕虫体内的受试物残留量仍高于分析的检出限
9.3受试生物 9.3.1受试生物的数量 为了确保在吸收阶段的前期和清除阶段的后期每个样品中的受试物含量均显著高于受试物在生物 材料中的检出限,样品所包含的蠕虫数应能提供足量的组织样品
在吸收阶段的前期和清除阶段的后 期,生物体内受试物的浓度通常会比较低[6.
因为水生寡毛纲中多个物种的个体质量都非常低(夹杂 带丝蚓L.umnbriculusariegatu、和正颤蚓Tubifertubifer个体的湿重为5mg10mg),可将采自同 -个平行试验容器中的蠕虫进行合并,用于称重和受试物浓度分析
对于个体质量较大的试验生物,如 苏氏尾飓蚓Bn 3ranchiurasrwerbyi),可采集单个动物分别称重和分析
但此时,每次采样的平行数应 增加至5个时
应注意的是,苏氏尾腮蚓未经过比对试验的验证叮,因而在本方法中不宜使用该物种 应使用个体大小相近的蠕虫(参见附录A)
受试蠕虫应具有相同的来源,且为同一虫龄阶段的成 熟或较大个体(参见附录A)
生物的质量和年龄可对BAF值产生显著影响如不同的脂肪含量和/或 是否有卵存在),应准确记录这些参数
试验开始前,应采集蠕虫样品测定其平均湿重和干重
正颤蚓和夹杂带丝蚓在试验过程中会进行繁殖
若生物蓄积试验中出现繁殖量减低的情况应进行 记录,并在试验结果的解释中予以分析
GB/35527一2017 9.3.2承载量 在吸收阶段,为了减少沉积物中受试物浓度和溶解氧浓度的下降,试验体系宜采用较高的沉积物！ 蠕虫比和水/蠕虫比
承载量的选择还应符合所选物种在自然界中的种群密度[
例如,对于正颤蚓 而言,承载量宜为每克湿沉积物中正颤蚓的湿重为lmg 4mg司;对于夹杂带丝蚓而言,承载量宜为 每50克沉积物(以TOC计算)中蠕虫的质量<1g干重
通过筛网将蠕虫从培养的沉积物中分离出来
将成熟或个体较大的、且在近期无分裂迹象的蠕虫 转移到装有洁净水的玻璃器皿(如培养皿)中
若试验条件与培养条件不同,应驯化24h
称重前,将 蠕虫小心地放置在预先润湿的薄纸上,吸去蠕虫身上多余的水分
不宜使用吸水纸,因为此举可能会对 蠕虫造成协迫或伤害
用于试验的未吸除水分的蠕虫质量宜为目标生物量的1.33倍,其中的33%作为 水分引人的设差 在吸收阶段开始时(试验第0天),将受试生物从驯养箱中移出,随机地分人装有配制水的容器中 按试验组别依次往每个容器放人2条蠕虫,直至每个容器中蠕虫的数量为10条
用软钢 如培养皿)
钳将每组蠕虫随机地分至单独的试验容器中,然后将试验容器放置在试验条件下进行培养
9.3.3饲喂 考虑到人工沉积物中营养成分的含量较低,应向沉积物中添加食物
为了避免降低受试生物的暴 露如选择无污染的食物进行饲喂),应在受试物加人之前或加人过程中将满足受试生物繁殖和生长的 必要食物量一次性添加至沉积物中(参见附录D)
9.4沉积物-水的比例 沉积物-水的比例宜为1:4
该比例有利于沉积物中游解氧的含量维持在适当的水平,同时避 免在上覆水中形成氨的积累
上覆水中的氧含量应>空气饱和度的40%
通过在沉积物表面上方约 2cnm处固定一根巴斯德吸管,向沉积物的上覆水以每秒2个~4个气泡的速率进行轻微曝气,曝气时应 尽量减少对沉积物的扰动
9.5光照和温度 培养和试验阶段的光照时间为每天16h
试验区域的光照强度约为500lx1000lx
在整个试 验过程中,温度应维持在20C士2C范围内
9.6试验浓度 可采用一个尽可能低的试验浓度用于测定受试物的吸收动力学,也可增设一个较高的试验浓度 组时
在达到稳态时或者吸收阶段持续28d后取样分析以确定较低浓度下测得的BAF值的
设置 较高浓度组用以排除不利效应(例如,以慢性毒性研究中已知的最低慢性效应浓度EC，的1%作为较高 的试验浓度)
较低试验浓度应显著高于沉积物和生物样品中受试物分析方法的检出限
若受试物的 效应浓度接近浓度分析的检出限,宜使用经过放射性同位素标记的具有强比放射性的受试物
9.7 处理组和对照组的设置 在吸收阶段和清除阶段,为了准确测定动力学参数,每个采样时间点应至少采集3个平行样品的
在可选的附加采样期应增加平行数
在清除阶段,应准备相同数量未添加受试物并含有上覆水的试验 容器,以便在吸收阶段结束时,将处理组的蠕虫转移至不含受试物的试验容器中
各处理组的平行数应 满足吸收阶段和清除阶段采样的需求
此外,也可将用于清除阶段取样的蠕虫装于一个较大的试验容器中进行暴露试验,容器中含有与吸
GB/T35527一2017 收动力学试验相同批次的加标沉积物
其试验条件(如沉积物深度、沉积物-水的比例、承载量、温度和 水质)应与吸收阶段的各平行保持一致
在吸收阶段结束时,从该容器中采集水、沉积物和蠕虫样品进 行受试物浓度分析,同时小心地将足够数量的体型较大并且无分裂迹象的蠕虫移至提前准备好的用于 清除阶段试验的各容器中(每个试验容器移人10条蠕虫)
若除了试验用水以外未使用其他溶剂,试验应至少设置9个阴性对照组(试验开始时吸收阶段和 清除阶段结束时各取3个样本),用于生物和背景值的分析
若受试物的添加过程使用了助溶剂,则应 设置助溶剂对照组(至少在试验开始时、吸收阶段和清除阶段结束时各取3个样本),同时,至少设置4 个不含助溶剂的阴性对照用于吸收阶段结束时的采样
为了解助溶剂对试验生物可能产生的影响,可 将阴性对照组与助溶剂对照组进行生物学上的比较分析
试验取样方案示例参见附录E
9.8水质参数测定频率 在吸收阶段和清除阶段至少应测定上覆水的以下各项水质指标 温度;取样时,每个处理浓度组选择一个试验容器进行测定,每周1次以及在吸收和清除阶段 a 的开始和结束时选择对照组的1个容器进行测定
选择环境温度(空气温度或水浴温度)或某 个代表性试验容器的温度进行连续监测或每小时测定1次,并进行记录 溶解氧含量;取样时,选择对照组和每个处理组中的1个试验容器测定其上覆水的溶解氧含 b 量,以mg/L或%AsV空气饱和值)表示
曝气:在工作日至少每天检查1次曝气情况,必要时可进行适当调整
pH值;取样时,每个处理浓度组选择一个试验容器进行测定,每周1次以及在吸收和清除阶 段的开始和结束时选择对照组的1个容器进行测定
总硬度:在吸收阶段和清除阶段开始和结束时,至少选择对照组和某个浓度处理组的1个试验 容器测定其上覆水的总硬度,以mg/L.CacO表示
fD 氨总量:在吸收阶段和清除阶段开始和结束时,至少选择对照组和某个浓度处理组的1个试验 容器测定其上覆水的氨含量,以mg/LNH十或NH，或总氨氮含量表示
9.9蠕虫、沉积物和水样的取样与分析 9.9.1取样方案 需制定出28d吸收阶段和10d清除阶段的详细取样方案(参见附录E)
在吸收和清除阶段,以及放人蠕虫前,应采集试验容器中的水和沉积物样品用于受试物浓度的测 定
在试验过程中,为了监测受试物在试验系统各部分中的分布情况,应测定蠕虫、沉积物和水中受试 物的浓度
分别在吸收和清除阶段,应至少采集蠕虫、沉积物和水样各6次
连续采样直至达到稳定态或者28d
若在28d内吸收阶段内仍未达到稳定态,可开始清除阶段
开始清除阶段试验时,将蠕虫转移至含有相同沉积物和水但不含受试物的试验容器中(见第5章)
9.9.2取样和样品制备 9.9.2.1通过倾倒、虹吸或吸取的方式获得足够体积的水样用于测定受试物的浓度
小心地倒出或吸 出试验容器中剩余的上覆水,再采集沉积物样品,尽量减少对蠕虫的干扰
9.9.2.2取样时从试验容器中取出全部的蠕虫
可将每个平行容器的沉积物悬浮于上覆水中,再将其 摊开在托盘上,用软钢钳将蠕虫挑出,并在玻璃或不锈钢托盘中用水快速冲洗干净
去除多余的水分 后,将蠕虫小心转移至预先称重的容器中进行称重
通过冷冻的方式处死蠕虫(如<-18C)
观察并 记录虫卵和/或幼虫的数量
10
GB/35527一2017 g.9.2.3采集的蠕虫通常应立即称重和处死,不经过肠道净化阶段以避免虫体内残留受试物的损失时， 从而获得一个较为保守的BAF值(包括了被受试物污染的内脏)
对于lgK大于5的化合物,在水中 的肠道净化期内,生物体内受试物的残留不会显著减少;然而对于lgK小于4的化合物,其减少量则 可能较为显著 9.9.2.4在清除阶段,蠕虫在清洁的沉积物中进行肠道净化
这意味着,在清除阶段开始前应立即测定 包括肠道污染物在内的受试物含量
因为在清除阶段开始后的4h~24h,肠道内大部分的污染物将被 清洁的沉积物所取代,时
该蠕虫样品中的受试物浓度可认为是肠道净化后的组织浓度
为了说明清 除阶段未被污染的沉积物对受试物浓度的稀释作用,蠕虫肠道中内含物的质量可根据蠕虫的湿重/灰分 质量比值或蠕虫干重/灰分质量的比值进行估算 g.9.2.5若研究的目的是为了测定受试生物对受试物的生物利用度和机体组织中受试物的实际残留 量,则应采集至少1个处理组的生物样品如从额外的3个平行容器中采集),且最好在稳定期内进行采 样
对采集的样品进行称重,在清洁的水中进行6h净化,并在浓度分析前再次称重
可将蠕虫质 量和其体内受试物的浓度与未经肠道清除的蠕虫的相应数据进行比较
用于清除阶段的蠕虫在转移至 清洁的沉积物前不经过肠道清除,以减少外加压力对受试生物的影响
9.9.2.6采集的水、沉积物和蠕虫样品最好能及时分析(1d2d内),以防止受试物降解或发生其他损 失,同时可在试验过程中及时计算大致的吸收和清除速率
立即分析样品还可及时确定达到稳定态的 时间,避免延误
若无法及时分析,应将样品贮存于适当的条件下
在试验开始前,应了解受试物的稳 定性和合适的贮存条件(如贮存的时间温度和提取操作的方达等
若无法获得以上信息.,则可买取同 时向对照组的组织样品中加人受试物的方式来确定其在贮存期间的稳定性 9.9.3分析方法的质量要求 9.9.3.1受试物浓度分析方法的精密度、准确度和灵敏度从根本上决定了整个试验过程的质量,因此对 于特定的分析方法,应通过试验检查分析方法的精密度和可重复性,以及受试物在水、沉积物和蠕虫样 品中的回收率能否满足要求
同时,检查对照组样品中是否检出受试物及其浓度是否高于背景值
必 要时,可采用回收率和对照样品的本底值校正 和c
的数值
试验期间应采用同样的方法处理 所有的样品,尽量减少损失(如取样设备对受试物的吸附 应记录和报告受试物的总体回收率及其在 蠕虫、,沉积物和水中的回收率,若有还应包括挥发性物质在含有吸收剂装置中的回收率
9.9.3.2由于本标准宜使用放射性同位素标记的受试物,因此需进行总放射性分析(如母体化合物和降 解产物)
若分析方法可行,可在稳定态或吸收阶段结束时分别对母体化合物和降解产物进行定量,以 获取相关的重要信息
若进行上述测试,则应对样品进行适当的提取处理,并对母体物质进行单独定 量
在稳定态或吸收阶段结束时,若受试生物的放射性测试表明某单一降解产物占有较大比例如 >10%),宜对该产物进行鉴定O" g.9.3.3由于蠕虫个体质量较低,通常无法测定每条蠕虫体内受试物的浓度,除非采用苏氏尾飓蚓(每 条蠕虫湿重为40mg一50mg)作为受试生物
因此,可对采自单一容器的蠕虫进行合并,但这样将限 制相关数据统计程序的使用
当重点考虑特定的统计程序和权重分析时,应使用足量的试验生物和/或 设置足够的试验平行数以适应上述合并样品的操作 BAF值宜采用总湿重和总 9.9.3 .4 干重表示,必要时(如对于强亲脂性物质),也可采用蠕虫的脂肪含 量与沉积物的TOC来表示
采用合适的方法测定脂肪含量镇.们,宜使用三氯甲炕/甲醇提取技术时作 为标准方法[的
为避免使用含氯的有机溶剂也可采用比对试验中的方法,们
因为采用不同的方法 得到的测定结果不可能完全相同们,所以应给出所用方法的详细步骤
若可能,在有足够数量蠕虫组 织的条件下,应测定同一样品的脂肪含量或按照受试物浓度分析的程序将脂肪提取出来,因为在进行色 谱分析前,通常应去除脂肪
然而更为可行的方法是至少在吸收阶段开始时或最好在吸收阶段结束 时采集经过驯化的对照生物样品测定其脂肪含量,可设置3个平行
1
GB/T35527一2017 10试验有效性 有效的试验应满足以下条件: 试验结束时,对照组和处理组中蠕虫的累积死亡数不超过初始生物数量的20%; a b 应证明试验期间蠕虫在沉积物中有掘洞行为,以确保最大暴露(见8.3.1l)
数据 数据处理 将吸收阶段中蠕虫体内受试物的浓度对时间绘制受试物的吸收曲线
当曲线达到稳定态时,用式 1)计算稳态生物蓄积系数BAF. C
稳态或28d(平均值 BAF C稳态或28d(平均值 式中 蠕虫体内的受试物浓度; C -试验介质中的受试物浓度 c BAFK即为k,/k
的比值
清除速率常数人
通常由清除曲线(清除阶段蠕虫体内受试物浓度的曲 线)来确定
吸收速率常数人，则可通过吸收动力学曲线计算
首选利用计算机采用非线性参数估算方 法确定BAFK值,速率常数k，和k.(见附录B)
若清除曲线明显不符合一级动力学模型,则应采用其 他更复杂的数学模型n.D.,们 经由蠕虫体内脂肪含量和沉积物TOC对BAFK进行标准化处理后即得到生物-沉积物蓄积系数 BSAF
11.2结果解释 当受试物的测定浓度与所使用的分析方法的检出限非常接近时,应慎重解释试验结果
清晰明确的吸收曲线和清除曲线是高质量生物蓄积数据的体现
对于设计良好的试验,其BAF值 [4] 的置信限通常不超过25% 12试验报告 试验报告应至少包括以下内容 受试物 a 物理性状和理化性质,如lgK、水溶解性; 受试物的鉴定信息、来源;所使用溶剂的性质和浓度 若使用放射性同位素标记的受试物,标记原子的精确位置、比放射性、,杂质相关的放射性 百分比 b受试生物 -学名,品系,来源、,预处理、驯养条件,年龄和个体大小的范围等 试验条件 -试验方法(如静态、半静态或流水式); 光照的类型、特点和光照周期; 试验设计,如试验容器的数量、材质和尺寸、试验用水的体积、沉积物的质量和体积、试验 12
GB/35527一2017 溶液更换体积和频率(对于流水式试验或半静态试验而言试验前和试验过程中的曝气 情况、平行数、每个平行中蠕虫的数量试验的浓度数、吸收和清除阶段的试验时间,取样 的频率 -受试物的制备和添加方法,以及选择该方法的原因; 试验的理论浓度; 一配制水和人工沉积物中各组分的来源,若使用天然基质,应说明水和沉积物的来源
前处 理方法的描述,受试生物在所用介质中的生存和/或繁殖能力、沉积物特性[pH值和孔隙 水中氨的含量(天然沉积物)、ToC、粒径分布(砂粒、粉粒和黏土的百分比)、含水量以及 其他参数]和水质参数[pH值、硬度、电导率,温度、溶解氧含量、余氯浓度(必要时)以及 其他参数]; -人工沉积物干湿重百分比的理论值与测定值;天然沉积物干湿重比 试验系统的水质参数;温度、pH值、氨氮含量、总硬度和溶解氧浓度; 沉积物、水、蠕虫样品处理的详细信息,包括详细的制备操作、贮存,加标程序,提取方法、 受试物和脂肪含量的分析过程(以及精密度)和受试物的回收率 d)试验结果 对照组和每个处理组容器中蠕虫的死亡率以及观察到的任何亚致死效应,包括蠕虫的异 常行为(如回避沉积物、粪便颗粒的有无、繁殖量的下降); 沉积物和受试生物的干湿重比%(有助于标准化处理); 蠕虫的脂肪含量; 受试物在蠕虫体内的吸收和清除动力学曲线,以及达到稳定态的时间 所有取样点的c.,Cc及C
值如适用,包括标准偏差与范围),C以g/kg蠕虫全体湿重 和干重计,c,以g/kg沉积物干湿重计,C
以mg/L表示
若要求测定生物-沉积物蓄积 系数(SAF)(例如将2个或2个以上不同脂肪含量的受试生物的试验结果进行比较时. C
可进一步表示为g/kg生物脂肪含量,C
则可表示为g/kg沉积物ToC BAF表示为每千克湿重的蠕虫摄取的沉积物湿重(kg);沉积物吸收速率常数k
以每千 克蠕虫每天摄人沉积物的湿重(g)表示;清除速率常数k
以每天表示
可同时报告 BSAF值,表示为kg沉积物的TOc/kg蠕虫脂肪含量， 清除阶段结束时受试物的残留量; 若测定,应以百分比的形式表示母体化合物、降解产物和受试动物体内结合态受试物(即 采用常规方法无法提取到的受试物的百分比)的比例 数据统计分析方法; 结果评价 -结果与试验有效性要求(见第10章)的符合情况
意外或异常的结果,例如受试生物体内的受试物未完全清除,此时,预试验结果可提供有 用的参考信息 13
GB/T35527一2017 附 录 A 资料性附录) 生物蓄积试验宜使用的寡毛纲物种 A.1寡毛纲,颤蚓科,正颤蚓Iinbi/fextabifex(MLLER) A.1.1基本信息 寡毛纲颤蚓目(寡毛纲颤蚓科)正颤蚓Tubifertubifer(MUler)栖息在淡水沉积物的孔隙内,孔隙 内分布有黏液
正颤蚓头部朝下栖居于孔隙内,摄食沉积物中的微生物和有机残体,蠕虫尾部通常在上 覆水中摆动以便呼吸
虽然正颤蚓(Tubifertubifer)广泛栖息于整个北半球的各种沉积物中,但该物 种更喜欢选择颗粒细小的沉积物m
该物种适用于生态毒理测试,3,的.g4打
A.1.2培养方法 为了确保有足够数量的正颤蚓Tubi/ertubi/er)用于生物蓄积试验,应在实验室条件下对蠕虫进 行持续培养
以符合GB/T21809要求的人工土壤为基础的人工沉积物系统可用于正颤蚓T 19] tubi/fer)的培养,配制水的配制方法可参考GB/T27861" 可使用12cm一20 cm高的玻璃或不锈钢器皿作为培养容器
每个培养容器中加人一定厚度润湿 的人工沉积物(配制方法参见附录D)
沉积物层的厚度应考虑蠕虫的自然掘洞行为(对于正颤蚓T tuhi/er,厚度应至少为2 向培养系统中加人配制水,该过程应尽可能减小对沉积物的扰动
在 cm 沉积物表面的上方2cm处固定一个塑料软管并对上覆水进行轻微曝气曝气速率以每秒2个气泡为 宜,空气经0.45m滤膜过滤)
培养温度宜为20C士2C
培养系统中蠕虫的最大承载量为20000条/m沉积物表面积
更高的承载量可能会导致蠕虫的 生长和繁殖率下降 饲喂 应对在人工沉积物中培养的躺虫进行倒喂，食物可选用骤碎的鱼食"它可提供额外的背养心 频率应确保蠕虫能进行正常的生长和繁殖,同时将氨和真菌的增长速率控制在最低水平
可每周饲喂 两次(例如每平方厘米沉积物表面积投喂0.6mg~0.8mg食物)
经验表明,用去离子水将食物配制成 均匀分散的悬浮液,可促使食物在培养容器中的沉积物表面均匀分布
为了避免氨的累积,应使用流水式系统更换上覆水,或者采用人工方式每周至少更换一次
贮存培 养的沉积物上覆水应每3个月更换一次
若仅雷正颤蚓的成虫,可将辅虫的培养物过1mm筛网
为了保留虫茧可采用0.5mm孔径的箭 网,0.25mm筛网则适用于幼虫的筛选
沉积物通过后将筛网放置于水中,用软钢钳或经火抛光边缘后 的吸液管将留在筛网上的蠕虫从水中移出 只有完整的、清晰可辨的正颤蚓(Tubifertubi/e.r)个体们可用于测试或新的培养
病态或者受伤 的蠕虫,以及被真菌感染的虫茧应予以弃除
可按适当的时间间隔进行同步培养,以获得特定虫龄阶段的蠕虫
在选定的间隔期(如每两周)设 置新的培养容器,从某个虫龄段(如虫茧)开始培养
在上述条件培养下8周10周可获得成蚓
10周 后,当蠕虫结出新的虫茧即可收获培养的成蚓
收集的成蚓可用于试验,而蚓茧可用于新一轮的培养和 繁殖
14
GB/35527一2017 A.2寡毛纲,带丝蚓科,夹杂带丝蚓Lumbriculusvariegatus(MIULL.ER A.2.1基本信息 夹杂带丝蚓Lumbriculwsariegatus(寡毛纲带丝蚓科)也广泛生存于淡水沉积物中,且广泛用于 生态毒理测试
关于该物种的生物学、培养条件和敏感性等信息可参考相关文献了,.9
夹杂带丝蚓可 使用与正颤蚓T.tubifer相同的人工沉积物进行培养,但存在某些限制条件[o
由于在自然条件下 与正颤蚓相比,夹杂带丝蚓更愿意生活在粗糙的沉积物中,而在实验室内使用人工沉积物培养正颤 蚓,经过4个月6个月之后可能应停止
经验表明,采用流水式系统、以鱼食为营养源、在砂质底层 如石英砂、细砾石)培养夹杂带丝蚓,几年内都无需更新底层基质
与其他水生寡毛纲物种相比,夹杂 [7,21] 带丝蚓的最大优点是繁殖速度快,在实验室培养的种群中其生物量可快速增长" A.2.2培养方法 相关的参考文献对夹杂带丝蚓的培养条件有详细的描述[1.2 夹杂带丝蚓可在较大的水族缸中(57L一80L)、23C、,16h光照/8h黑暗的光周期、每天更换自然 水(每个容器更换45L50L)的条件下进行培养
将未漂白的棕色纸巾切成条状,并将其与试验用水 混合几秒钟后得到碎片状的纸质培养基
可将该培养基铺在水族缸底部直接用于带丝蚓的培养,或将 其放人去离子水中冷冻以贮存备用
玻璃缸中的新基质一般可持续使用约2个月
每个玻璃缸中放人500条1000条蠕虫,在半静态或流水式的试验条件下每周投喂3次,每次投 喂10mL约6g鲑鱼开口饲料
在静态或半静态的条件下,降低饲喂频率以预防细菌和真菌生长
应 对用于生物蓄积试验的食物和纸质培养基进行化学分析
在上述条件下培养,该物种的个体数量在10dl4d后可增长一倍
可使用细筛网将夹杂带丝蚓自培养基中移出,或使用边缘经火抛光的宽嘴玻璃吸管(直径约5mm 将受试生物移至烧杯中
若将培养基质一并移至烧杯中,应将装有蠕虫和基质的烧杯放置在流水式条 件下过夜,从而去除烧杯中的培养基质而将蠕虫留在容器底部
将蠕虫转移至新准备的培养容器中,或 进行下一步试验
避免使用受伤或自割的蠕虫,可用边缘经火抛光的吸液管或不锈钢锻子将其挑出 弃除
选用夹杂带丝蚓进行生物蓄积试验时,应关注的首要问题是它的繁殖模式(单分裂和变形再生)
),47] 这种无性繁殖的结果产生了两个部分,在一定时期内不需饲喂直到它的头部或尾部再生出来[ 这 意味着夹杂带丝蚓无法像颤蚓(不通过分裂繁殖)一样,可通过摄食持续性地吸收沉积物和污染物
因此,应采用同步处理以减少不可控的繁殖和再生,以及随后导致的在试验结果中出现的较大变异 性
由于部分蠕虫个体经过分裂后在一定时期内不进行摄食,它们比试验中未发生分裂的生物个体对 于受试物的暴露更低,因而容易导致结果的差异性[
在暴露开始前的10d~14d ,应对蠕虫实施人 工分裂(即同步处理)彻 最好采用个体较大且无近期分裂迹象的蠕虫,将其置于滴有培养液的载玻片 上,用解剖刀将其从身体中间切开,注意各蠕虫的尾部应大小相似
将尾部保留在含有相同培养基质和 配制水的容器中进行培养直至暴露开始,使其再生出新的头部
当经过同步处理的蠕虫在沉积物中开 始掘洞时,表明蠕虫已再生出新的头部(可在双筒显微镜下观察并验证蠕虫是否再生出头部)
此后,可 预计受试生物已处于同一个生理阶段
这意味着当试验过程中经过同步处理的蠕虫再次出现变形再生 时,几乎所有的受试生物都将均等地暴露于加标沉积物中
当蠕虫在培养基质中开始掘洞时,或在分割 后7d,应尽快对同步处理过的蠕虫进行饲喂
饲喂方法应与日常培养一致,所用的食物最好与试验中 的相同
夹杂带丝蚓应在20C士2C的试验温度下培养
再生后大小相似,形体完整、并且当受到轻 微机械刺激后能迅速作出游动或爬行反应的蠕虫才可用于试验
应避免使用受伤或者自割的蠕虫,可 15
GB/T35527一2017 使用边缘经火抛光的吸液管或不锈钢锻子将其挑出弃除
由于夹杂带丝蚓特殊的繁殖模式,选择夹杂带丝蚓用于试验时,在适宜的条件下试验过程中蠕虫的 数量会明显增加
夹杂带丝蚓的生物蓄积试验中,若出现无繁殖的现象,应予以记录并在试验结果中进 行解释
A.3寡毛纲,颤蚓科,苏氏尾蜴蚓Branchiura.sow verbyi(BEDDARD)未经比对试验验证 A.3.1基本信息 苏氏尾腮蚓最初生存于热带地区的水库、湖泊、池塘和河流的各类沉积物中
在北半球温暖的水域 中也可发现该物种
然而它们在高有机碳含量的沉积物黏土泥浆中存在更为丰富,也可生存于沉积层 中
尽管苏氏尾鲤蚓通常用其尾部掘洞,但根据其尾部的丝很容易鉴定该物种
苏氏尾鲤蚓的成蚓 cm11cm 50 体长可达9
,湿重40mg mg
该物种繁殖率较高,若按照下述培养温度和饲喂方 式你,其个体的数量在不到两周的时间内可增加一信
苏民尾蟋蚓己被用于生态毒理和生物蓄积性 [23,s1 研究 A.3.2培养方法 苏氏尾蟋蚓的培养方法可参考相关的文献的 农[25] 该生物的培养目前没有明确的技术要求
可使用无污染的自然沉积物进行培养 经验表明,由 牛[a.们
使用3L的烧杯进行 自然沉积物和砂粒组成的介质比纯天然的沉积物能够提供更好的培养条件" 培养时,烧杯中含1500mL沉积物-水介质,375ml未污染的自然沉积物(约10%TOc,17%颗粒的粒 径<63Am)、375ml清洁砂粒(M32)和750ml配制水或除氯自来水,a.n
纸巾也可用作培养基 质,但其种群的增长率低于自然沉积物中的增长率
在半静态系统中对上覆水层缓慢曝气,上覆水每周 更换一次
开始时每个烧杯中放人25条苏民尾蟋蚓
2个月后,用银子将大的苏氏尾蟋蚓从沉积物中挑出 然后转人装有新鲜沉积物和水的烧杯中,虫茧和幼虫则留在原来的烧杯中
这样每个烧杯中能收获 400条苏氏尾鲫蚓幼虫
苏氏尾细蚓成虫至少在一年内可用于繁殖
培养温度应维持在21C一25C,温度的变化范围应小于士2C
在25C条件下,苏氏尾鳗蚓从卵 到虫茧中孵出幼虫,整个胚胎发育过程大约需要3周
在25C的泥浆中,每条存活的苏氏尾飓蚓可产 下6.36个l1.2个卵.， ,每个虫茧中受精卵的数量为1.8个2.8个[0.的,最多可为8个 每周测定一次溶解氧,水的硬度、温度和pH值
将鱼食配成悬浮液,每周饲喂2次到3次,也可饲 喂解冻的生菜粉
该物种最大的优点是具有较大的个体生物质量(个体湿重达40mg一50mg).因此可用于非放射 性标记受试物的生物蓄积试验
可将其暴露在用于正颤蚓或夹杂带丝蚓的试验体系中,每个平行放人 -条蚓虫国
应增加平行的数量,除非使用了更大的试验容器到
同时,关于该物种掘洞行为的有效标 准应作出相应调整
16
GB/35527一2017 附录B 规范性附录 吸收和清除参数的计算 生物蓄积试验的主要终点指标是生物蓄积系数(BAF)
在稳定态时,BAF可通过受试生物体内的 受试物浓度c与沉积物中受试物的浓度c,的比值进行计算
若在吸收阶段无法达到稳定态,可采用 相同的方式计算28d的BAF值
计算结果中应指明BAF是否基于稳定状态下的浓度测定结果
宜利用计算机采用非线性参数估算方法计算动力生物蓄积系数(BAFk),沉积物的吸收速率常数 (k.)与清除速率常数(k
)
吸收期内给定时间段的平均蓄积系数(AF)可根据多次采样的平均值即 C,/C,的比值(基于蠕虫和沉积物的湿重),按下列模型方程计算,见式(B.1). AF(t)=BAF×(1一e) (B.1 式中: AF(e) -在吸收阶段的任意时间点(),蠕虫体内的受试物浓度与沉积物中受试物浓度的比值; 清除速率常数
上述公式还可用于计算BAFk、k，以及k
当吸收阶段达到稳态时即t=),式(B.1)可简化为式(B.2) - BAFK B.2 式中: 生物组织的吸收速率常数,以g沉积物kg蠕虫d)表示; -清除速率常数,以d-表示
即为稳定状态下辅虫组织中的受试物浓度c k、/k
×C， as
生物-沉积物蓄积系数(BSAF)按式(B.3)计算， BSAF=BAFK× (B.3 式中: -以干重计的沉积物有机碳分数; e fim -以干重或湿重计的蠕虫脂肪含量分数
给定一组连续时间点的浓度数据,可通过下列公式和基于非线性参数估算法的计算机程序对清除 动力学进行拟合
宜将吸收阶段结束时蠕虫体内残留的受试物平均浓度作为默认初始值
若实测值显著偏离体内残 留的模拟值时,则只能买用吸收阶段的模拟值或面测值
8.了中给出了用于清除阶段的蜻虫的预暴露 方法,采用该方法,清除阶段第0天预暴露蠕虫样品中的受试物浓度可视为进人清除动力学阶段蠕虫体 内受试物的实际初始浓度
若生物体内受试物浓度对时间轴的曲线呈指数连续递减,可使用下列单室模型[见式(B.4]来描述 清除阶段浓度随时间的变化 c,()=C.×e'e B.4 清除过程有时会出现两个阶段早期阶段表现为c
值快速下降,后期则表现为受试物的损失趋于 [6,o,l9] 缓慢
上述两个阶段可采用以下假设进行解释,即受试生物体内有两个不同的组成部分(腔室 全[ll,l3,l4,l9 因而受试物以不同的速率被清除" 二室清除模型可通过式(B5)进行描述n c,=A×e-大十B×e-t B.5 17
GB/T35527一2017 式中 受试生物A腔室的大小(占总组织残留量的百分比); B 受试生物B腔室的大小占总组织残留量的百分比; -A腔室的清除速率常数; -B腔室的清除速率常数
k 其中A腔室中受试物的浓度损失较快,B腔室中受试物浓度的损失较慢;A和B的总和等于稳定 态时整个动物腔室的100%
若清除阶段的数据符合二室模型,则吸收速率常数人，可按式(B.6) [54,55 计算 A×k
十B×ki)×BAF k，=- (B.6 A十B 使用上述模型方程时应谨慎,尤其是当试验过程中受试物的生物可利用度发生变化时T
作为上述模型的替代方法,可联合吸收阶段和清除阶段的所有数据,对其采用一级动力学模型,进 [56-58] 而计算动力学参数(k，和k.) 非清除残留量(NER)应作为第二终点进行计算,用清除阶段第10天蠕虫体内受试物浓度的平均 值与稳定态(或吸收阶段第28天)蠕虫体内受试物浓度的平均值的比值乘以100%,见式(B.7) C 清除阶段结束时(平均值) NER一 ×100% B.7 C
稳定状态(平均值 18
GB/35527一2017 录 附 C 资料性附录 稀释水的部分理化特性及其组成 稀释水的理化特性 C.1 稀释水的部分理化特性见表C.1
表c.1稀释水的部分理化特性 物质 浓度 颗粒物 20mg/几 TOC <24g/1 非离子刻 <14g/L <10 N 余氯 4g/ 总有机磷农药 <50ng/L 总有机氯杀虫剂和多氯联苯 <50ng/L 总有机氯 <25ng/I 宜使用的配制水组成 宜使用配制水的要求具体如下 宜使用配制水的组成和配制方法如下所示: a CaCl溶液;将l1.76gCaCl2H.0溶解于1I去离子水中, 1) 2 MgSO溶液;将4.93gMgSO7H,O溶解于1L去离子水中 NaHCO溶液:将2.59gNaHcO溶解于1L去离子水中; 3 4)KCl溶液;将0.23gKC溶解于11去离子水中
所有化学试剂均为分析纯
b 燕水或去离子水的电导率应<104s/emm
c 分别取25mL的溶液1),2),3)和4),混合均匀后加人去离子水至1L
溶液中钙镁离子的总 浓度为2.5mmol/1
e 溶液中钙镁离子比为4:1,钠钾离子比为10:1,酸容量Ks,,为0.8mol/儿L
f 对配制好的稀释水曝气直至达到氧饱和,贮存约2d,贮存期间不曝气
稀释水的pH值范围为6 g g 19
GB/T35527一2017 附 录 D 资料性附录) 人工沉积物的制备和贮存 D.1人工沉积物的成分及比例 与GB/T21809不同的是,为了模拟自然沉积物较低的TOC,人工沉积物的泥炭含量宜采用2%而 非10%以干重计)的
人工沉积物各组分特性和干重百分比见表D.1
表D.1人工沉积物干重成分的百分比 组分 性质 沉积物干重的百分比/% 泥炭藓,腐熟度“半腐熟”,风干、无肉眼可见的植物残体、 泥炭 2士0.5 颗粒较细(粒径<0.5mm 石英砂 粒径;2mm,但50%以上的颗粒粒径在50Hm一2004m范围内 76 高岭黏土 高岭土含量>30% 22士1 荨麻Foliaurhicae(荨麻属Urn rrticasp.)叶粉末,细土 食物源 粒径<0.5mm),或1;1荨麻叶粉末与a-纤维索的混合物; 0.40.5 符合人体药用标准,添加至干沉积物中 碳酸钙 碳酸钙粉状,化学纯,添加至干沉积物中 0.05~ 电导率<104s/em,添加至干沉积物中 3050 去离子水 若预测沉积物中的氨浓度将升高例如受试物具有硝化抑制作用,可用纤维素(例如.a-纤维素粉 末,化学纯,粒径<0.5mm)代替50%的含氮荨麻粉
D.2人工沉积物的制备 将泥炭风干后制成粉末(粒径<0.5mm,无肉眼可见的植物残体)
向干沉积物中加人去离子水之 前,在去离子水中加人一定量的泥炭(当去离子水的体积为泥炭干重的11.5倍时可制成可搅拌的泥炭 浆a),采用高效匀浆设备制成泥炭悬浮液 下缓慢搅拌至少2d以进 用碳酸钙将悬浮液的pH值调节至5.5士0.5
将悬浮液置于20C士2C 行调节,使pH值稳定,并建立稳定的微生物组成
再次测定pH值,必要时用碳酸钙调节至6.0士0.5
将所有的悬浮液与其他待加人的干组分混合,应考虑用于加标受试物的组分
加人剩余的去离子水以 获得均一的沉积物
再次测定其pH值,必要时用碳酸钙调节pH至6.57.5
若预计氨的含量会增 加,应保持沉积物的pH值低于7.0(如6.0 取沉积物样品用于测定干重和TOC
若预计氨的含 量会增加,在添加受试物之前,应将人工沉积物放置在与随后进行的试验相同的条件下如沉积物-水的 比例为1;4,沉积物层的高度根据试验容器而定)调节培养7d,沉积物上层应含有一定量的上覆水,并 对其曝气
调节期结束时弃去上覆水
取沉积物样品测定其干重和TOC(如取3个样品) 然后向每个处理水平的沉积物中加人加标石英砂并混匀,再将沉积物分装至各试验容器中,加人试 验用水(如沉积物-水的比例为1:4,沉积物层的高度根据试验容器而定)
将试验容器置于与随后试 验相同的条件下进行培养,即为平衡期的开始,应对上覆水进行曝气 20
GB/35527一2017 向沉积物添加受试物之前或添加过程中,应先加人一定量的食物,食物可先与泥炭悬浮液进行混 合
加人食物后应尽快开始暴露试验,以避免食物的大量分解,尤其是当平衡期较长时
为了确保食物 能与受试物充分接触,食物与沉积物的混合时间应不迟于受试物加人沉积物的当天
除非在受试生物 引人前,平衡所需的时间可能会导致食物被微生物大量分解,此时可适当延缓食物的添加
取沉积物样 品测定其干重和TOc(如取3个加标样品或空白对照组样品). 沉积物各组分(泥炭、砂粒、高岭土)的干重应以g和占总干重百分比两种形式同时表示,并予以 报告
在沉积物制备过程中,干组分中水的加人量也应报告,以总干重的百分比计(如l00%干重十46% 水,即为1000g干重加人460ml水,得到1460g湿重) D.3人工沉积物的贮存 用于制备人工沉积物的各干组分可在干燥,阴凉的室温条件下贮存
制备好的湿沉积物可在4c [6 士2C黑暗条件下保存2周一4周,但只能用于培养 加人受试物的沉积物应立即用于试验,除非有信息表明该沉积物可贮存而不会影响受试物的毒性 和生物可利用度
加标沉积物的样品可在合适的条件下贮存,直至分析
21
GB/T35527一2017 录 附 资料性附录) 28d生物蓄积试验取样方案示例 取样方案示例见表E.1和表E.2.
表E.1吸收阶段(包括4d平衡期)取样方案示例 天(d 活动 -6 准备泥炭悬浮液;悬浮液调节48h; 添加沉积物或沉积物组分;混合所有沉积物组分;采集处理组和助溶剂对照组中的沉积物样 品用于受试物的浓度分析;加人上覆水;试验条件下进行培养(平衡阶段); 取出培养的受试生物并进行驯化 测定水质《见9.8)采集多个水和沉积物平行样品用于受试物浓度测定;将蠕虫随机投放人备 试验容器中;保留足够多的蠕虫样本用于背景值的分析;若使用密闭的试验系统,则应控制氧 气的供应量 取样分析;控制氧气的供应量、蠕虫行为和水质(见9.8);采集水.沉积物和蠕虫样品用于受试 物浓度测定; 控制氧气供应量、蠕虫行为和试验温度 与第1天相同 与第2天相同 与第1天相同,必要时,补充蒸发掉的水分; 8~13 与第2天相同 l4 与第1天相同,必要时,补充蒸发掉的水分; 与第2天相同 1520 21 与第1天相同,必要时,补充蒸发掉的水分 22一27 与第2天相同 与第1天相同;测定水质(见9,8);吸收阶段结束;保留足够多的蠕虫样本用于背景值、湿重、干 重以及脂肪含量的测定;将余下各暴露平行中的蠕虫转移至装有清洁沉积物的试验容器中开 28 始清除阶段试验(无需经过肠道净化);从助溶剂对照组中采集水,沉积物样品和蠕虫样品;若 设置了吸收装置,应采集吸收液样品 根据受试物的性质,应设置预暴露活动即平衡期)
必要时,应将上覆水下的沉积物在20 预暴露 士2C条件下培养调节7d,此时应提前准备好沉积物
试验第2天后应每天控制氧气供应量、蠕虫行为和试验温度(至少在每个工作目进行 -28 22
GB/35527一2017 表E.2清除阶段(包括4d平衡期)取样方案示例 天(d 活动 -6 准备泥炭悬浮液;悬浮液调节48h; 添加所有沉积物组分;采集处理组和助溶剂对照组中的沉积物样品用于受试物的浓度分析; 加人上覆水;试验条件下进行培养; 0(吸收阶段的 测定水质(见9.8);将余下各暴露平行中的蠕虫转移至装有清洁沉积物的容器中;4h一6h后 采集水、沉积物样品和蠕虫样品用于受试物浓度的测定;将蠕虫随机放人各试验容器中 第28天 取样分析;控制氧气的供应量、蠕虫行为和水质(见9.8);采集水.沉积物和蠕虫样品用于受试 物浓度测定; 控制氧气的供应量、蠕虫行为和试验温度; 与第1天相同 与第2天相同 与第1天相同; 与第2天相同 与第1天相同,必要时,补充燕发掉的水分 89 与第2天相同 与第1天相同;清除阶段结束;测定水质(见9.8);从助溶剂对照组中采集水、沉积物样品和蠕 10 虫样品;若设置了吸收装置,应采集吸收液样品 沉积物的准备 清除阶段开始前应按照与吸收阶段相同的方式准备好沉积物
试验第2天后应每天控制氧气供应量、蠕虫行为和试验温度(至少在每个工作日进行) 210 23
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化学品沉积物中底栖寡毛纲环节动物生物蓄积试验GB/T35527-2017
底栖寡毛纲环节动物（例如蚯蚓和水蚤）是食物网的基础，因此它们对环境污染的敏感性很高。化学品存在于沉积物中，如果它们被这些生物吸收并生物蓄积，就会对食物链上的其他生物造成危害。因此，了解化学品在沉积物中底栖寡毛纲环节动物的生物蓄积情况非常重要。
GB/T35527-2017是中国国家质量监督检验检疫总局发布的化学品生物蓄积试验标准。该标准规定了一系列关于底栖寡毛纲环节动物生物蓄积试验的要求和限制。这些规定包括试验前的沉积物采集、实验动物选择、试验过程中的操作方法、数据分析和结果解释等方面。
通过GB/T35527-2017标准，可以测量化学品在沉积物中底栖寡毛纲环节动物体内的含量，并确定它们的生物蓄积能力。根据试验结果，可以评估化学品对底栖寡毛纲环节动物的生态影响以及它们在食物链中的传递效应。
需要注意的是，不同类型的化学品可能对底栖寡毛纲环节动物的生物蓄积产生不同的影响。因此，在进行化学品生物蓄积试验时，需要考虑不同类型的化学品并采取相应的措施。
总之，GB/T35527-2017是一种重要的化学品生物蓄积试验方法。通过此试验，我们可以了解化学品在沉积物中底栖寡毛纲环节动物的生物蓄积情况，从而更好地了解化学品对环境的影响。
