红球藻中虾青素的测定液相色谱法

红球藻中虾青素的测定液相色谱法

国家标准 GB/T31520一2015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 DeterminationofastaxanthininHaematococc4s Highperformaneeliquidchromatographymethod 2015-05-15发布 2015-05-15实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T31520一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由农业部提出 本标准由全国水产标准化技术委员会水产品加工分技术委员会(SAC/TC156/sC3)归口 本标准起草单位;水产科学研究院黄海水产研究所,云南爱尔发生物技术有限公司 本标准主要起草人:孙伟红、张勇、冷凯良、徐春媚刘建国、吴秋瑾、邢丽红、苗均魁、肖荣辉、孙来姊、 翟毓秀,许洋
GB/T31520一2015 红球藻中虾青素的测定 液相色谱法 范围 本标准规定了红球藻(Ha s)中虾青素的液相色谱测定方法 laenatococcs 本标准适用于雨生红球藻(Haemalococcuslucialis)藻粉中虾青素含量的测定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 原理 试样经二氯甲炕与甲醇混合溶液提取,氢氧化钠甲醉溶液皂化,使其中的虾青素酯转化成游离态的 虾青素，经C反相液相色谱柱分离后,用配有紫外检测器的液相色谱仪测定,外标法定量 试剂 所用试剂除另有规定外均为色谱纯 4.1试验用水应符合GB/T6682中一级水的要求 4.2丙酮 4.3磷酸;优级纯 4.4氢氧化钠优级纯 4.5甲醇 4.6二氯甲婉 4.7叔丁基甲基酥 4.82,6-二叔丁基对甲酚;化学纯 4.91%磷酸溶液(体积分数);量取10ml磷酸(4.3)和990mL水,混匀后备用 4.10二氧甲婉-甲醉溶液;量取250ml二氧甲烧和750mL甲醉,加人0.5g2.6二叔丁基对甲盼 4.8),混匀后备用 4.110.1mol/儿氢氧化钠-甲醉溶液;称取0.4g氢氧化钠(4.4),用甲醉溶解并稀释至100mL,混匀后 备用 4.122%磷酸-甲醇溶液(体积分数):量取2mL磷酸(4.3)和98mL甲醇,混匀后备用 4.13全反式虾青素、13-顺虾青素,9-顺虾青素标准品;纯度>95% 4.14全反式虾青素标准储备溶液;准确称取全反式虾青素标准品约10mg,用丙酮溶解并定容于 500mL容量瓶中,此溶液浓度为20g/mL,充氮密封,置一18C冰箱中避光保存,有效期1个月
GB/I31520一2015 S 4.1513-顺虾青素标准储备溶液:准确称取13-顺虾青素标准品约1mg,用丙酮溶解并定容于50 m 容量瓶中,此溶液浓度为204g/ml,充氮密封,置一18C冰箱中避光保存,有效期1个月 4.169-顺虾青素标准储备溶液;准确称取9-顺虾青素标准品约1mg,用丙酮溶解并定容于50ml.容 量瓶中,此溶液浓度为20g/mL,充氮密封,置一18笔冰箱中避光保存,有效期1个月 4.17全反式虾青素标准工作溶液;准确移取适量全反式虾青素标准储备溶液(4.l4)用丙酮稀释成浓 度分别为0.1g/mL,0.54g/ml、1.0g/mL、2.04g/mL,5.04g/mL、10.04g/ml.的标准工作液,现 配现用 4.1813-顺虾青素标准工作溶液;准确移取13-顺虾青素标准储备溶液(4.15),用丙酮配制成适当浓度 的标准工作液,用于定性,现配现用 4.199-顺虾青素标准工作溶液;准确移取9-顺虾青素标准储备溶液(4.16),用丙酮配制成适当浓度的 标准工作液.用于定性,现配现用 仪器 5.1高效液相色谱仪;配紫外检测器 5.2分析天平;感量0.000.01g.0.000l甚各一台 5.3超声波清洗机 5.4冷冻离心机:8000r/min 5.5旋涡混合器 5.6氮吹仪 5.7具塞聚丙烯离心管.50mL 5.8棕色容量瓶:50ml 5.9棕色比色管:10mL 5.10玻璃匀浆器:10mL 测定步骤 6.1提取 准确称取雨生红球藻粉50mg100mg(精确到0.1mg),置于干燥的玻璃匀浆器中,加人1mL二 氯甲婉-甲醇溶液(4.10)充分研磨使细胞壁破碎完全,转移至50mL离心管中,用10mL二氯甲烧-甲醇 溶液(4.10)分3次清洗玻璃匀浆器,合并提取液 超声提取5min,5C下8000r/min离心5min,将上 清液转移至50m容量瓶中,离心管中再加人10ml二氯甲烧-甲醇溶液(4.10),重复上述步骤3次以 上,直到抛取后的藻渣为白色合并上请液,用二氧甲烧-甲醉溶液(4.10)定容至50mL..然后静置 15 min 准确移取5ml.上清液于另一50ml.容量瓶中,用二氧甲烧-甲醇溶液(4.10)稀释并定容,备用 注，虾青素含量高于2%的雨生红球藻粉的称样量不大于50mg 6.2皂化 从上述容量瓶中准确移取5mL溶液于10mL比色管中,加人0.7mL氢氧化钠-甲醇溶液(4.11). 涡旋混合,充氮密封,在5C冰箱中反应过夜12h~14h 然后在反应液中加人0.4ml.2%磷酸-甲醉 溶液(4.12)中和剩余的碱,混匀,在氮气吹扫下定容至5mL,过0.454m滤膜,滤液作为试样溶液 注;若试样溶液的色谱图中,在20min一30min的出峰处存在杂峰,将加碱量提高一倍后重新取提取液皂化
GB/T31520一2015 6.3测定 6.3.1色谱条件 6.3.1.1色谱柱:C色谱柱,250mm×4.6mm,5am,或相当者 6.3.1.2柱温;25 6.3.1.3检测器;检测波长为474nm. 6.3.1.4进样量;20l 6.3.1.5流速:1.0ml/min 6.3.1.6流动相;梯度洗脱程序见表1 表1流动相梯度洗脱程序 时间/nin A/% B/% C/% 81 15 66 15 30 23 16 80 心 16 80 81 15 30 35 81 15 注，A为甲醉,B为叔丁基甲基腿,C为1%磷酸溶液 6.3.2定性方法 分别注人20L适当浓度的全反式虾青素标准工作液(4.17),13-顺虾青素标准工作液(4.18),9-顺 虾青素标准工作液(4.19)及试样溶液(6.2),按6.3.1列出的色谱条件进行液相色谱分析测定,根据标准 工作液色谱图中三种虾青素同分异构体组分的保留时间定性 标准品色谱图参见附录A 6.3.3定量方法 根据试样溶液中虾青素的含量情况,选定峰面积相近的全反式虾青素的标准工作液单点定量或多 点校准定量,试样测定结果以三种虾青素同分异构体的总和计,外标法定量,同时标淮工作液和样液的 响应值均应在仪器检测的线性范围之内 结果计算 试样中虾青素的含量(X)以质量分数计(%),按式(1)计算,保留3位有效数字 1.3×A A一十A十1.1×A×C,×V×10 X (1 ×f×100% A、×m 式中: X 样品中虾青素的含量,%;
GB/I31520一2015 1.3 13-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子; 试样溶液中13-顺虾青素的峰面积 试样溶液中全反式虾青素的峰面积 A 9-顺虾青素对全反式虾青素的校正因子; .1 试样溶液中9-顺虾青素的峰面积; C 标准工作液中全反式虾青素的含量,单位为微克每毫升("g/mL) V 试样溶液体积,单位为毫升(mL); 全反式虾青素标准工作液的峰面积 A 样品质量,单位为毫克(mg); 7 -稀释倍数,为100 方法的灵敏度、准确度和精密度 8.1灵敏度 本方法的定量限为500mg/kg 8.2准确度 用生红球藻中全反式虾青素添加浓度为500mg/kg一00mg/ke时,回收率为90%一10%. 8.3精密度 在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%
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红球藻中虾青素的测定液相色谱法GB/T31520-2015

定义

虾青素是一种天然的强效抗氧化剂，目前已经广泛应用于医药、保健品、食品等领域。红球藻是一种富含虾青素的微藻，因此研究红球藻中虾青素的测定方法对于开发和利用红球藻的资源具有重要意义。GB/T31520-2015是我国红球藻中虾青素测定液相色谱法的标准，旨在规范红球藻中虾青素的测定方法。

测定原理

GB/T31520-2015测定红球藻中虾青素的原理是使用高效液相色谱法，采用C18柱分离，以乙腈-水为流动相，在254 nm处检测虾青素的吸收峰，并根据峰面积计算出虾青素的含量。

仪器设备

GB/T31520-2015规定的仪器设备主要包括：高效液相色谱系统、色谱柱、紫外检测器、样品处理仪器等。

操作步骤

GB/T31520-2015规定的操作步骤主要包括：样品的制备、色谱条件的设定、峰面积计算方法及结果的考核等。

1. 样品的制备

将红球藻样品破碎，加入甲醇中超声提取，过滤后取上清液，再经过固相萃取柱处理，最后乙醇洗脱得到待测样品溶液。

2. 色谱条件的设定

根据GB/T31520-2015的要求，确定使用的色谱柱、流动相组成和梯度条件、检测波长等参数。同时，需要对仪器进行校准和检验，以保证测试结果的准确性。

3. 峰面积计算方法及结果的考核

将待测样品溶液注入色谱系统，得到某一峰的吸光度值，根据标准曲线计算出虾青素的浓度。通过对多个样品进行测试，计算出样品中虾青素的平均含量，并进行数据处理和考核。

结论

GB/T31520-2015规定了红球藻中虾青素测定的液相色谱法，具有简单、准确、重复性好等特点，可以被广泛应用于红球藻资源的开发和利用，对于提高我国虾青素产业的发展水平具有重要意义。

总结

红球藻中虾青素的测定液相色谱法GB/T31520-2015是一种简单、准确、重复性好的分析方法，可以被广泛应用于红球藻资源的开发和利用。在今后的研究和生产过程中，应当严格按照国家标准进行操作，以保证测试结果的准确性和可靠性。

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