番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

番茄斑萎病毒检疫鉴定方法

国家标准 GB/T31802一2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 DetectioandidentificationofTomnatospottedwilvirus 2015-07-03发布 2015-11-20实施 中毕人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中 国国家标准化管厘委员会国家标准
GB/T31802一2015 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口 本标准起草单位;检验检疫科学研究院、辽宁出人境检验检疫局 本标准主要起草人;李桂芬、鲁洁、马洁、孔君、王秀芬、杜智欣、张永江、魏梅生
GB/T31802一2015 番茄斑萎病毒检疫鉴定方法 范围 本标准规定了植物检疫中番茄斑萎病毒的检疫鉴定方法 本标准适用于植物种子、苗木等繁殖材料中番茄斑萎病毒的检疫鉴定 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样 仪器设备及试剂 3.1仪器设备 酶标仪、天平(感量1/10000g,pH计、微量榨汁机、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、 凝胶成像系统、,隔离温室、恒温水浴、低温冰箱等 微量移液器(2L,10AL,20AL,100L,200AL,1000L)、酶联板、研钵、离心管、花盆、灭菌 土等 3.2试剂 酶联免疫吸附测定试剂见附录B,RT-PCR检测试剂见附录C,实时荧光RT-PCR检测试剂见 附录D，生物学测定试剂参见附录E 抽样与样品制备 4.1抽样 抽样按照SN/T2122的规定进行 4.2种子样品制备 将种子(重点挑取畸形不成熟的种子)播于灭菌土中,于25C生长并进行症状观察 待长出3片 4片叶后,将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为一组)并编号 采集叶片用于酶联免疫 测定、RT-PCR检测、实时荧光RT-PCR检测及生物学测定 4.3苗木样品制备 将苗木种植于隔离温室中,于25C生长并进行症状观察 有症状的苗木单独检测 没有症状的分 组检测,分组方法和检测方法同4.2
GB/T31802一2015 检疫鉴定方法 5.1酶联免疫吸附测定 见附录B 5.2RI-PCR检测 见附录C 5.3实时荧光RT-PCR检测 见附录D. 5.4 生物学测定 参见附录E 结果判定 样晶经酶联免疫吸附测定为阴性或RT-PCR检测为阴性或实时荧光RT-PCR检测为阴性,判断待 检样品不携带番茄斑萎病毒 样品经酶联免疫吸附测定为阳性,RT-PCR检测或实时荧光RT-PCR检测为阳性,即可判断待检 样品携带番茄斑萎病毒 必要时可进行生物学测定 样品保存与结果记录 7.1 样品保存 经检测确定携带番茄斑萎病毒的样品应在合适的条件下保存,种子可在4C保存1年,病株可在 20C或一80C冰箱中保存1年,做好标记和登记工作 7.2结果记录 完整的记录包括,样品的来源,种类,时间,实验的时间、地点、方达和结果等,并应有经手人和实验 人员的签字 酶联测定应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测需有电泳结果图片,实时荧光 RT-PCR应有反应原始数据,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片
GB/T31802一2015 附录A 资料性附录 番茄斑萎病毒相关资料 A.1背景资料 A.1.1基本信息 番茄斑萎病毒学名:Tomatosotleltwilirs,缩写:TswV 分类地位;布尼亚病毒科(Bunyaoiridae),番茄斑萎病毒属(Tospooirus A.1.2方法原理 根据番茄斑萎病毒与抗体之间的特异性反应,对植物样品进行ELISA检测;根据该病毒核酸的序 列进行CR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定;根据该病毒核酸的序列设计特异性引物和 荧光探针,通过检测的荧光信号进行结果判定 条件允许的情况下,根据番茄斑萎病毒侵染寄主的症状 特点,进行生物学检测 A.2寄主范围 晋茄斑萎病毒寄主范围非常广泛,包括温带,亚热带和热带的80多个科近千种双子叶和单子叶植 物,可引起许多重要的园艺植物和农作物的严重病害,如花生、莴苣、番木瓜,豌豆、烟草、甜椒、番茄、 秋海棠、菊花、大丽花等 A.3病害症状 番茄斑萎病毒侵染不同的寄主及农作物后所产生的症状各不相同,常见症状为叶片上产生黄色或 褐色的环斑或线纹斑,有的叶片上形成坏死斑,在叶柄和茎秆上产生黑色条纹 发病植株通常矮化或顶 枯,有的萎蔫而最终死亡 A.4分布 番茄斑萎病毒是一种分布广泛且具有经济重要性的植物病毒,分布于欧洲和地中海地区,亚洲、 非洲北美洲、中美洲和加勒比海、南美洲和大洋洲 A.5传播方式 番茄斑萎病毒容易通过介体蓟马以持久性方式进行自然传播,机械接种和嫁接也可传播,还可 以随寄主植物种子,苗木等进行国际间传播,特别是这些寄主带有传毒介体时更容易传播该病毒 A.6粒体形态 病毒粒子球形表面有一层膜包裹,膜外面由厚5nmm、几乎连续的突起层组成,粒体直径80nm120nmm
GB/T31802一2015 A.7基因组特征 三分体基因组,基因组总长为16600nt ssRNA-1长8897nt,为负义;ssRNA-M长4821nt,为 双义;ssRNA-S长2916nt,为双义
GB/T31802?2015 ?B 淶?? ??? B.1? B.1.1 ????塣 B.1.2?? ??????塣 B.1.3 (pNPP B.1.4?(pH9.6) ?(Na.,CO. .59g ?(NaHco.) 2.93g 0.20 (NaN) 8 ?1L,4C档 B.1.5PBST?(pH7.4 ?(NaCD 8.0g (KH,PO 0.2g (Na,HPO. 1.15g ?(KCl 0.2 8 -20(Tween-20 0.5mL 0.2 (NaN g ??1L B.1.6???(pH7.4) PBST (NaeSO. 1.3g PVP(Mw24000~40000) 20.0g (NaN, 0,20g 4C档 ????(pt7. B.1.7 PBST BSA(??? 2.0g
GB/T31802一2015 PVP(Mw24000一40000) 20.0g 叠氮钠(NaN,) 0.2g 4C储存 B.1.8底物缓冲液pH9.8) 乙醉胺 97mL 氧化镁(MgCl 0.1 0.2 叠氮钠(NaN,) g 溶于800ml蒸僧水中,用盐酸调pH至9.8,然后用蒸憎水定容至1L 4C储存 B.2试验步骤 B.2.1包被抗体 按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体,每孔加100L 酶联板加盖或用保鲜膜 包好,放在37C孵育2h 清空孔中溶液,用PBST加满各孔,3min后倒掉孔中溶液,在吸水纸上拍 干 再重复2次上述洗板过程 B.2.2样品制备和加样 待测样品按1;10(质量;体积)加人抽提缓冲液,在研钵中研磨,2000r/min离心10min,上清液 即为制备好的检测样品 阴性对照、阳性对照作相应处理或按说明书进行 向酶联板中加人制备好的 检测样品、阴性对照、阳性对照,100aL/孔,酶联板加盖或用保鲜膜包好,放在4C孵育过夜 酶联板用 自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次3min B.2.3加酶标抗体 用酶标抗体稀释缓冲液,按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,加人到酶联板中,100L/孔,酶联板 加盖或用保鲜膜包好,放在37C孵育4h 酶联板用自来水彻底冲洗,再用PBST洗涤3次,每次 3 min B.2.4加底物 将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100AL/孔加人到酶联板中 室温避光孵育 B.2.5读数 在不同的时间内如30min,60min,90min、120min或更长时间,用酶联仪在405nm处读OD值 B.3结果判定 对照孔的OD值(缓冲液孔、阴性对照孔及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即缓冲液孔和 阴性对照孔的OD值<0.15,当阴性对照孔的OD值<0.05时,按0.05计算;阳性对照OD值/阴 性对照oD值>5;同一样品的重复性基本一致 在满足了上述的质量要求后,结果原则上可判断如下;样品OD值/阴性对照OD值明显>2,判 为阳性;样品OD值/阴性对照OD值在2左右时,判为可疑样品,需重新做一次,或用其他方法加以 验证;样品OD值/阴性对照oD值明显<2,判为阴性 若满足不了上述的质量要求,则不能进行结果判断
GB/T31802一2015 附 录c 规范性附录 Rr-CR检测 c.1试剂 c.1.1试剂 核酸提取试剂为TRlzol试剂 C.1.2TAE缓冲液 40mmol/LTris-HIAc; mmol/LEDTA，pH8.0. c.1.36×加样缓冲液 0.25%酚蓝 40%(质量分数)蔗糖水溶液 c.1.4引物序列 所扩增的序列片段来自TSwV的NP基因(GeneBankAccessionNo.JQ692106.1),长度为441bp 引物序列如下 TswV-F;5'-AGGATTGGAGCCACTGAC-3'位置226nt243nt) TswV-R:5'-GCcTGGAGCTGAGTATAGcAG-3'位置647nt一666nt) 试验步骤 C.2.1总RNA提取 取0.lg样品,液氮研磨成粉末状,加人1mlTRIzol试剂,混匀,倒人1.5mL离心管中 在4以 12000r/min离心5nmin,将上清液移人一新离心管中 加人0.2mL三氧甲烧,剧烈振荡15s,在4 " 以12000r/min离心15min 小心吸取上层无色水相到新离心管中,加人等体积预冷异丙醉,颠倒混 匀,一20C静置10min 在4C以12000r/min离心10min,倒掉上清液,保留沉淀 加人1mL70% 预冷乙醇,悬浮沉淀,在4以12000r/nmin离心10min 倒掉乙醇,待沉淀充分干燥后,加人20aL DEPC水溶解沉淀,存于一80C备用 反转录反应 C.2.2 按表C.1配制反转录反应体系20L. 反转录反应条件为;2510min,50C30min,85C 5min
GB/T31802一2015 表c.1反转录反应体系 名称 储存液浓度 加样量/al 终浓度 2 反应缓冲液 10.0 RandomPrimer 0.1lg/l 1.0 0.0054g/al 模板 RNA 3,0 反转录酶 20X 1.0 补水至 20.0 C.2.3CR扩增 按表C.2配制PCR反应体系20AL 反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积 进行适当调整 检测时以含TswV的植物材料的DNA或含有TSwV目标片段的质粒作为阳性对 照,以健眼植物材料作为阴性对照,以水代替DNA模板作为空白对照 PCR反应条件;94C5min;9430s，5330s，7230s,35个循环;72C5min延伸 表C.2PCR反应体系 名称 储存液浓度 加样量/pl 终浓度 PCR缓冲液 10X 2.0 dNTP 10mmol/ 1.0 0.5mmol/ 上游引物 20amol/L 0.4 0.4amol/L 0.4amol/儿L 下游引物 20Mmol/I 0,4 Tag 酶 5U/al 0.2 0.05U/pl DNA 模板 2.0 补水至 20.0 C.2.4琼脂糖凝胶电泳检测 用1×TAE配制1%琼脂糖凝胶,加热溶化后冷却至55C左右 将凝胶倒人凝胶槽中,插上样品 梳子 冷却凝固后拔掉梳子,在电泳槽内加人1×TAE,缓冲液要没过凝胶表面约1" mm 将加样缓冲液与样品混合后加人样品孔,同时设计PCR的阴性对照和阳性对照,并加人DNA相 对分子质量标准物 接通电源,以3V/cm一5V/em电场强度进行电泳,0.5h后观察结果 min15min 将整个凝胶 电泳结束后,将凝胶放人0.54g/mL的嗅化乙锭(EB)染色液中染色10 置于凝胶成像系统上观察,记录结果 C.3结果判定 如果阳性对照出现约441bp的条带,检测样品、阴性对照和空白对照未出现条带,可判定样品为 阴性 如果阳性对照及检测样品出现约441bp的条带,阴性对照和空白对照未出现条带,可判定样品为 阳性
GB/T31802一2015 附录D 规范性附录 实时荧光RT-CR检测方法 D.1试剂 D.1.1RNA提取试剂 TRIzol试剂、三氯甲炕、异丙醇、70%乙醇 D.1.2试剂 TaqManOne-StepRT-PCRMixture. D.1.3引物和探针 所扩增的序列片段来自TswV的NP基因(GeneBankAc ccessionNo.JQ692106.1),引物和探针序 列如下 引物序列:TSwV-F:5'-CTCTTGATGATGCAAAGTCTGTGA-3'位置398nt421nt) TSwV-R:5'-TCTCAAAGCTATCAACTGAAGCAATAA-3'位置455nt481nt 探针序列:TSwV-P:5'-FAM-AGGTAAGCTACCTCCCAGCATTATGGCAAGBHQ1-3 位置424nt453nt D.2试验步骤 D.2.1 总RNA提取 操作方法见C.2.1 D.2.2实时荧光RT-PCR反应 实时荧光RT-PCR反应体系见表D.l 检测时以含TSwV的植物材料的RNA作为阳性对照;以 健康植物材料作为阴性对照;以水代替RNA模板作为空白对照 表D.1实时荧光RT-CR反应体系 贮备液浓度 加样量/a 终浓度 名 称 12.5 RT-PCR缓冲液 TswV-F 0.5 20umol/I 0.4wmalL TSwV-R 204mol/ 0.5 0.4Amol/儿 TSwV-P 10Amol/1 0.5 0.2继mol/I RNA模板 2.0 RT-PCREnzymeMix 25× 1.0 补水至 25.0
GB/T31802一2015 反应条件:48C30nmin,95C10min;然后95C15s,60C1min,共40个循环 点击运行,进行 PCR反应,保存文件,打开分析软件,仪器自动分析试验结果,给出AR,(荧光信号增加值)与循环数之 间关系的图像 D.3结果判定 在阳性对照Ct值小于30,水空白对照C值大于或等于40的条件下若不满足该两项条件,此次 检测无效,应重做荧光PCR扩增: 待测样品的Ct值等于40时,则判定样品为阴性 a b)待测样品的Ct值小于或等于35时,则判定样品为阳性 待测样品的Ct值大于35而小于40时,应重新进行测试,如果重新测试的Ct值等于40时,则 判定样品为阴性 如果重新测试的Ct值小于40时,则判定样品为阳性 l0
GB/T31802一2015 附 录 资料性附录 生物学测定 E.1试材 E.1.1鉴别寄主 黄瓜(Cucumis 2nacleelandli、心叶烟 sativus)、矮牵牛(Petuniahyorida、克利夫兰烟(Nicotian Nicotianagluwtinosa、普通烟(Nicotianatabacumn),黄花烟(Nicotianarustica),曼陀罗(Daturastra- monium),番茄(Lycopersicone.sculentum),本生烟(Nicotianabenthamiana). E.1.2试剂 含0.001mol/几LEDTA(乙二胺四乙酸二钠). 接种缓冲液.0.05mol儿确酸盐缓冲液(oH7.0, 0.005mol/儿LDIECA(二乙基二硫代氮基甲酸钠),0.1%硫基乙醉(使用时加人 E.2方法 E.2.1机械接种方法 E.2.1.1研磨 病样加1:5(质量:体积)的磷酸盐缓冲液,在研钵中研碎 研碎后放人硅藻土或金刚砂,浓度为 0.5%,与病汁液混匀 E.2.1.2接种 用手将病汁液轻轻涂抹于鉴别寄主叶表面 E.2.1.3冲洗 用自来水冲洗叶表面 E.2.2蓟马自然传播 在具有隔离的条件下,可采用蓟马进行自然传播 E.2.3观察 每天观察记载寄主反应,连续观察1个月 E.3鉴别寄主症状 E.3.1黄瓜;子叶上表现有坏死中心的褪绿斑,无系统侵染 E.3.2矮牵牛;局部坏死斑 E.3.3克利夫兰烟、心叶烟、普通烟、黄花烟:局部坏死斑,系统坏死症状和叶畸形
GB/T31802?2015 E.3.4;????,????? ;????,???.???? E.3.5 E.3.6;?????,??,Ρ

番茄斑萎病毒检疫鉴定方法GB/T31802-2015

GB/T31802-2015《番茄斑萎病毒检疫鉴定方法》是中国规定的针对番茄斑萎病毒进行检验鉴定的标准。该标准适用于进出口、转口植物及其制品中番茄斑萎病毒的检验鉴定。

检测番茄斑萎病毒的方法主要有两种，分别为检测病原体核酸和检测抗原。其中，检测病原体核酸是一种比较敏感的方法，能够检测到非常微小的番茄斑萎病毒，因此被广泛应用于番茄斑萎病毒的检验鉴定。

按照GB/T31802-2015标准规定，番茄斑萎病毒的检验鉴定需要进行样品采集、提取核酸、荧光PCR检测或ELISA检测和结果判定四个步骤。

第一步是样品采集。样品采集时，应该选择健康、无病害痕迹的植株作为被检物。采样应该在全批货物中随机取样，并且每份样品的数量不应少于3个。

第二步是提取核酸。对于经过样品采集后得到的样品，需要将其加入适当的缓冲液中，进行核酸的提取工作。核酸的提取应该在洁净的实验室环境下进行，以避免污染。

第三步是荧光PCR检测或ELISA检测。可以采用荧光PCR检测或ELISA检测的方法进行番茄斑萎病毒的检测。其中，荧光PCR检测是一种具有高度特异性和灵敏度的方法，能够快速准确地检测出番茄斑萎病毒。

第四步是结果判定。根据检测结果，可以判断所检样品是否存在番茄斑萎病毒。如果检测出番茄斑萎病毒，则需要采取相应的措施，如进行隔离、消毒等，以防止病害的进一步传播。

总之，GB/T31802-2015标准详细规定了番茄斑萎病毒检验鉴定的方法和步骤，对于保障我国农业生产和贸易安全起到了至关重要的作用。同时，也为我国农业出口企业提供了强有力的技术支持，使其能够更好地开展进出口贸易。

番茄斑萎病毒检疫鉴定方法的相关资料

和番茄斑萎病毒检疫鉴定方法类似的标准

GB/T28982-2012

番茄斑萎病毒PCR检测方法

2022/10/24 1:54:40 现行

GB/T31802-2015

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2022/10/25 4:25:25 现行