GB/T28084-2011
棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定
DetectionandidentificationofVerticilliumdahliaeKleb.
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2012-06-01
- 文件格式PDF
- 文本页数10页
- 文件大小361.78KB
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棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定
国家标准 GB/T28084一2011 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定 DetectionandidentificationofVerticiliumdahliaeKeb. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 国家质量监督检监检疫总局 发布 国家标准花管理委员会国家标准
GB/T28084一2011 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草
本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口
本标淮起草单位;全国农业技术推广服务中心,河南省植保植检站、四川省植物检疫站 本标准主要起草人:吴立峰、韩世平、宁红、白小东,刘辉志、李素芳、熊红利、张磊
GB/T28084一2011 棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定 范围 本标准规定了棉花黄萎病田间症状识别,抽样,棉花黄萎病菌(VerlieiiumdahliaeKIleb.)的分离 培养、检测鉴定等方法
本标准适用于棉花植物组织和棉籽中棉花黄萎病菌的检疫检测和鉴定
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB15569农业植物调运检疫规程 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
微菌核nmicroselerotium 棉花黄萎病菌生长过程中,由一条或数条分隔菌丝体膨大、胞壁增厚,并向各个方向芽殖形成的肉 眼可见的黑色菌丝颗粒
3.2 选择性培养基seleetiemedium 进行植物病原菌分离培养时,为促进目标菌落的形成,抑制其他非目标菌的生长,在培养基中添加 不同的碳源,氮源或抑制性物质而形成的具有一定选择能力的培养基
原理 棉花黄萎病菌主要存在于棉花植株、棉籽、土壤、病残组织,粪肥等处侵染棉花植株后所表现的典 型症状是田间诊断的重要依据;利用选择性培养基,从不同的带菌材料中分离出目标病原菌,进行形态 特征鉴定
仪器、用具及试剂 5.1仪器、用具 天平,高压灭菌锅.培养箱,生物显微镜、移液器、银子,解剖刀,接种棒,.9cm一12cm培养、烧杯 载玻片,盖玻片,吸管,超净工作台等
5.2试剂 除非另有说明,本标准仅使用分析纯试剂
GB/r28084一2011 .2.1磷酸氢二钾(K
HPO. 5 5.2.2氯化钾(KCl. 5.2.3硫酸镁(MgsO.. 5 .2.41-天门冬酰胺(CH,N.O,H,O). 5.2.5 乙 二胺四乙酸铁钠[CHN(CH.cOO)]FeNa}
52.
L山草糖C.o, 5.2.7琼脂
5 .2.875%五氧硝基苯(C,Cl,NO.. 5.2.9牛胆盐
5.2.10四砌酸销(NaBO10H.,O. .2.11硫酸链霉素(CHN,O.S)
5 5.2.12葡萄糖(C,HO,H.O). 5.2.130.1%升汞
5.2.1470%乙醇
5.2.15马铃薯
5.2.16灭菌水
症状识别 在棉花黄萎病显症明显的花铃期和吐絮期进行2次3次调查
每次调查时,首先目视全田,若观 察不到可疑病株,则进行踏查,方法是每隔两行顺垄检查有无可疑病株
对检查到的可疑病株,参照附 录A进行识别判断,确认是否是棉花黄萎病,并采集、保存病株标本,记录调查结果
现场不能确认的 整株取样带回实验室鉴定,填写附录B有害生物调查抽样记录表》
病原鉴定 7.1抽样 7.1.1棉籽抽样 需要进行室内棉花黄萎病菌检测的棉籽,按照GB15569的有关要求进行抽样,填写附录B(有害生 物调查抽样记录表》,送实验室检验鉴定
7.1.2受害植株抽样 在棉花生长期间,特别是棉花黄萎病发病高峰期,加强田间观察,发现有棉花黄萎病疑似症状的植 株,整株取样送实验室检测
填写附录B有害生物调查抽样记录表》
7.2分离和培养 7.2.1制样 7.2.1.1棉籽 将送检的每个棉籽样品分为2份，一份保存备查，一份用于检验,每份样品不少于50g
7.2.1.2植物组织 选取有疑似症状的植株材料:叶片材料取病健交界处组织,每个约0.5cm;茎杆、叶柄材料直接切
GB/T28084一2011 取维管束变色部分组织,每个长约0.5e cm
7.2.2消毒与培养 7.2.2.1棉籽 将棉籽放人70%乙醉中浸泡2s~3s,除去气泡,置于0.1%升汞液中消毒2min,用灭菌水冲洗 2次一3次
然后用灭菌错子将其移放到Christen选择性培养基平板上,每个平板放置5粒,每个样品 设3个重复,置于1一25C的培养箱内3d一1d然后放人冰箱冷处理oC-5,2),再放回原 培养箱内黑略培养10d n选择性培养基配方及制作方法参见附录C. Christen 7.2.2.2 植物组织 将取得的植物组织置于0.1%升汞液中表面消毒1min,用灭菌水冲洗2次3次,然后置于Chris ten选择性培养基平板上,每个平板放置3个一5个,每个样品设3个重复
置于2425C培养箱内 黑暗培养10d
7.2.3分离纯化 检查培养10d后的平板,若出现乳白色菌落,将其转接至PDA培养基上,并在24C一25C黑暗培 养10d. PDA培养基配方及制作方法参见附录c
7.2.4形态鉴定 观察微菌核的形成情况,并挑取PDA平板上的培养物进行显微镜检查,参照附录D描述的病原菌 形态特征进行鉴定
7.3结果判定 转接至PDA平板上的培养物培养10d后,在显微镜下观察其形态特征,符合附录D描述的形态特 征的,确定为棉花黄萎病菌VerticiiumdahliaeKIeb.
鉴定结果填人《有害生物样本鉴定报告参见 附录E). 标本及资料保存 检测鉴定完成后,样品和分离物需作为标本保存的,制成标本并妥善保存1年
其余用于检测的样 品应集中销毁,用具应进行灭活处理
检测鉴定过程及有关数据、表格要进行详细记录并归档保存
GB/r28084?2011 ?A ?? ???λΣ?? A.1λ ??(VerticiliumdahliaeKeb.)?(Deuteromycotina),??(Hyphomy cetes),??(Moniliales),?(Moniliaceae),?(Verticilium). A.2Σ?? A.2.1?? 3?5?????,??,?????,??е? A.2.2?? ????,???塣???, ??,??????????,?,????, ?,?,??,?????,???,? ?;????,??,??????,?? ????,?????????,??,??,???γ??? ?лв???,???
GB/T28084一2011 B 附 录 资料性附录 有害生物调查抽样记录表 表B.1有害生物调查抽样记录表 编号 地址及邮编 生产/经营者 联系电话 联系/负责人 调查日期 抽样地点 样品 调查代表 植物名称(中文名和学名 品种名称 植物生育期 植物来源 编号 株数或面积 症状描述 发生与防控情况及原因; 抽样方法,部位和抽样比例 备注: 抽样单位盖章). 生产/经营者 填表人签名): 现场负责人: $ 月 月 日 年 注:本单一式两份,分别由抽样单位和受检单位保存
GB/r28084一2011 c 附 录 资料性附录 培养基配方及制作方法 C.1Christen选择性培养基配方及制作方法 C.1.1配方 磷酸氢二钾1g,氯化钾0.5g,硫酸镁0.5g,乙二胺四乙酸铁钠0.01g,l-天门冬酰胺2g,l-山梨糖 2g,琼脂20g,蒸僧水1000mL,75%五氯硝基苯1g,牛胆盐0.5g,四碉酸钠1g,硫酸链霉素0.3g
C.1.2制作方法 琼脂20g加人蒸僧水1000mL,加热溶化后,加人磷酸氢二钾lg,氧化钾0.5g,硫酸镁0.5g,乙二 胺四乙酸铁钠0.01g,L-天门冬酰胺2g,L-山梨糖2g,充分混和溶解
用磷酸将pH值调至5.4,分装， 120~125高压灭菌30min,温度降至50C(不烫手)时,在灭菌条件下加人75%五氯硝基苯1g、牛 胆盐0.5g,四棚酸钠1g,硫酸链霉素0.3g,混和均匀
C.2PDA培养基配方及制作方法 C.2.1配方 马铃薯200g,葡萄糖15g~20g,琼脂17g一20g,水1000ml. C.2.2制作方法 将洗净去皮的马铃薯切碎,加水1000mL煮沸1h,用纱布滤去马铃薯,加水补足1000mL;加人葡 萄糖和琼脂,加热使琼脂完全熔化后,分装,120~125C高压灭菌30min
GB/T28084一2011 附 录D 资料性附录 棉花黄萎病菌在PDA培养基上的形态特征 D.1棉花黄萎病菌形态特征 菌落呈绒毛状,初生菌丝体无色,生长时间较长的菌丝变成灰白色,有隔膜
培养10d以上的菌落 可在培养基上长出大量黑褐色微菌核,长形至不规则球形,直径15m一50Am
分生袍子梗由2轮~ 4轮层辐射状的枝梗及上部的顶枝构成,每轮层有枝1枝一7枝,分枝大小为(13.7m21.4Am)× 1.54m~2.7Am),基部略膨大,始终透明
小枝顶端的产抱瓶体连续产生分生抱子,分生抱子无色， 单抱,椭圆形、近圆筒形,大小为(1.9Am3.57am)X(2.5m7.38m). D.2棉花黄萎病菌与黑白轮枝菌形态特征比较 iumalbo-atrumReinke&
Berthin 棉花黄萎病菌与黑白轮枝菌Verhieilin iner为同属土传病原真菌， 两种病原菌形态特征主要区别见表D.1
表D.1棉花黄萎病菌与黑白轮枝菌形态特征比较 pH3.6条件下 30C条件下 病原菌 菌落形态 分生抱子梗 休眠结构 生长状况 生长状况 绒毛状,圆形 棉花黄萎病菌 微菌核,黑褐色 生长良好 生长良好 较短,基部透明 白色 绒毛状，圆形 黑褐色厚壁休 较粗壮，基部 黑白轮枝菌 生长不良 不能生长 白色至黑褐色 暗色、膨大 眠菌丝结
GB/T28084一2011 附录 E 资料性附录 有害生物样本鉴定报告 表E.1有害生物样本鉴定报告 植物名称 品种名称 植物生育期 样品数量 取样部位 样品来源 送检日期 送检人 送检单位 联系电话 检测鉴定方法 检测鉴定结果: 备注" 鉴定人(签名) 审核人签名): 鉴定单位盖章 年 月 日 注:本单一式三份,分别由抽样单位、受检单位和鉴定单位保存
棉花黄萎病菌检疫检测与鉴定GB/T28084-2011
该标准主要包括以下方面：
- 样品采集和保存：根据实际情况选取叶片、茎等部位进行采样，并注意保存条件和方法。
- 病原体分离和纯化：通过对样品进行分离纯化和生理生化特性鉴定，确定是否存在棉花黄萎病菌。
- 病原体检测：利用PCR技术对样品中的DNA进行检测，以便更加准确地鉴定病原体。
- 检疫标准：根据检测结果判断是否符合检疫标准，以便采取相应的防控措施。
此外，该标准还描述了样品处理、实验室安全、实验记录等方面的要求和注意事项。通过严格按照GB/T28084-2011进行检疫检测和鉴定，可以及时发现和防范棉花黄萎病在不同地区的传播，为保护棉花产业提供重要支持。
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