非洲猪瘟诊断技术

非洲猪瘟诊断技术

国家标准 GB/T18648一2020 代替GB/T186482002 非洲猪瘟诊断技术 DiagnostietechniquesforAfrican Swinefever 2020-12-14发布 2020-12-14实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标涯花管理委员会国家标准
GB/T18648一2020 目 次 前言 范围 2 规范性引用文件 3 缩略语 生物安全措施 临床诊断 5.1易感动物和宿主 5.2临床表现 5.3病理变化 5.4临床诊断结果判定 实验室诊断样品采集及处理 6,1试剂 6.2采样用具 6.3样品采集 6.！样品处理 普通PCR方法 7.1试剂 7.2仪器设备 7.3引物序列 试验程序 7.4 7.5试验成立条件 普通PCR结果判定 荧光PCR方法 8.1试剂 8.2仪器设备 8.3引物和探针 8.4试验程序 8.5试验成立条件 8.6荧光PCR结果判定 荧光RAA方法 9.1试剂 9.2仪器设备 9.3引物
GB/T18648一2020 9.4试验程序 9.5试验成立条件 9.6荧光RAA结果判定 10高敏荧光免疫分析法 10.1试剂 0.2仪器设备 .. ..-- ##* 0.3试验程序 0.4高敏荧光免疫分析结果判定 1 夹心ELISA抗原检测方法 1.1试剂 1.2仪器设备 l1.3试验程序 1l.4试验成立条件 11.5夹心ELISA抗原检测结果判定 12间接ELISA抗体检测方法 12.1试剂 12.2仪器设备 12.3试验程序 10 12.4试验成立条件 12.5间接ELISA抗体检测结果判定 13阻断ELISA抗体检测方法 13.1试剂 12 13.2仪器设备 12 13.3试验程序 12 13.4阻断率计算方法 13 3.5试验成立条件 13 3.6阻断ELISA抗体检测结果判定 13 4夹心ELISA抗体检测方法 l 14.1试剂 13 14.2仪器设备 14 14.3试验程序 15 14.4试验成立条件 15 14.5夹心ELISA抗体检测结果判定 15 15间接免疫荧光方法 15 15.1试剂 16 15.2仪器设备 16 5.3试验程序
GB/T18648一2020 16 15.4试验成立条件 17 15.5间接免疫荧光结果判定 17 16综合判定 18 附录A规范性附录样品保存液的配制方法 19 附录B规范性附录聚合酶链式反应溶液的配制方法 20 附录C规范性附录酶联免疫吸附试验溶液的配制方法
GB/T18648一2020 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准代替GB/T18648一2002《非洲猪瘟诊断技术》,与GB/T18648一2002相比,除编辑性修改 外,主要技术变化如下: -增加了缩略语(见第3章 -增加了生物安全措施(见第4章); -增加了临床诊断(见第5章); -增加了实验室诊断样品采集及处理(见第6章); 增加了荧光PCR方法(见第8章),荧光RAA方法(见第9章),高敏荧光兔免疫分析法(见第10 章),夹心ELISA抗原检测方法(见第11章),阻断ELIsA抗体检测方法(见第13章)夹心 ELISA抗体检测方法(见第14章),间接免疫荧光方法(见第15章)等实验室诊断方法; 增加了综合判定(见第16章) 增加了样品保存液的配制方法(见附录A),聚合酶链式反应溶液的配制方法(见附录) 修改了酶联免疫吸附试验游液的配制方法(见附录c,202年版的附录c. 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 本标准由农业农村部提出 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会(SAc/Tc181)归口 本标准起草单位;动物卫生与流行病学中心 本标准主要起草人;吴晓东,李林、胡永新、樊晓旭、邹艳丽、任炜杰、张永强、戈胜强、王清华、 李金明包静月、赵永刚、徐天刚、李岭、刘珊、蒋正军、王树双、马洪超、王志亮 本标准所代替标准的历次版本发布情况为 GB/T186482002
GB/T18648一2020 非洲猪瘟诊断技术 范围 本标准规定了ASF的临床诊断,实验室诊断样品采集及处理,以及普通PCR方法、荧光PCR方 法、,荧光RAA方法、高敏荧光免疫分析法、夹心ELISA抗原检测方法、间接ELISA抗体检测方法、阻 断ELISA抗体检测方法,夹心ELISA抗体检测方法、间接免疫荧光方法等实验室诊断方法 本标准适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB19489实验室生物安全通用要求 缩略语 下列缩略语适用于本文件 ASF:非洲猪瘟(AfricanSwineFever AsFV;非洲猪瘟病毒(AfricanswineFeverVirus) DEPC;焦碳酸二乙醋(DiethyPyrocarbonate) EDTA乙二胺四乙酸(EthylenediaminetetraaceticAcid) EL.ISA;酶联免疫吸附试验(EnzymeLinkedlmmmunosorbentAssay FAM.6-梭基荧光素(6-Carboxy-Fluorescein) OD;光密度(OpticalDensity PBS;磷酸盐缓冲液(PhosphateBuferedSaline) PCR;聚合酶链式反应(PolymmeraseChainReaction) RAA;重组酶介导的等温核酸扩增技术(RecombinaseAidedAmplification SPF;无特定病原体(SpeeificPathogenFree) TMB;四甲基联苯胺(3,3',5,5'-Tetramethyl-Benzidine' 生物安全措施 进行AsF实验室诊断时,如样品处理、核酸提取等,应按照GB19489执行 临床诊断 5.1易感动物和宿主 猪科动物是ASFV的易感动物 家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感，且表现出相似的临床症状和 死亡率;而非洲野猪,例如扰猪、丛林猪、红河猪和巨林猪,感染ASFV后很少或者不出现临床症状,是
GB/T18648一2020 病毒的储存宿主 5.2临床表现 5.2.1最急性:无明显临床症状突然死亡 5.2.2急性;体温可高达42,沉郁,厌食,耳、四肢、腹部皮肤有出血点,可视黏膜潮红、发绀 眼,鼻 有黏液脓性分泌物;呕吐;便秘,粪便表面有血液和黏液覆盖;或腹泻,粪便带血 共济失调或步态僵直 呼吸困难,病程延长则出现瘫痪,抽搐等其他神经症状 妊娠母猪流产 病死率可达100% 病程 4d10d 5.2.3亚急性:临床症状与急性相同,但病情较轻,病死率较低 体温波动无规律,一般高于40.5C 仔猪病死率较高 病程5d30d 5.2.4慢性;波状热,呼吸困难,湿咳 消瘦或发育迟缓,体弱,毛色暗淡 关节肿胀,皮肤溃疡,跛足 死亡率低 病程2个月到15个月 5.3病理变化 典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血,肾脏、肺脏表面有出血点,心内膜和心外膜有大量出血 点,胃、肠道黏膜弥漫性出血;胆囊,膀胱出血;肺脏肿大,切面流出泡沫性液体,气管内有血性泡沫样黏 液;脾脏肿大,易碎,呈暗红色至黑色,表面有出血点,边缘钝圆,有时出现边缘梗死;颌下淋巴结、腹腔淋 巴结肿大,严重出血 最急性型的个体可能不出现明显的病理变化 5.4临床诊断结果判定 易感动物出现上述临床症状和病理变化,可初步判定为疑似ASF病例 6 实验室诊断样品采集及处理 6.1试剂 6.1.10.1lmol/LPBs(pH7.4),配制方法见附录A的A.1 6.1.20.04mol/LPBs(pH7.4),配制方法见A.2 6.1.350%甘油-PBS保存液,配制方法见A.3 6.1.4青霉素,浓度为10000IU/ml 6.1.5链霉素,浓度为10000g/mL 6.2采样用具 6.2.1器械;解剖刀,剪刀、毁子,骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等 6.2.2容器:真空采血管(含EDTA抗凝剂,离心管(2ml、10mL)、样品保存管等 6.2.3个人防护用具:防护服、防护镜、防护帽,防护靴、口罩、一次性手套等 6.2.4采样记录用品;采样单,记号笔、防水标签等 6.2.5其他:医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等 6.3样品采集 6.3.1口鼻拭子采集 采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品 用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈,采集口 腔、鼻腔的分泌物;蘸取分泌物后,立即将拭子浸人1ml50%甘油-PEBS保存液中,剪去露出部分,盖紧
GB/T18648一2020 离心管盖,密封后冷藏或冷冻保存 6.3.2全血样品采集 在发病猪群中,使用真空采血管含EDTA抗凝剂)采集一定数量发病猪、同群猪全血各5ml,密 封后冷藏或冷冻保存 6.3.3血清样品采集 在每一发病猪群中,采集发病猪,同群猪全血各5mL,室温放置12h一24h,分离血清,装人离心管 中,密封后冷藏或冷冻保存 6.3.4组织样品采集 采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品 首选脾脏,其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等 脾脏、肾 脏采集约3cm×3em大小,扁桃体整体采集,淋巴结选取出血严重的整体采集,骨髓采集长度约3em 将所采集样品放人50%甘油-PBS保存液中 6.4样品处理 6.4.1口、鼻拭子样品处理 口,鼻拭子标记样品编号,立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用 6.4.2全血样品处理 全血标记样品编号,立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用 6.4.3血清样品处理 血清标记样品编号,立即进行ASFV抗体检测或冷冻储存备用 6.4.4组织样品处理 取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨,加人终浓度为1000IU/mL的青霉素、 1000 4g/mL的链霉素,灭菌的0.1mol/儿PBS(pH7.4)制备10%组织匀浆液 2000r/min离心处理 0 min 取上清液,标记编号,立即进行AsSF病原检测或冷冻储存备用 普通PCR方法 7.1试剂 7.1.1DNA提取试剂盒 7.1.2PCR预混液(2×);TaqDNA聚合酶0.05U/AL),反应缓冲液，4mmol/L，MgCl以及 0.4mmol/L的dNTP 7.1.3无核酸酶水,配制方法见附录B的B.1 7.1.4TAE缓冲液,配制方法见B.2和B.3 7.1.52%的琼脂糖凝胶,配制方法见B.4 7.1.6 上样缓冲液 7.2仪器设备 7.2.1自动化核酸提取仪
GB/T18648一2020 7.2.2PCR扩增仪 7.2.3台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上. 7.24稳压稳流电泳仪和水平电泳槽 725凝胶成像仪《或禁外边射仪D." 7.2.6微量可调移液器(2.5L10L.100L.200L、1o00L等不同规格). 727末核般脚离心管与吸头 7.2.8PCR扩增管 7.3引物序列 引物针对ASFVB646L 基因的保守区域设计 上游引物PPA-l:5'-AGTTATGGGAAAC CCGACCC-3';下游引物PPA-2;5'-CCCTGAATCGGAGCATcCCT-3' 扩增产物大小为257bp 7.4试验程序 7.4.1核酸提取 采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病 毒核酸 如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存,否则应置于一20C冰箱保存 每次抽提核酸,应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照 阳性对照样品应为AsFV核酸阳性样 本(血清、全血.10%组织匀浆或细胞培养上清液);阴性对照样品应为无核酸酶水或者AsFV核酸阴性 样本(血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液) 7.4.2核酸扩增 7.4.2.1扩增体系 每个样品配制22aLPCR反应混合液,组成如下 无核酸酶水 7.54L PCR预混液(2× 12.5L PPA-1(10Amol/L) 1l PPA-2(10Mmmol/L) 1L 将22LPCR反应混合液加人每个0,2ml.PCR扩增管;将3LDNA模板加人CR扩增管中 每次进行普通PCR扩增时均应设立阳性,阴性及空白对照 阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作 为模板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板,空白对照应用无核酸酶水作为模板 加人模 板后,密封反应管,瞬时离心 将所有PCR扩增管放在PCR仪中 按7.4.2.2条件运行扩增程序 7.4.2.2扩增条件 95C预变性10min;95C变性15s62C退火30s,72C延伸30s,40个循环;72C终延伸 7min 7.4.2.3PCR扩增产物电泳 将5L的6×上样缓冲液加人PCR产物中,混匀后取8AL 加人到使用1×TAE缓冲液配制的 min40 2%琼脂糖凝胶中,电泳30 min 电泳结束后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果 7.5试验成立条件 阳性对照应有大小为257bp的特异性扩增条带,且阴性对照和空白对照应无任何扩增条带
GB/T18648一2020 7.6普通PCR结果判定 符合7.5的条件,被检样品有大小为257p的特异性扩增条带,且与阳性对照条带分子量大小相 符,则该样品判为ASFV核酸阳性;被检样品无特异性的扩增条带,则判为ASFV核酸阴性 荧光PCR方法 8.1试剂 8.1.1DNA提取试剂盒 8.1.2无核酸酶水,配制方法见B.1 8.1.3荧光PCR预混液(2×). 8.2仪器设备 8.2.1荧光PCR扩增仪 8.2.2台式低温高速离心机(最大离心力12000g以上) 82.3微量可调移液器(25L.0lL.I0L.200lL.I0儿等不同规格》. 8.2.4无核酸酶离心管与吸头 8.2.5PCR扩增管 8.3引物和探针 引物和探针针对AsFV646L基因的保守序列设计 上游引物VP72-F1:5'-GcTTTcAGGAT AGAGATACAGcTcT-3';下游引物VP72-R1:5'-CcGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3'; TaqMan探针VP72-T1;FAM-ccGTAAcTGcTcATGGTATcAATcTTATcG;BHQ1 8.4试验程序 8.4.1核酸提取 方法同7.4.1 8.4.2核酸扩增 8.4.2.1扩增体系 每个样品配制18荧光PCR反应混合液,组成如下 无核酸酶水 5.9L 荧光PCR预混液(2X) 104L VP72-F1(104mol/L) 0.8从L VP72-RI(l0mol/L 0.8l VP72-Tl104mol/L 0.5从L 将18L荧光PCR反应混合液加人PCR扩增管;将2ALDNA模板加人每个PCR扩增管中 每 次进行荧光PCR扩增时均应设阳性、阴性及空白对照 阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模 板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板,空白对照应用无核酸酶水作为模板 加人模板 后,密封PCR扩增管,瞬时离心 将所有PCR扩增管放人荧光PCR仪中 按8.4.2.2运行扩增程序
GB/T18648一2020 8.4.2.2扩增条件 50C孵育2min;95预变性5min;95C变性15s,58C退火延伸1 ,45个循环,在每一循环 min， 的58C时收集FAM荧光信号 8.5试验成立条件 阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线,阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值>40且无特异 性扩增曲线,试验结果有效;否则应重新进行试验 8.6荧光PCR结果判定 符合8.5的条件,被检样品C值<38且出现特异性扩增曲线,则判为AsFV核酸阳性;当无C值 或Ct值>40,则判为ASFV核酸阴性;当38GB/T18648一2020 g.4.2核酸扩增 9.4.2.1 扩增体系 每个样品配制42.5L荧光RAA反应混合液,组成如下: RAA预混液 7.7L VP72-F2(10pmoal/L) 2.1L VP72-R2(10丛molL 2.1 VP72-T2(10丛mol/L 0.6L 将42.5!L荧光RAA反应混合液加人RAA荧光基础反应单元中;将5ALDNA模板加人每个反 应管中,将2.5pL乙酸镁加在反应单元管盖上 每次进行荧光RAA扩增时均应设立阳性、阴性及空白 对照 阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板,阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为 模板,空白对照应用无核酸酶水作为模板 加人模板后,密封反应管,放人恒温振荡混匀仪 完成混匀 收集后,将所有反应管放人荧光恒温检测仪中 按9.4.2.2运行扩增程序 9.4.2.2扩增条件 笔.;扩增时间15mim.每隔20收集荧光信号 扩增温度39" 9.5试验成立条件 阳性对照起峰时间<1.67min且出现特异性起峰曲线,阴性对照无起峰时间或阴性对照起峰时 间>10nmin且无特异性起峰曲线,试验结果有效;否则应重新进行试验 9.6荧光RAA结果判定 符合9.5的条件,被检样品起峰时间<10min且出现特异性起峰曲线,则判为ASFV核酸阳性;被 检样品无起峰时间或被检样品起峰时间>10min且无特异性起峰曲线,则判定为AsFV核酸阴性 0高敏荧光免疫分析法 10.1试剂 0.1.1无核酸酶水,配制方法见B1 10.1.20.1mol/LPBS(pH7.4),配制方法见A.1 10.1.3ASFV抗原高敏荧光检测试剂卡(检测卡). 0.2仪器设备 10.2.1高敏荧光分析仪 10.2.2组织匀浆机 10.2.3微量可调移液器(2.5L,10ML100AlL,200AL、1000AL等不同规格) 10.2.4台式低温高速离心机(最大离心力12000片以上).
GB/T18648一2020 0.3试验程序 10.3.1样本前处理 10.3.1.1 血液样本处理 全血需经过抗凝处理,血清、血浆无需处理 10.3.1.2组织样本处理 取猪组织(优先采集脾或淋巴结组织)4g加人匀浆机,加人1ml.0.1mol/IPBs(pH7.4)缓冲液 打碎搅拌成匀浆、离心,取上清液待检 10.3.2准备 待检样本和检测卡从2C一8C取出,平衡到室温(25C左有);高敏荧光分析仪开机 10.3.3加样 10.3.3.1血清、血浆或组织提取上清液 用微量可调移液器吸取样本40L加人检测卡,然后加人50L稀释液,从加样开始静置免疫反应 15min后读值 10.3.3.2全血、黏稠样品 用微量可调移液器吸取样本50L加人检测卡,5min后加人50儿L稀释液,接着再加人50L稀 释液冲洗 从加样开始静置免疫反应15min后读值 10.3.3.3唾液,粪便,污水样品 用微量可调移液器吸取样本40l加人检测卡,然后加人504L稀释液,从加样开始静置免疫反应 15min后读值 0.3.4检测 避光层析15min后,将检测卡放人高敏荧光分析仪,点击“诊断”读值 0.4高敏荧光免疫分析结果判定 读值与AsFV抗原含量成正比 0.4.1检测结果判定 被检样品读值<12,则判定为ASFV抗原阴性;被检样品读值>16,则判定为ASFV抗原阳性; 12<被检样品读值<16,则判定为可疑 10.4.2可疑样品复测判定 可疑样品读值<12,则判定为ASFV抗原阴性;可疑样品读值>12,则判定为ASFV抗原阳性
GB/T18648一2020 11 夹心ELISA抗原检测方法 11.1试剂 包被抗体;ASFVP30蛋白单克隆抗体 酶标抗体;辣根过氧化物酶标记的P30蛋白单抗(针对P30蛋白的不同表位) 对照:ASFV阳性对照(纯化的杆状病毒表达P30蛋白、ASFV阴性对照(SPF猪血清) 包被缓冲液,配制方法见附录C的C.1 封闭缓冲液,配制方法见C.2 稀释缓冲液,配制方法见C.3 洗涤缓冲液,配制方法见C.4. 11.1.8TMD底物溶液,配制方法见C.5 终止液,配制方法见C.6 11.2仪器设备 1.2.1酶标仪 恒温孵育箱 11.2.2 1.2.3洗板机或洗涤瓶 1.2.496孔酶标板 11.2.5“U”型96孔稀释板 11.2.6微量可调移液器(2.5L,10L、,100AL、,200L,1000L等不同规格. 11.2.7贮液槽 11.2.8封板膜 11.2.9吸水纸巾 11.3试验程序 11.3.1包被酶标板 P30蛋白单克隆抗体用包被缓冲液1;200倍稀释后,每孔100包被96孔酶标板,37C饱和湿度 下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300L/孔加人封闭缓冲液,37C饱和湿度下吸附2h,用洗 涤缓冲液洗板4次后拍干 11.3.2夹心ELISA抗原检测操作步骤 11.3.2.1在所有孔中加人稀释液,25L/孔 11.3.2.2酶标板上对照和待检样品的分布图,见图1 在A1、B1孔中加人阳性对照,25L/孔;在C1、 D1孔中加人阴性对照,25AL/孔;在E1、F1等其余孔加人待检样品,25AL/孔,37C孵育60min. 1.3.2.3弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300ML/孔 1.3.2.4每孔加人酶标抗体(IX),50pL/孔.37亿孵育30min. 11.3.2.5弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300L/孔 11.3.2.6每孔加人底物溶液,50L/孔,室温避光作用10 min 11.3.2.7每孔中加人50L终止液,终止反应 11.3.2.8用酶标仪在450nm波长下测定各孔OD值
GB/T18648一2020 S6 S8 E S0 s2 Sl H 说明 -阳性对照孔; N -阴性对照孔 S1,S2,S3,S4等 待检样品孔,其余类推 图1样品加样记录表(推荐模式 11.4试验成立条件 阳性对照OD值>0.5,且阴性对照OD值<0.09,试验结果有效;否则,应重新进行试验 11.5夹心ELIsA抗原检测结果判定 在试验成立的前提下,待检样品ODm>0.12,则判定该待检样品为ASFV抗原阳性;ODn<0.12 则判定该待检样品为AsFV抗原阴性 间接ELISA抗体检测方法 12 12.1试剂 12.1.1包被抗原:杆状病毒表达的ASFVP30重组蛋白 2.1.2酶标抗体;辣根过氧化物酶标记的羊抗猪二抗 2.1.3对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清 12.1.4包被缓冲液,配制方法见C.1 12.1.5封闭缓冲液,配制方法见C.2 12.1.6稀释缓冲液,配制方法见C.3 2.1.7洗涤缓冲液,配制方法见C.4 12.1.8TMD底物溶液,配制方法见C.5 2.1.9终止液,配制方法见C.6. 12.2仪器设备 见11.2 2.3试验程序 12.3.1 包被酶标板 用包被缓冲液将ASFVP30重组蛋白稀释至终浓度0.34g/mL,每孔100L包被96孔酶标板奇 10
GB/T18648一2020 数条作为检测孔,使用抗原稀释液包被96孔酶标板偶数条作为对照孔,37C饱和湿度下吸附2h,用洗 涤缓冲液洗板4次后拍干,300AL/孔加人封闭缓冲液,37C饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4 次后拍干 12.3.2间接ELISA抗体检测操作步骤 12.3.2.1待检血清与阴性、阳性对照血清使用样品稀释液做40倍稀释 阱标版上对照和待检样品的分布图,见图2 50AL/礼在A.A相u.,2孔中加人稻释后 12.3.2.2 的阳性对照血清,在C1,C2和D1,D2孔中加人稀释后的阴性对照血清,在E1,E2等其余孔加人稀释后 的待检血清,37C孵育60min 12.3.2.3弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次,洗涤缓冲液300AL/孔 2.3.2.4每孔加人酶标抗体(1×),50L/孔,37C孵育30nmin 2.3.2.5弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗4次.洗涤缓冲液300aL/孔 2.3.2.6每孔加人底物溶液,50L/孔,室温避光作用10nmin 2.3.2.7每孔中加人50L终止液,终止反应 12.3.2.8用酶标仪在450 nm波长下测定各孔OD值,按式(1)计算OD丽差值 OD. =OD. -OD. s0-c一 A50-" 50-o 式中: OD OD差值 0-c OD奇数孔值; ODs0- OD偶数孔值 OD0-o 10 l1l 12 P s5 S5 s6 S6 S8 S8 sg so S2 S2 S1oS10 s3 s3 S1lS11 S4S4S12S12 说明 阳性血清对照孔; -阴性血清对照孔 S1,S2,S3,S4等 待检血清孔,其余类推 图2样品加样记录表(推荐模式 2.4试验成立条件 阳性对照ODa差>0.5,且阴性对照OD差<0.2,试验结果有效;否则,应重新进行试验 2.5间接ELISA抗体检测结果判定 在试验成立的前提下,待检样品ODa差>0.2,则判定该待检样品为ASFV抗体阳性;待检样品 11
GB/T18648一2020 ODn差<0.2,则判定该待检样品为ASFV抗体阴性 3阻断ELISA抗体检测方法 3.1试剂 13.1.1包被抗原;杆状病毒表达的ASFVP30重组蛋白 3.1.2酶标抗体;辣根过氧化物酶标记的抗ASFVP30蛋白单抗 3.1.3对照.ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清 13.1.4包被缓冲液,配制方法见C.1 3.1.5封闭缓冲液,配制方法见c.2. 13.1.6稀释缓冲液,配制方法见C.3. 13.1.7洗涤缓冲液,配制方法见C.4 13.1.8TMD底物溶液,配制方法见C.5 13.1.9终止液,配制方法见C.6 13.2仪器设备 见11.2 13.3试验程序 包被酶标板 13.3.1 用包被缓冲液将AsFVP30重组蛋白稀释成终浓度为0.3g/mL每孔100L包被96孔酶标板 37C饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次,300aL/孔加人封闭缓冲液,37C饱和湿度下吸附 2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干 3.3.2阻断EL.ISA抗体检测操作步骤 13.3.2.1酶标板上对照和样品的分布图,见图3 每孔加人50AL的稀释液,在A1,B1孔加人50l 阳性对照血清,在C1、D1孔加人50从L阴性对照血清,在E1、F1孔加人50AL稀释液,其余每孔加人 50L的血清样品,37C孵育60min. 3.3.2.2弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300L/孔 13.3.2.3用稀释缓冲液将酶标P30单抗稀释至工作浓度,100AL/孔,37C孵育30min. 13.3.2.4弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗5次,洗涤缓冲液300AL/孔 3.3.2.5每孔加人底物溶液,100L/孔,室温避光作用15nmin 13.3.2.6每孔中加人100AL终止液,终止反应 13.3.2.7用酶标仪在450nm的波长下测定各孔OD值,计算阻断率 12
GB/T18648一2020 s s5 s6 S8 S9 H S2S10 说明 阳性血清对照孔; -阴性血清对照孔 酶标单抗对照孔 Cm S1、,S2,S3,S4等 待检血清孔,其余类推 图3样品加样记录表(推荐模式 3.4阻断率计算方法 阻断率按式(2)式(4)计算 BR=100-(oD叫-s×100)-OD,- BRc=100-(oD0二c×100)-OD0- BR=100-(ODa-爬×100)-ODi0- 式中 BR 待检血清样品阻断率; BR -阴性对照血清阻断率; BReC -阳性对照血清阻断率; -待检血清样品OD值; ODs0-s -阴性对照血清OD值; OD0c 阳性对照血清OD值 -酶标单抗对照OD值 OD0-cm 13.5试验成立条件 阳性对照阻断率一70,且阴性对照阻断率<30,试验结果有效;否则,应重新进行试验 3.6阻断ELISA抗体检测结果判定 在试验成立的前提下,待检样品阻断率>50,则判定为ASFV抗体阳性;待检样品阻断率<50,则 判定为ASFV抗体阴性 14夹心EL.ISA抗体检测方法 14.1试剂 14.1.1包被抗原:ASFV重组P54蛋白 13
GB/T18648一2020 14.1.2酶标抗原;辣根过氧化物酶标记的重组P54蛋白 14.1.3对照:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清 14.1.4包被缓冲液,配制方法见C.1 14.1.5封闭缓冲液,配制方法见C.2. 14.1.6稀释缓冲液,配制方法见C.3. 14.1.7洗涤缓冲液,配制方法见C.4 14.1.8TMD底物溶液,配制方法见C.5 14.1.9终止液,配制方法见C.6. 14.2仪器设备 见11.2 14.3试验程序 14.3.1 包被酶标板 ASFV重组P54蛋白用包被缓冲液稀释至终浓度为0.1"g/ml,按每孔100AL的量包被96孔酶 标板,37C饱和湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干,300AL/孔加人封闭缓冲液,37C饱和 湿度下吸附2h,用洗涤缓冲液洗板4次后拍干 14.3.2ELISA操作步骤 酶标板上对照和样品的分布图,见图4 在A1和B1孔加人AsFV阳性对照血清各50aL 14.3.2.1 在c1和D1孔加人AsFV阴性对照血清各50AL;剩余孔中加人待检样品血清50AL ,37C孵育20min. 轻轻振匀孔中样品(勿溢出 14.3.2.2 14.3.2.3甩干AsFV抗原包被板孔中的液体,每孔加人300L洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加人 下 一个试剂前,避免孔壁变干 14.3.2.4每孔加人50AL的酶标抗原(1×);37C孵育20min 14.3.2.5甩干ASFV抗原包被板孔中的液体,每孔加人300AL洗涤缓冲液,洗涤5次,在洗涤和加人 下 个试剂前,避免孔壁变干 14.3.2.6每孔加人504L底物溶液A和50M底物溶液B;37C避光孵育10min 14.3.2.7每孔加人50AL终止液终止显色反应;使用酶标仪测定450nm波长处的OD值 14
GB/T18648一2020 s6 s7 s8 E s9 S2 S10 S3S1 H S12 说明 阳性血清对照孔; -阴性血清对照孔 N S1、,S2、S3,S4等 待检血清孔,其余类推 图4样品加样记录表(推荐模式 14.4试验成立条件 OD、值<0.15且OD0值>0.6,试验结果有效;否则重新进行试验 注:阴性血清的平均OD值即为ODa-e;阳性血清的平均OD值即为OD0-代 14.5夹心ELISA抗体检测结果判定 CutOff值按式(5)计算 CutOff=OD-OC、 式中: OD -待检血清样品ODe值; 50-s OD0-Ne -阴性对照血清OD值 在试验成立的前提下,CutOff值0.15,则判为ASFV抗体阴性;CutOHf值>0.15,则判为ASFV 抗体阳性 5间接免疫荧光方法 5.1试剂 5.1.1制备抗原板:感染ASFV的细胞或者感染重组病毒(表达ASFV蛋白)的细胞固定于固相载体 5.1.2对照血清:ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清 15.1.3荧光二抗:羊抗猪IgGH&.L(FITC). 5.1.4细胞固定液:丙酮、甲醇按1:1比例配置 5.1.5封闭缓冲液,配制方法见C.2. 5.1.6稀释缓冲液,配制方法见C.3. 5.1.7洗涤缓冲液,配制方法见C.4 15
GB/T18648一2020 15.2仪器设备 5.2.1荧光显微镜 15.2.224孔细胞培养板 5.2.3旋转振荡器 5.2.4恒温培养箱 5.2.5微量可调移液器(2.5"L、10lL100AL.200AL,1000AL.等不同规格 5.2.6与移液器匹配的吸头 15.2.7吸水纸巾 15.3试验程序 15.3.1抗原板的制备 选择合适细胞铺制24孔细胞培养板,待细胞生长至80%时,进行细胞计数 按合适的病毒量接种 ASFV种毒或表达ASFV蛋白的重组病毒,37笔维持培养约48h 每孔加人200AL预冷细胞固定液 将细胞固定10min.,弃去同定液.将细胞培养板脉千 脱干后储存于一20C冰箱备用 15.3.2间接免疫荧光检测操作步骤 15.3.2.1 将固定的抗原板从-如它冰箱中取出,每孔用洗涤缓冲被清洗3次,洗杀缓冲被1o0L/孔 5.3.2.2抗原板上对照和样品的分布图,见图5 弃去反应孔中的液体,在A1孔加人200L阳性对 照血清,在B1孔加人200AL阴性对照血清,其余每孔加人200L的待检血清样品,37C孵育60min S3 B N S4 S1 S2 说明 阳性血清对照孔; -阴性血清对照孔 待检血清孔,其余类推 Sl,S2、S3,S4等 图5样品加样记录表(推荐模式) 15.3.2.3弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗3次,洗涤缓冲液100L/孔 5.3.2.4用稀释缓冲液将荧光二抗稀释至工作浓度,200AL/孔,37C孵育50 min 5.3.2.5弃去反应孔中的液体,每孔用洗涤缓冲液清洗3次,洗涤缓冲液1000L孔 15.3.2.6荧光显微镜观察结果 15.4试验成立条件 阳性对照出现特异性绿色荧光,且阴性对照无特异性绿色荧光,试验结果有效;否则,应重新进行 试验 16
GB/T18648一2020 5.5间接免疫荧光结果判定 在试验成立的前提下,待检样品出现特异性绿色荧光,则判定待检样品为ASFV抗体阳性 待检 样品无特异性绿色荧光,则判定待检样品为ASFV抗体阴性 待检样品出现非特异性绿色荧光或荧光 信号较弱,则判定待检样品为ASFV抗体可疑,建议重新检测血清样品或用不同的方法重新检测 6综合判定 经5.4判定为疑似AsF病例,经普通PCR方法(见第7章),荧光CR方法(见第8章),荧光 16.1 RAA方法(见第9章)任一项检测出ASFV核酸阳性的,或经高敏荧光免疫分析法见第10章、夹心 ELISA抗原检测方法(见第11章)任一项检测出ASFV抗原阳性的,可诊断为ASF病例 如经普通 PCR方法(见第7章)检测出ASFV核酸阴性的,或经高敏荧光免疫分析法(见第10章》 、夹心ELISA 抗原检测方法(见第11章)检测出ASFV抗原阴性的,仍需经荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方 法见第9章)进行再检,任一项检出ASFV核酸阳性的,可诊断为ASF病例 荧光民R方法(见第》章.荧光 16.2无明显临床症状的易感动物,经普通PCR方法见第7章 RAA方法(见第9章)任 核酸阳性的,或经高敏荧光免疫分析法(见第10章),夹心 ELISA抗原检测方法见第11 项检测出ASFV抗原阳性的，,可诊断为ASFV感染;如经普通 PCR方法(见第7章)检测出 核酸阴性的,或经高敏荧光免疫分析法(见第10章、夹心ELISA 抗原检测方法(见第11章)检测出AsFV抗原阴性的.仍需经荧光PCR方法(见第8章)、荧光RAA方 法(见第9章)进行再检,任一项检出AsFV核酸阳性的,可诊断为AsF感染 16.3经间接ELISA抗体检测方法(见第12章)、阻断ELISA抗体检测方法(见第13章),夹心ELIsA 抗体检测方法(见第14章),间接免疫荧光方法(见第15章)任一项检测出AsFV抗体阳性的,可诊断 为ASFV抗体阳性;如经间接EL.ISA抗体检测方法(见第12章、阻断ELISA抗体检测方法(见第13 章)、夹心ELISA抗体检测方法(见第14章)检测结果不一致的,需经间接免疫荧光方法(见第15章)进 行确诊 17
GB/T18648?2020 ? A 淶??) ??? A.10.1mo/Lλ?(PBs,pH7.4 ?(NaCI 85.00" (NagHPO 15.49g (NaH,PO) 2.03g ?? 1000ml ?(NaCI) 80.0g ?(KCI 2.0g 30.0 (NaHPO12H.O) g 2.0 (KHPO g 1000mL ?? A.20.04mol/LPBSpH7.4 0.1mol/LPBS 400ml 600ml ?? 103kPa?30min,?4C?档 A.350%-PBS? 0.04mol/PBS???pH?7.4,?С?103kPa? 30min" ?4C? 18
GB/T18648?2020 ?B 淶?? ?????? ??? B.1 DEPC 1ml ?? l1000ml ?,???37Cù?,? B.250TAE? ?(Tris) 242.0g 57.1ml 100.0ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0) ??1000mL B.31TAE? ??50TAE50??ɡ B.42%? ? 1g 50mL 1TAE? GoldView?(10mg/mL) 2.5l ?1g?,200ml??,50ml.1TAE?,?,?50C 60C?2.5AlGoldView?,??? 19
GB/T18648?2020 ? 淶??) ??? C.1?-0.05mol/LpH9.6?λ? Na,CO 0.318g NaHcO. 0.588g ?? 200mL 0.22?m??,±汸á C.2??2%BSsApH7.4PBs) pH7.4PBS 1000mL BSA 20 g á C3???(1%BSApH7.4PBS) pH7.4PBS 1000mL BSA 10 g á ?pH7.4PBSr(0.05%-20 ??? pH7.4PBS 1000ml -20 0.5ml C.5TMD? ?A TMB 200mg ?? 100ml ??1000mL ?B (NaHPO, 71.7g (C,H,O,, 9.33g 0.75% 6.4ml ??1000mL.,pH?5.0~5.4 ?A??B1:1,á 20
GB/T18648?2020 C.6??(2mol/L) 111mL??μ889ml??,·?档 21

非洲猪瘟诊断技术GB/T18648-2020

非洲猪瘟是一种由非洲猪瘟病毒引起的高度传染性疾病，常见于猪只。该病毒可以通过接触、饮食受污染的水源、空气传播以及跳蚤等昆虫传播，给养猪行业造成了巨大的经济损失和社会影响。因此，快速、准确地诊断非洲猪瘟是保障畜牧业安全的关键之一。 GB/T18648-2020是我国最新的针对非洲猪瘟诊断技术的标准，它在原有的标准基础上做出了一系列更新和完善。该标准包括了非洲猪瘟诊断的实验方法、检测原理、样品采集与处理、检测结果判定等方面的内容。 根据GB/T18648-2020标准规定，非洲猪瘟的诊断应该采用实验室检测的方式进行。其中，最常用的方法是PCR（聚合酶链式反应）技术和ELISA（酶联免疫吸附试验）技术。这两种技术具有快速、准确、灵敏度高等特点，在非洲猪瘟疫情的早期诊断中发挥着至关重要的作用。 除了PCR和ELISA技术外，GB/T18648-2020标准还列出了其他一些非洲猪瘟的诊断方法，如病毒分离技术、免疫荧光试验、核酸杂交技术等。这些方法在不同的场景下都具有一定的应用价值，可以根据实际需要选择相应的诊断技术来进行病原体的检测和诊断。 总体来说，GB/T18648-2020标准的出台为我国畜牧业防控非洲猪瘟提供了科学的依据和指导。疫情防控人员可以根据标准中的要求，选择适当的诊断技术和实验方法，及时准确地检测出非洲猪瘟病原体，保障畜牧业的健康发展。

非洲猪瘟诊断技术的相关资料

和非洲猪瘟诊断技术类似的标准

GB/T22330.5-2008

无规定动物疫病区标准第5部分：无非洲猪瘟区

2022/10/30 2:37:08 现行

GB/T18648-2020

非洲猪瘟诊断技术

2022/7/17 21:46:07 现行