化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验

化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验

国家标准 GB/T35522一2017 化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验 ChemiealsColembolanreproductiontestinsoi 2017-12-29发布 2018-07-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB/T35522一2017 引 言 本标准主要用于评估化学品对于土壤弹尾目跳虫繁殖能力的影响 该标准在已有的试验操作程序 基础上制定 无性生殖的Folse somnia.candida和两性繁殖的Folsomia 是弹尾目跳虫的常见 1etaria 品种,可通过养殖或经市场渠道获得 当这两种跳虫不能满足评估试验对某些特殊栖息地的要求时,也 可使用其他任何满足试验有效性的弹尾目种类 从生态学的角度看,土居跳虫是进行生态毒理学试验较为合适的品种 弹尾目跳虫是一种六足节 肢动物,长有一层纤薄的、极易被水和空气透过的外骨骼,与蚯蚓和线蚓相比,具有不同的暴露途径和 级别 在大多数陆生生态系统中,生存于土壤和落叶层中的弹尾目跳虫种群密度一般为每平方米105个 mm5mm 典型成熟个体为0.5n a,对土壤生物量和土壤呼吸作用贡献很低仅为1%~5% 因此,土壤 弹尾目跳虫更为重要的作用是作为土壤食微生物和小型动物的食物来源而扮演食物链中潜在的调节 、蜘蛛、步行虫和隐翅虫在内的广远分布而种类繁多的内 者 土壤弹尾目跳虫本身可被包括壁虱、蜈蚣、 生和后生无脊惟动物捕食 土壤弹尾目跳虫有助于酸性土壤的分解 而由于蚯蚓和千足虫通常不存在 于酸性土壤中,弹尾目跳虫因而成为此类环境中除线蚓以外最重要的无脊椎动物 F.fimelaria跳虫在世界各地都有分布,从沙土到壤土,从含细腐殖质到含粗腐殖质等儿种典型土 壤中均广泛存在,是一种无眼无色的弹尾目跳虫,在全欧洲各地的农业土壤中均有发现 有杂食习性 其食物包括真菌菌丝、细菌、原生动物和碎屑物等 F.fimetaria通过接触与感染植物的致病真菌发生 相互作用,并影响真菌菌根,这一点与F.candida的作用相同 与多数弹尾目跳虫物种一样,F.finme laria跳虫为有性生殖,要求一直有雄性受精卵的存在 F.candida同样在世界各地都有分布 尽管在一般土壤中并不常见,此类跳虫在富含腐殖质的土 壤中大量存在 它是无眼无色素,叉骨(弹器)发达,时刻处于活跃的游移状态，一旦受到惊扰,就会迅速 的移动和跳动 F.candida对生态的影响机制类似于F./fimetaria,但其栖息地主要是有机质含量更高 的土壤 F.candda为无性生殖 雄性出现的概率小于千分之-
GB/35522一2017 化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验 范围 本标准规定了化学品土壤中弹尾目昆虫(跳虫)的生殖试验的术语和定义、试验原理、试验方法和步 骤、数据与报告 本标准适用于评估溶于水或不溶于水的物质对土壤中弹尾目昆虫(跳虫)的生殖效应的影响 本标准不适用于挥发性物质,即享利常数或气/水分配系数大于1,或在25C时蒸气压超过0.0133Pa 的物质 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的 凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文 件 凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 1s010390土壤质量pH值的测定(Soilquality一DeterminationofpH 土壤质量 IsO11268-2 污染物对蚯蚓Eiseniafetida/Eiseniaandrei)的影响第2部分:繁殖效 polutants onearthworms Part2:Determinationofeffectsonre 应的测定(SoilqualityEfectsof productionofE seniaandrei senia/fetida/Eise 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 无可观察效应浓度noobservedeffecteoncentration;NOEC 在给定的暴露期间,与空白对照比较,受试物质对目标生物没有产生明显不良效应时所对应的最高 浓度力<0.05). 3.2 n;LOEC 最低可观察效应浓度 lowestobservedeffteetconeentration 在给定的暴露期间,与空白对照比较,受试物质对目标生物产生明显不良效应时所对应的最低浓度 0.05) 3.3 x%效应浓度efreetconeentrationforx%efreet EC 经与空白对照比较,引起受试生物的效应终点参数与对照组相比下降r%时的受试物浓度(p< 0.05) 3.4 .x"%致死浓度lethaleoncentratonforx% LC 导致r%的试验对象死亡的浓度
GB/T35522一2017 试验原理 4.1将成虫Folsomiaimetaria(F. )或幼虫Folsomiacandida(F.cand ndida)同步暴露在含 fi71etaria 有不同浓度的受试物质的人工土壤中,也可选择其他种类土壤 受试物质与改性人工土壤混合土壤中 有机质含量为5% 试验分为以下两个步骤: 预试验:如无法获取足够的毒理学信息,则应先进行预试验,主要测试2周后F.fimmetaria和 3周后F.candida的死亡率和繁殖率 正式繁殖试验;测试亲代成虫所繁殖幼虫的总数量和亲代成虫的存活率 F.fimetaria跳虫 的试验周期为3周,F.candida跳虫的试验周期为4周 4.2受试物质对于成虫死亡率和繁殖率的毒性效应分别采用IC,(致死浓度)和EC,(效应浓度)来表 示,运用合适的非线性回归分析法以评价分别引起r%跳虫死亡或导致跳虫繁殖降低r%的受试物质 浓度;亦可选用NOEC/LOEC(无可观察效应浓度/最低可观察效应浓度)值 5 受试物 5.1理想情况下,应事先掌握受试物质的理化特性、水溶性、辛醇/水分配系数、土壤/水分配系数以及 蒸气压等数据 另外还需知道受试物质在土壤中环境行为数据,如光解速率,水解速率和生物降解速率 等 对受试物进行化学鉴定,包括化学文摘序列号、批次,批号、结构式和纯度,应记录存档 本标准适用于溶于水或不溶于水的物质,主要根据受试物质的类型不同施用 本标准不适用于挥 5.2 发性物质,即享利常数或气/水分配系数大于1或在25C时蒸气压超过0.0133Pa的物质 试验有效性 6 空白对照样本需满足下列条件时可视为试验结果有效 -试验结束时,成熟个体的平均死亡率不高于20% -试验结束时,每个容器中的平均幼体数量至少达到100个 正式试验结束时,计算所得的幼体数量的变异系数低于30% 参照物 对于选定的试验土壤样本,应采用参比物在其半数效应浓度下开展对照测试;测试可每隔固定时间 段进行,或包含在每次的试验过程中,以证实试验体系中的试验生物响应程度在正常水平以内 棚酸是 种合适的参比物,在每千克(干重)土壤中添加约100mg碉酸,可造成上述两个土壤跳虫物种的繁殖 率下降50% 试验 8 8.1仪器设备 宜选用可容纳30g潮湿土壤的器皿作为试验容器 容器材质应选用玻璃或惰性塑料(无毒) 但 如因吸附作用而导致受试物质的量减少,则应避免使用塑料材质容器 试验容器均应具备一定横截面 积,以确保容器中的土壤实际深度达到2e cm4em 容器要有专门设计的盖子比如玻璃或聚乙烯材 质),以减少水分蒸发,同时又可确保土壤和大气的气体交换 容器至少应有部分为透明,以便于光线照
GB/35522一2017 要求配备常规的实验室设备,以下所列为必备设备: 干燥箱(105C土5); 体视显微镜; pH计(精确至0.01)和光照度计(精确至1lx); -天平(精确至0.000lg); -用于温度控制的设备; 用于空气湿度控制的设备(如容器有加盖设计可忽略); -可控制温度的孵化箱或小室; 辍子或低流量的空气流动装置 8.2制备试验土壤 8.2.1选用改进的人工土壤,其有机质含量为5% 如人工土壤组分与天然土壤差异较大时,可选用天 然土壤 推荐的人工土壤成分(干重状态,105C温度下烘干至恒重)如下 -5%水藓泥炭,经风干并磨细至粒径大小为2mm士1mm; 20%高岭土,其中高岭石含量宜大于30%; 约74%组分含量的风干工业沙(具体用量取决于所需碳酸钙的含量),成分以细沙为主,其中 超过50%沙的粒径应满足50m一200Am 沙的实际用量取决于碳酸钙含量,沙和碳酸钙合 计含量应达到75%; -粉末状分析纯碳酸钙,含量低于1%,调节pH值至6.0士0.5;碳酸钙的加人量主要取决于泥炭 的质量/性质 8.2.2将干土在搅拌器中充分混匀 根据附录A所描述的流程确定人工土壤的最大持水量(water HoldingCapacity,wHC) 应优化试验土壤的含水量以获得疏松多孔的土壤结构,以便于弹尾目跳虫 自由进出这些孔隙 最大持水量通常为40%一60% 8.2.3在试验前2d7d,在干燥的人工土壤中添加足量的去离子水对土壤进行预湿润,使最终的水持 量达到饱和含水量的一半左右,以平衡/稳定土壤酸度 按1:5(参见附录B)的比例将土壤与1mol/1 氯化钾或0.01mol/L氯化钙混合 测试土壤pH值时,如果土壤的酸度值超出了要求的范围,可以通 过添加适量的碳酸钙来予以调节 如土壤偏碱性,则可以添加一份对弹尾目跳虫无害的无机酸来进行 调节pH值 8.2.4将经过预湿润的土壤分装至不同的受试物质浓度组(包括参比物组)和空白对照组中 加人受 试化合物,调节含水量 8.3试验动物的选择和准备 推荐将F.candida作为试验物种 这是因为与F.fimetaria相比,F.candida在存活率方面更高 能更好地满足试验的有效性标准 如需使用F./imetaria,则该物种应满足试验的有效性标准要求 试验开始时,应保证试验动物饲喂情况良好,应选择年龄为23d一26d的F.fimetaria或9d一12d的 F.candida 对于每一个浓度的平行,应确保有10对雌雄的F.,fimetaria,或10只雌的F.candida(见 附录C并参见附录D) 从培养皿中随机选取同步发育的跳虫,对加人各平行中的各批次跳虫的健康及 所需碳酸钙含量取决于土壤基质层的成分,试验开始前需立即测试已经预培养的潮 湿土壤分样本的pH值,以 1 确定碳酸钙的实际用量 建议测试pH值或碳氮比、阳离子交换量和土壤有机物含量,以确保试验后期阶段的 标准化、更好论释试验结果 如确因必要,比如出于特定的试验需求,也可采用从未受污染的区域采集的天然 土壤作为试验或培养基 如采用天然土壤,需记录土壤的来源(采集区域),pH值,质地(颗粒分布情况),阳岗 子交换量和有机物含量等特性,并确保土壤不受任何污染 如需使用天然土壤,建议在将天然土壤样本用于正 式试验之前,证明其适用于试验并可满足试验的有效性条件
GB/T35522一2017 身体状况进行检查 在随机挑选的试验容器中每组加人10/20只跳虫,选用体型较大的F.fimetaria 雌雕虫以便于与个体较小的雄虫区分 8.4受试物质试验浓度的准备 8.4.1选用何种方法取决于化合物的特性以及试验目的 一般情况下,建议将受试物质混人土壤,但 试验也可能要求采用与受试物质实际用途一致的施用方法(比如在液态下进行喷洒,或是采用颗粒状或 种子敷料等特殊剂型的杀虫制剂) 除非受试物质添加到土壤表面,否则应在添加试验化合物前对土壤 进行处理,再让跳虫进人到土壤内部 可采用四种不同的受试物质施用方法 -将受试物质溶于水后混人土壤中作为载体 将受试物质溶于有机溶剂后混人土壤中作为载体 -将受试物质与沙拌匀后混人土壤中作为载体 -将受试物质直接施加到土壤表面 8.4.2对于水溶性受试物质,用足量去离子水溶解受试物质,溶液分量应足够一个试验浓度下的所有 重复试验批次使用 在移人试验容器之前,每份溶液均应与一份预先湿润的土壤充分混合 贡,如受试物质为不溶于水但可解于有机游剂的化学物质,应将其溶解在 8.4.3对于非水溶性受试物质 最小体积的适用溶剂如丙酮)中,但同时仍应确保该化学物质能与土壤充分混匀,并按要求混人一定量 的石英砂 只能使用挥发性的有机溶剂 当使用有机溶剂时,所有试验浓度和额外设置的溶剂阴性对 照组应加人最小量的溶剂,且每次用量均相同 试验容器应敞开一定的时间,以方便溶剂的挥发,确保 在这段时间里受试物质没有随之减少 8.4.4如受试物质极难溶于水和有机溶剂,应将部分石英砂混人一定量的受试物质后加人土壤中,从 而获得预期的受试物质浓度 将混合好的石英砂和受试物的混合物加人到经过添加适量去离子水后充 分混匀达到含水量要求的湿土中 将最终的混合物分装人试验容器 每个受试物质浓度组均需重复上 述步骤,并制备合适的对照组 8.4.5对于施用到土壤表面的受试物质(如杀虫剂),需要以喷洒方式施用于土壤表面 先将跳虫放人 后,再对土壤进行处理 首先将试验容器装满湿润的土壤基质,然后加人试验动物,并对试验容器称重 为避免试验动物直接接触受试物质,受试物至少在跳虫引人土壤半小时后才能施加受试物质 为了模 拟田间喷洒施用效果,应该尽可能使用合适的实验室喷洒设备,尽可能均匀地将受试物质施用于土壤表 面 如受试物质为水溶液、乳浊液或分散剂,施放速度应根据风险评估的数据确定,施用受试物质时环 境温度的差异范围应在土2C以内 采用合适的校准技术对施用率进行校验 对于颗粒状或种子敷料 等特殊剂型,可采用惯用的农业施用方式 饲料需在喷洒完成后添加 8.5试验步骤 8.5.1试验条件 8.5.1.1试验平均温度应为20C士1C,试验温度范围为20C士2C 试验容器区域的光照度为 400lx800lx之间,昼夜交替(理想状态下各为12h) 8.5.1.2为了测试土壤湿度,需要分别在试验开始时、过程中及结束阶段对试验容器进行称重 如质量 损失超过了2%,则应添加去离子水以弥补流失的水分 值得注意的是,在试验孵化设备中保持较高的 空气湿度(大于80%),可以有效减少水分的流失 8.5.1.3在预试验和正式试验的开始和结束阶段均应测试pH值 采用与试验培养环境相同的制备和 保存方式,在各个浓度组之外,额外准备一组空白对照和一组经处理土壤样本(均未添加跳虫),进行 pH值测试
GB/35522一2017 8.5.2试验步骤和测试 8.5.2.1对于每一个试验浓度,向试验容器中加人30只鲜重的测试土壤 同时制备不含受试物质的水 空白对照样品 如在施用受试物质过程中使用了某种介质,那么还应对该介质的对照进行测试 溶剂 或分散剂的浓度应在各试验测试组中保持一致 8.5.2.2将跳虫小心地逐个移人每个试验容器(随机分配),并放置在土壤的表面 可以采用一个低流 速的气流装置来提高转移效率 每个试验浓度和空白对照组的平行数取决于试验设计方案 在试验孵 化箱中随机摆放试验容器,并每周随机更换容器在孵化箱中的位置 8.5.2.3每个试验容器中应包括20只出生23d26d的F.fimetaria,雄雌对半 在试验的第21天 从土壤中分离出跳虫并计数 对同一批次试验动物可通过个体大小来辨别F fi 的性别 雌虫 1etaria 个体显著大于雄虫(参见附录D) 8.5.2.4对于F.candida试验,每个试验容器中应加人10只出生9d~12d的跳虫 在试验的第28 天,从土壤中取出跳虫并计数 8.5.2.5试验开始时及之后的2周,向每个试验容器中投放足量的饲料(如2mg10mg) 饲料为市 售的颗粒状的干酵母粉 8.5.2.6试验结束时,将大约3周(F.fimetaria)或4周(F.candida)跳虫从土壤中取出并计数(见附录 E),计算跳虫的死亡率和繁殖率 没有提取出的跳虫则被记录为死亡 提取和计数方法应经过验证 验证方法比如在土壤中加人一定数目的跳虫,看该方法取出率是否大于已知投放数量的95% 8.5.2.7试验操作过程中的记录表格见附录c 8.5.3试验设计 8.5.3.1 预试验 8.5.3.1.1必要时应进行预试验以确定试验浓度范围,如分成0.1mg/kg、1.0mg/kg、10mg/kg、 100mg/kg和1000mg/kg(土壤干重)的5个试验浓度,每个浓度两个平行样和空白对照 另外,还可 以通过结构相似的化合物的试验结果,或是来自文献的跳虫死亡率或繁殖率等信息,作为判定浓度范围 的依据,从而确定试验浓度 8.5.3.1.2预试验的试验周期一般对于F.fimetaria为四周、F.candida为三周,确保未发育的幼虫为 同一批次出生的 试验结束时,计算跳虫的死亡率和繁殖率,并记录发育成熟和出生幼虫的个体数 8.5.3.2正式试验 8.5.3.2.1需要测试12个试验浓度以确定EC,如EC和半数效应浓度EC) 建议每个试验浓度至 少需2个平行样,空白对照需6个平行样 几何级数倍数系数取决于剂量-反应模型 8.5.3.2.2为确定NOEC/LOEC值,至少需要5个几何级数倍数关系的试验浓度 建议每个试验浓度 需4个平行样,空白对照8个平行样 浓度组间浓度几何倍数不得高于1.8 8.5.3.2.3可采用一种综合试验方法同时确定EC,NOEC/1.OEC 如采用此试验法,应至少需要8个 几何级数倍数关系的试验浓度 建议每个试验浓度需4个平行样,空白对照8个平行样 浓度组间几 何倍数不得高于1.8 8.5.3.2.4如预试验在最高浓度下即1000mg/kg土壤)未观察到显著效应,则可繁殖试验时进行限 度试验,使用1000mg/kg浓度和空白对照进行试验 限度试验可用以证明在限定的试验浓度内不会 产生显著的影响 处理组和空白组各需8个平行样
GB/T35522一2017 9 试验数据和报告 g.1试验数据处理 9.1.1繁殖量 繁殖量是一项主要的试验终点数据(如每个试验容器中幼虫的生产量) 统计学分析可采用方差分 析法,StudentT检验,Dunnett's检验或wiliam's检验 计算每个处理组的95%置信区间 9.1.2有效性 空白对照组的成熟个体存活数量是一项主要的有效性标准,应予以记录存档 在预试验中,所有其 他异常不良现象也应在最终报告中体现 g.1.3LC.(致死浓度)和C.(效应浓度 选用合适的统计方法如对数或威布尔(weibull)分布函数,Spearman-Karber修正法或线性内插 法,计算EC,,包括与之对应的95%置信区间上限值和下限值 EC，的值可以通过插人一个值到所建 立的方程式中r%所对应的值,为了计算EC或其他EC,通过试验数据建立回归方程来进行分析 半 数致死浓度则通常采用概率法进行计算,或通过其他考虑二项分布的死亡率数据的类似方法 g.1.4NoC/LoEC 9.1.4.1 如统计分析法旨在计算NOEC/LOEC,应对每个试验容器进行分别统计(单个容器均视为平 行) 一般情况下采用力<0.05的单侧检验方法检验受试物质与空白对照相比是否产生不良效应 9.1.4.2正态分布和方差齐性可通过合适的统计方法进行检验,如Shapiro-wilk检验和同质性检验 Levenetes1 st)(p<0.05),也可采用单因素方差分析法和多重比较分析 应用多重比较分析法(如Dun nett's检验)或递减趋势检验(如wiliam's检验法)计算对照组和不同浓度组之间是否存在统计学差 异(力<0.05) 否则可采用非参数方法(如依据Holm的BonferroniU检验法或Jonckheere-Ter erpstra 趋势检验)来计算NOEC/L.OEC g.1.5限度试验 g.1.5.1如开展了一项限度试验(仅一个空白对照组和处理组比较),且参数检验的前提正态性、方差 齐性)得到满足,则可采用！检验法分析测量值 如条件不满足,可应用welch'检验或非参数检验法 如Mann-whitney-U检验)等进行分析 g.1.5.2为了确定两个对照组(空白对照和溶剂对照)之间的统计学差异,可依据上述限度试验的分析 方法对空白对照的所有平行进行比较 如检验结果未显示统计学差异,则可将空白对照和溶剂对照的 数据混合一并考虑 否则应将各处理组与溶剂对照进行比较 9.2试验报告 最终报告应包括 a 检测机构 机构名称,地址; 试验主管和其他人员以及责任; 试验开始和结束的时间,即第一次染毒的日期和解剖日期 b)受试物
GB/35522一2017 -受试物质、批次、批号,CAs号和纯度等鉴别信息; 受试物质的理化性质(如分配系数,水溶性、蒸气压、亨利常数,最好有受试物质在土壤中 的环境行为试验数据); -受试物质的分子式,如受试物质不纯,还应包括杂质的成分 试验生物 试验生物的物种鉴定、供应商,试验生物的饲喂条件与虫龄范围描述 d 试验条件 试验设计和步骤的描述; 一试验土壤的详细制备过程;如采用天然土壤,则应详细说明(来源、背景、颗粒物大小分布、 pH值、有机物含量); 土壤田间持水量 -受试物质施用方法的详细描述 -试验条件的描述,光强度、昼夜明暗交替持续时间、温度; 饲喂方案描述,试验中使用饲料的种类和数量,饲喂日期 试验开始与结束时的土壤的pH值和含水量(空白组及处理组) -耿出跳虫的方式方法和取出效率的详细描述 试验结果 试验结束时的每个试验容器中的未成熟跳虫的数量; 试验结束时每个试验容器中的成熟跳虫的数量及死亡率(%); 观察到的生理或病理症状,或是特殊异常行为的描述; 参比物的试验结果; NoEc/L.OEC值,死亡率的Ic,,繁殖的EC,主要为LC,IC,EC和C),以及 95%置信区间 计算拟合曲线图,方程式和参数 对试验结果解释有用的观测值的所有信息; 假设检验的可信度; 试验过程中与本标准所发生的偏离以及试验过程中发生的任何异常情况描述 试验的有效性; 评估NOEC的最小检测差异
GB/T35522一2017 附 录 A 规范性附录) 测定土壤最大持水量 可用以下方法测定土壤最大持水量 详见IsO11268-2 A.1 A.2用合适的采样设备(螺旋管等)收集预定量(如5g)的试验土壤样本 用一张湿滤纸封住螺旋管底 部,将螺旋管放在架子上并置于水浴中 将螺旋管逐渐浸没人水,直至水面与土壤表层齐平 将螺旋管 在水浴中放置3h 由于并非所有被土壤毛细系统吸附的水分都能保留,应将螺旋管在密闭容器中置 于含水量极高的细研石英砂床上(防止干燥)2h 随后将样本称重在105C烘干至恒重 用式(A.1) 计算持水量(waterHoldingCapaeity,wHC),以干重百分比表示 一D WHC= ×100 (A.1 式中 wHc 持水量; S 水饱和基质质量十螺旋管质量十滤纸质量; 螺旋管质量十滤纸质量)皮重; D 基质层干重
GB/35522一2017 附录 B 资料性附录 测定土壤pH值 B.1采用以下方法测定土壤pH值,详见ISO10390. B.2在室温下将预定量的土壤干燥至少12h 悬浊液(至少含5只土壤样本)由5倍于土壤体积的 1nmol/1分析纯氯化钾或0.01mol/L的分析纯氯化钙溶液制成 充分震荡悬浊液达5nmin,然后静置 至少2h,但不可超过24h 使用pH计测定pH值 每次测量之前应使用适合的系列缓冲液(如pH4.0 和pH7.0)对pH计进行校准
GB/T35522一2017 录 附 规范性附录) 弹尾目跳虫试验的操作步骤和时间表 试验步骤和时间表见表C.1 表c.1弹尾目跳虫试验的操作步骤和时间表 时间 步骤 试验开始237 培养同批次的F./imetaria d26d 试验开始前14d 制备人工土壤(与干燥成分混合 确定人工土壤的pH值并进行相应调节 测试土壤的最大持水量 试验开始前9d~12d培养同批次的F: 属跳虫 .cadlidla 试验开始前2d一7d 十壤预湿润 试验开始前1d 将幼虫按批分配 如需使用溶剂,应制备贮备游液后施用受试物质 0d 如受试物质为固体化合物水溶性或需在土壤表面施用,应制备贮备液后施用受试物质 测试土壤pH值,将容器称重 添加饲料 引人弹尾目跳虫 试验第14天 fimearia预试验;试验终止,取出试验生物,测量土壤pH值和水分损失量(质量》 正式试验;测量湿度,补充水分,添加2g一10g酵母粉 试验第21 正式试验;试验终止,取出试验生物,测量土壤pH值和水分损失量(质量) 天 ietaria 属跳虫的预试验;试验终止,取出试验生物,测量土壤pH值和水分损失量(质量) F.candida 试验第28 天 R,candlil ，属跳虫的正式试验;试验终止,取出试验生物,测量土壤pH值和水分损失量(质量) 0
GB/35522一2017 附录D 资料性附录) F.fimetaria与r.eandida跳虫的喂饲与同步饲养指南 D.1导则 D.1.1应核查每批特定品系的弹尾目跳虫的出生时间,以保证未成熟的幼虫有足够的同步生长时间 -般来说,成熟的跳虫产卵后转移至新鲜的营养物质中,虫卵孵化时间确定了跳虫出生的日期,收集同 批次的幼虫 D.1.2推荐使用含50个容器/培养皿的永久贮备培养基 贮备培养基应具备良好的饲喂条件,每周应 投人新鲜饲料和水,并取出过期的饲料与死虫残骸 少量的跳虫在基质中培养可能会因为霉菌过多而 生长收到抑制 如果贮备培养基内虫卵孵化过于频繁,将会使培养基失去养分 培养基养分贫乏的迹 象包括成虫死亡,基质层长霉 同批次动物在繁殖后所余的虫卵可用于恢复培养基的养分 D.1.3在F.fimetaria的同批次培养基中主要通过虫体的大小来区分雄虫与雌虫 相比雌虫,雄虫个 头要小许多,移动速度也更快 准确挑选雌雄跳虫无需经过许多练习,使用显微镜检查虫体的生殖器部 位即可辨认性别 D.2饲养 D.2.1制备培养基 培养基成分为石膏粉(硫酸钙)加活性炭 使用之前将基质混合 这种培养基具有潮湿的基质层 而话性炭则可以吸收产生的废气和排泄物 使用不同类型的活性炭以便于对跳虫进行观察 比如,粉 末状活性炭即可用于观察F./imearia 跳虫和F.candida跳虫(会产生黑色/灰色的石膏粉). 培养基基质层的成分主要有 20mL活性炭， 200ml蒸馏水; 200mL石膏粉 或 50g活化粉末状活性炭; -260ml300mL蒸僧水; -400g石膏粉 D.2.2饲喂 将跳虫置于容器中,如大小为90mm×13mm的培养m 平皿底部覆盖一层0.5cm厚的石膏/活 性炭基质层 跳虫在20C士1C、以及各为12h的明暗交替周期(光照强度为400lx~800lx)条件下 进行培养 时刻保持容器的湿润,使容器空气的相对湿度保持在100% 石膏的疏松空隙中含有游离 水,可确保相对湿度的恒定,但需要避免游离水在石膏表面产生一层覆水膜 保持试验环境空气的湿 度,可以防止水分的流失 死虫残骸和发霉的饲料应从容器中彻底移除 为刺激成虫产卵,需将成熟的 跳虫移人新制备的石膏/活性炭培养基中 1
GB/T35522一2017 D.2.3饲料来源 将磨碎的烘干的颗粒状酵母粉作为F.fimetaria跳虫和F.candid跳虫的唯一食物来源 每周一 次或两次投放新鲜饲料,应防止饲料长霉 将饲料成小块的方式直接投放在石膏粉上 应根据跳虫的 15 大小和数量调节酵母粉的投放量,但一般情况下2mg mg即已足够 D.3同步性 D.3.1同步性;应使用同一批次、同种,同龄,大小相近的试验动物 而且,同步生长可有助于在虫龄达 到三周以后通过第二性征(如个体大小)正确辨识F.fimetaria的雌雄性别 根据以下所列建议获得同 批次同种,同龄、大小相近的试验动物(操作步骤可任选) 同步步骤如下 准备试验容器,容器底部铺一层0.5cm厚的石膏粉/活性炭混合物 -从生长情况最佳的的具有4周~8周龄的15个20个培养皿中选出150个200个成熟的 F./imetauria跳虫和50个100个F.candid跳虫到新的容器中以备产卵,并饲以15mg烘 干的酵母粉 不要将未成熟的跳虫和成熟的跳虫一起培养,因为未成熟的跳虫可能会对成熟 的跳虫产卵产生抑制作用 保持培养温度为20C土1c(平均温度应为20C),昼夜交替周期各12h(光照强度为400lx一 800lx) 确保新鲜饲料的供应,空气湿度达到饱和 饲料不足可导致试验动物在产出的卵上 排粪,从而导致虫卵生霉,F.candda甚至还会吞食自己的产卵 产卵10d后用针和铲小心收集虫卵,将虫卵转移至浸溃了石膏粉/活性炭悬浮液的小张滤纸 片上,并放置于铺设了新鲜炭泥/活性炭基质层的容器中 向培养基中投放少量的酵母粉以诱 使未成熟的跳虫离开虫卵收集滤纸片 应保持滤纸和培养基的湿润,否则虫卵会发生脱水 另 个方法是在成熟的跳虫产卵2d或 d或3d后,将成熟的跳虫从培养箱中移出 3d后,滤纸片上大多数的虫卵都已孵化,部分幼小的可能仍留在滤纸片上 为获得虫龄相同的幼虫,可用锁子将载有未孵化的卵的滤纸从平皿中取出 平中保留虫龄 为0d一3d的未成熟的跳虫,饲以酵母粉 弃去未孵化的卵 采用和培养成熟的跳虫相同的方式来培养卵和孵化出的幼虫 F.fimnetaria还需特别采取以 下措施:保证足量的新鲜饲料,移去过期生霉的食料，一周后如培养m中幼虫个体密度超过了 200个,应当将多余的幼虫分开到新培养皿中 D.3.2试验开始时对跳虫的处理 收集9d~12d虫龄的F.candida或23d~26d虫龄的F.fimetaria,并释放到铺设了潮湿灰 泥/活性炭基质层的容器中 双目显微镜检查试验生物,剔除带伤或不完整的虫子 应保证 跳虫始终处于潮湿的环境中,比如将弹尾目跳虫置于水湿过的表面,以避免干燥 将容器朝上,敲击使跳虫落人土壤 静电荷应保持中性,否则跳虫会被吸人空中或卡在容器边 缘变干死亡 可在容器下方放置电离剂或湿布,以保持静电荷的中性 投放的饲料应均匀遍布土壤表面,不要只是放作一堆 在转移和试验过程中应避免撞击容器,否则会对试验容器造成物理性扰动 这种扰动可能会 压紧土壤而妨碍跳虫与土壤的相互作用 D.4其他可选的弹尾目跳虫品种 根据标准要求,也可挑选其他弹尾目跳虫物种,如Proisooaminua、Isotomairidis、Isotomad yohiurusdom iuruskimi、Orth. 和Me a,Orchesella.cincta,Sinellacuruisela、Pa" anEe rmnywhia homnyc 12
GB/35522一2017 saphoruramacrochaeta 在使用其他品种的跳虫时应满足以下条件 对这些物种加以明确鉴别 提供挑选这些品种的合理理由; 确定这些物种的繁殖生物学特性,包括试验阶段,因为它可能在暴露期间是一个潜在的影响 因素; 有已知生命史;成熟时的虫龄、孵化持续期、暴露期的龄期; 应有充分的试验培养基和饲料供应以确保生长和繁殖的最佳条件; 差异性应尽可能低,满足毒理学评估的精确和准确度 13
GB/T35522一2017 附 录 规范性附录) 试验动物的收集与计数 E.1收集方法 E.1.1方法一是利用温控型梯度提取器 由安装在提取箱顶部的加热元件(通过放置在土壤样本表面 的一个电热调节器来调节温度)提供热能 在采集箱(安装在土芯下方)表面安装一个电热调节器,可调 节采集容器周围冷却液体的温度 将电热调节器与一个可根据预设程序提高温度的控制单元相连 收 集试验动物,放进冷却后的采集箱内(2 ,箱底部铺设一层石膏粉/活性炭基质层 温度达到25C时 开始进行收集,每隔12h温度自动升高5C,收集过程共持续48h 达到40C12h后,收集结束 E.1.2方法二是在孵化试验期后,采用浮选法评估弹尾目幼虫的个体数 为此试验容器的容量应达到 约250mL 在试验结束时添加约200mL去离子水 用一个刷子轻轻搅动土壤,使跳虫上浮至水面 可向水中加人约0.5ml黑色Kentmere摄影用染液,使白色跳虫在水面显示更为明显,方便计数 E.2计数 可在浮选容器上方放置一个格棚,通过肉眼或在光学显微镜下进行计数 也可拍下容器表面的照 片,放大冲印后、或在投影仪幻灯片上读取计数 也可采用数字影像处理技术进行计数 所有的技术均 需经过验证 14

化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验GB/T35522-2017分析

近年来，随着人类社会进步和工业化程度的不断提高，环境污染问题日益突出。其中，化学品对生态环境产生的影响引起了广泛关注。在这些化学品中，农药、杀虫剂等农用化学品的使用量日益增加，它们对土壤和土地生态系统造成的危害也越来越明显。因此，对于这些可能对土壤生态系统产生影响的化学品，需要进行生物毒性测试来评估其对环境的潜在危害，从而降低它们的使用量或禁止使用。 GB/T35522-2017是我国土壤弹尾目昆虫生殖试验的标准，也是一种重要的土壤生物毒性测试方法。该标准规定了土壤弹尾目昆虫生殖试验的测试方法、用途、原理、试验材料与设备、试验操作、数据处理和质量控制等方面的内容。其中，实验操作中化学品处理是试验的关键步骤之一。 在化学品处理试验中，研究人员需要选择合适的化学品浓度和处理时间，并通过一系列的指标评价处理后土壤弹尾目昆虫的生殖能力、代谢能力和神经功能等方面。如果处理后土壤弹尾目昆虫的生殖能力、代谢能力和神经功能等方面受到严重影响，表明该化学品对土壤生态系统的危害程度较高，应当加强限制或禁止使用。 总结来说，GB/T35522-2017标准下的化学品土壤弹尾目昆虫生殖试验是一种十分重要的生物毒性测试方法。通过对化学品对土壤弹尾目昆虫的生殖能力、代谢能力和神经功能等方面进行评估，可以更好地评估化学品对环境的潜在危害，从而实现对环境的保护和控制污染的目的。

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