莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法

莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法

国家标准 GB/T23814一2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 Protocolofthepolymerasechainreaetionfor deteetingkidneybeanscomponentsinlotusfoods 2009-05-27发布 2009-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T23814一2009 莲蓉制品中芸豆成分定性PCR检测方法 范围 本标准规定了莲菩制品中芸豆成分的定性CR检测方法 本标准适用于由莲蓉制品半成品和成品中芸豆成分的定性检测 本标准的检出限为0.5g芸豆DNA. 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696:1987,MOD) GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 术语和定义 GB/T19495.1确立的术语和定义适用于本标准 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T19495.2中的规定执行 抽样和制样 按照GB/T19495.7规定的方法执行 测定方法 6.1原理 样品经DNA提取后,针对芸豆特异基因序列设计引物,通过PCR技术,特异性扩增芸豆基因的 DNA片段,根据PCR扩增结果,判断该样品中是否含有芸豆成分 6.2试剂和材料 除另有规定外,所用试剂为分析纯或生化试剂,水为按照GB/T6682规定的一级水 6.2.1引物;检测莲蓉制品内源基因和芸豆特异基因的引物及其信息见表1 表1莲蓉制品内、外源基因所需的引物信息 R产物大小 检测基因 引物序列 基因性质 适用范围 bp 正;5’'-GTAGAATCGGCACTGGAGGTAG3’ 莲蓉制品 NNEA0732 142 子特异基因 反5'cATGGGcTAAccAAcTAGAcAGc3" 正:5-CAGACATTTCATATCCAGGGAGG3" AB070627 194 芸豆特异基因 莲蓉制品 反;5-TGAATTGTAcGGTGAAGGATGG3’
GB/T23814一2009 .2. 琼脂糖;电泳纯 6 6 .2. .3 Tris饱和酚 6.2.4三氯甲炕 6.2.5冰乙股 .2. 6 无水乙醉 R27师发林 6.2.8异丙醉 6.2.9氢氧化钠(NaoH). 6 2.10盐酸(HCI) 8.2n三系甲基氨基甲枕(Ti) 6.2.12乙二胺四乙酸钠盐(NaEDTA. 6.2.13蔗糖 6.2.14溴酚蓝 6.2.15乙酸钠(NaAe). 6.2.16苯盼十三氯甲烧十异戊醉(25十24十1,体积比) 6.2.17三叙甲梳十异度醉(24十1,体积比. 6.2.183nmol/L乙酸钠:3mol/L乙酸钠溶液,乙酸调节pH为5.2 6.2.19 TAE电泳缓冲液;取50×TAE(242【Tris.57 1ml冰乙酸,100ml.0.5molL 1× NaEDTA,用C或NaO调节pH至8.0,定容至1L)按比例稀释 6.2.20TE缓冲液;Tris0.01nmol/L,NaEDTA0.001mol/L,用Hc或Na(oH调节pH至8.o 6.2.21PCR试剂盒;Taq酶,dNVTPs,10XBufer氧化镁(MgCl.) 6.2.22上样缓冲液;0.25%澳酚蓝,40%(质量浓度)蔗糖溶液 6. .2.23澳化乙锭溶液;lmg/mL .2.2470%乙醇 6. 6 .2.25等效DNA提取试剂盒 6.2.26DNA分子质量标准品(50bp) 6. .3 主要仪器 6 3.1PCR热循环仪 .3.2电泳仪 6 6 .3.3凝胶成像系统 离心机:12000r/min 6. .3. 6. .3. 5 涡旋振荡器 6. .3. .6 分析天平;0.1g 6 .3.7微量可调移液器;0.5L.2nL,10AL20L,l00L.200nL,1000 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 6. .3. .8 6.4检测步骤 6.4.1模板NA的提取 6.4.1.1对照设置 阳性对照;莲子基因组DNA,芸豆基因组DNA 阴性对照:已知以不含该基因的样品提取的DNA 空白对照:双蒸水(ddH.O) 6.4.1.2DNA提取步骤 样品DNA提取时设双平行; a
GB/T23814一2009 b将样品粉碎,取适量样品,加人400LTE缓冲液(6.2.20),将沉淀完全溶解; 加人与溶液等体积苯盼十三氯甲烧十异戊醉(25十24+1)(6.2.16),重复混匀l01 c 1min d 12000r/min室温离心10min,将上清液转移至另一干净的1.5ml离心管中 加人与上清液等体积三氯甲烧十异戊醇(24+1)(6.2.17),重复混匀10 e min f 12000r/min室温离心10min. ,小心吸取上清液; 加人上清液1/10体积3mol/L乙酸钠(6.2.18),加人2倍2.5倍体积经一20C预冷的无 g 水乙醇(6.2.6),颠倒混匀后一20C静置1h;或加人等体积异丙醇(6.2.8),混匀后室温静置 10min; h)15000r/min,室温离心10min,弃去上清液; iD 70%乙醇(6.2.24洗涤沉淀2次~3次,干燥DNA; 50L0.1×TE(6.2.20)溶解沉淀,4C保存 也可以用等效DNA提取试剂盒(6.2.25)提取样品DNA,按试剂盒操作说明书指示操作 6.4.2NA质量的测定 样品中提取的DNA质量的测定用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计(6.3.8)进行测定 取适量DNA溶液加TE缓冲液(6.2.20)进行稀释,用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计分别检测 260nmm和280nmm处的吸光值A和An DNA的浓度按式(1)计算 c=A×N×50/1000 1) 式中: -DNA浓度，4g/L -260nm处的吸光值 N 核酸稀释倍数 当A/A比值在1.4以上时,可用于PCR扩增,1.7一2.0之间时,PCR扩增效果好 6.4.3PCR扩增 6.4.3.1PCR反应体系 检测样品内、外源基因的PCR反应体系见表2 每个反应体系应设置两个平行反应 同时设置阳 性对照、阴性对照和空白对照 表2PCR反应体系 加人CR反应体系的体积 试剂名称 贮备液浓度 AL l0×PCRBuffer 2.5 Mg(Cl 25mnol/I 2.5 dNTP 2.5mmol/1 2.0 正:0.25 Primers 20pmol/wl 反:0.25 Tag 5U/ 0.15 /al Template 0.2 0.14g/nl 2g/l ddH,O 补足反应体系总体积为25 PCR反应循环参数 见表3
GB/T23814一2009 表3各基因检测PCR反应条件 基因 变性 扩增 循环数 后延伸 94C/30s 94C/5nmin 58/30s 35 72C/5minm 莲子特异基因 72C/30s 94C/30s 35 芸豆内源基因 94C/5min 56C/30s 72/5minn 72C/30s 6.4.4PCR扩增产物电泳检测 将适量的琼脂糖(6.2.2)加人1×TAE缓冲液(6.2.19)中,配制成浓度为2%质量浓度)的溶液， 加热溶解,然后加人澳化乙锭溶液(6.2.23)至终浓度0.54g/mL混匀稍适冷却后,倒人电泳板上,插 上梳板,室温下凝固后,放人盛1×TAE缓冲液的电泳槽中,轻轻垂直向上拔去梳板 在每个泳道中加 人适量的PCR产物与上样缓冲液(6.2.22)的混合液(10L20ALPCR产物与上样缓冲液2混 合),其中一个泳道中加人DNA分子质量标准品(6.2.26)5L,接通电源电泳,按2V/cm的电压电泳 至嗅酚蓝迁移至3 cm~5cm处结束 凝胶成像仪观察并分析记录 6.4.5结果分析 6.4.5.1莲蓉内源基因的检测 用针对莲蓉内源基因设计的引物对样品DNNA提取液进行PCR扩增,阳性对照和待测样品均应被 扩增出142bp的PCR产物,阴性对照和空白对照应不能扩增得到相应的PCR产物 如待测样品未见 有该CR扩增产物,则说明DNA提取质量有问题,或DNA提取液中有抑制CR反应的因子存在,应 重新提取DNA,直到扩增出该PCR产物 6 芸豆基因的检测 4.5.2 对样品DNVA进行芸豆内源基因的PCR扩增,如果阴性对照和空白对照未出现扩增条带,阳性对 照和待测样品均出现预期大小的扩增条带(扩增片段大小194bp),则可初步判定待测样品中含有可疑 的芸豆成分,应进一步进行确证实验,依据确证实验的结果最终报告;如果待测样品未出现PCR扩增产 物,则可断定待测样品中不含有芸豆成分 6.4.6确证实验 当PCR检测结果为阳性时,可通过酶切的方法或其他方法(如测序比对,序列参见附录A)进行 确证 PCR产物的限制性内切酶酶切分析; 用内切酶Apal对PCR扩增产物进行酶切分析,阳性样品酶切片段大小为81bp和103bp. 推荐酶切体系为50L,PCR扩增产物20L,酶用量为2U,酶切温度和时间为37C30min,电泳 方法参见6.4.4 结果表述 7.1芸豆特异基因片段得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,表明样品中检测出芸豆成分 结果表述为“样品中检测出芸豆成分,阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常” 7.2莲蓉内源基因片段得到扩增,且扩增片段大小与预期片段大小一致,而芸豆特异基因片段未得到 扩增,或扩增片段大小与预期片段大小不一致,表明样品中未检测出芸豆成分，结果表述为“样品中未检 测出芸豆成分,阴性对照、阳性对照及空白对照检测结果正常”
GB/T23814一2009 附 录A 资料性附录 扩增片段序列 A.1芸豆特异基因扩增序列(194bp CAGACATTTcATATcCAGGGAGGAACATGCTATTcGTTTGGCGAAGACTA TGGACGATCAGAATTAAAGGGTGGTGGGGcCCATAAGTTTGATCAGCATG cTGTTTGGACTGTAAACAAACACAGGTAGCAGCATCACTcGCAGTcCTcGT TGTCACCTcCAcGCAGATAGcGCCATcCTTCAccGTACAATTCA .2 莲子特异基因扩增序列(142bp A. GTAGAATcGGCACTGGAGGTAGccGGCCAGGTGGCAGGTACATCAGTATc AACCTCACCCCTTCCGTATAGTGCCATGGCAAGCCAATGTGAGGCCCTAG GCACAGGAACAAGGAAGAAGCTGTCTAGTTGGTTAGCCcCATG