GB/T19495.4-2018
转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法
Detectionofgeneticallymodifiedorganismsandderivedproducts—Qualitativereal-timepolymerasechainreaction（PCR）methods
- 中国标准分类号（CCS）B16
- 国际标准分类号（ICS）65.020.01
- 实施日期2019-04-01
- 文件格式PDF
- 文本页数20页
- 文件大小1.05M
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转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法
国家标准 GB/T19495.4一2018 代替GB/T19495.4一2004 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR 检测方法 Deteetionofgeneticalymodiifiedorganismsandderivedproduets- Qualitativerea-tiepolymerasechainreaction(PCRmethods 2018-09-17发布 2019-04-01实施 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会国家标准
GB;/T19495.4一2018 前 言 GB/T19495《转基因产品检测》分为如下几部分 GB/T19495.1转基因产品检测通用要求和定义 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求; GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法; GB 19495.4转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR)检测方法; 19495.5转基因产品检测实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测方法; GB/T19495.6转基因产品检测基因芯片检测方法; GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法; GB/T19495.8转基因产品检测蛋白质检测方法 GB/T19495.9转基因产品检测植物产品液相芯片检测方法
本部分为GB/T19495的第4部分
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草
本部分代替GByT19495.4一2004《转基因产品检测核酸定性R检测方法》
与GB/T19495.！ ao相比.,除雏辑性修改外,主要技术变化如下 增加了植物内源基因的检测方法; 增加了转基因植物筛选基因的检测方法; 删除了结构基因检测方法,增加了大豆、玉米、油菜籽、棉花、水稻、马铃薯、亚麻和甜菜等作物 的品系特异性检测方法
请注意本文件的某些内容可能涉及专利
本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任
本部分由全国植物检疫标准化技术委员会(SAc'/Tc271)提出并归口
本部分主要起草单位;检验检疫科学研究院、山东出人境检验检疫局、中华人 民共和国上海出人境检验检疫局、深圳出人境检验检疫局、辽宁出人境 检验检疫局
本部分主要起草人;黄新、高宏伟,李想,凌杏园、朱水芳,陈洪俊、潘良文、曹际娟,章桂明
本部分所代替标准的历次版本发布情况为: GB/T19495.4一2004
GB;/T19495.4一2018 转基因产品检测 实时荧光定性聚合酶链式反应(PCR 检测方法 范围 GB/T19495的本部分规定了植物及其加工产品中转基因成分筛选和品系检测实时荧光定性聚合 酶链式反应(PCR)检测方法有关的仪器设备、试剂和材料、检测步骤、质量控制、防污染措施以及方法的 最低检出限
本部分适用于大豆、玉米,油菜,水稻、棉花、马铃薯,亚麻、甜菜、首,番茄、木瓜、苹果,菊苣,剪股 颖、烟草、李子甜瓜、小麦、茄子和校树等植物转基因筛选检测,也适用于大豆、玉米、油菜、棉花、水稻、 马铃薯、亚麻、甜菜和木瓜等植物的品系特异性检测
规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求 GB/T19495.3转基因产品检测核酸提取纯化方法 GB/T19495.7转基因产品检测抽样和制样方法 GB/T27403实验室质量控制规范食晶分子生物学检测 术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件
3.1.1 转基因transgene 将物种本身具有的或来源于其他物种的功能DNA序列,通过生物工程技术,使其在该物种中进行 转录或表达,以便使该物种获得新的品种特征的技术
3.1.2 实时荧光PCRrenltimepolymeraseehainreaectom 实时荧光聚合酶链式反应
在聚合酶链式反应体系中加人荧光基团,利用荧光信号积累实时监测 整个PCR进程,并通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
注荧光信号的强弱直接反映模板数量
3.1.3 内源基因endogenousgene 在检测物种中拷贝数恒定的、不显示等位基因变化的基因
注该基因可用于判定物种特异性
GB/T19495.4一2018 3.1.4 外源基因exogenosgene 利用生物工程技术转人的其他生物基因
注:转人外源基因后,该生物品种表现新的生物学性状 3.1.5 Ct值eyclethreshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阔值时所经历的循环数
3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件
AIfalfa-Ace;首瘤乙酰辅酶a梭化酶(AIfalfaAcetylCoAcearboxylase) BAR:磷化麦黄酮乙酰转移酶基因(phosphinothrieinacetyltransferasegene p;碱基对(basepair CP4-EPSPs;农根菌CP4蛋白基因和5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(Agrobacteriumtumefaciens trainCP4Produet:herbicidetolerantformof5-enolpyruvulshikimate-3phosphatesynthase CryIAc);苏云晶芽抱杆菌杀虫蛋白CryIAc)基因[BaellusthuringiensisBtsubsp. KurstakierystalproteinIA(e)刀 Cry3A:苏云晶芽抱杆菌杀虫蛋白Cry3A基因[BaeillusthuringiensisBtsubsp.Tenebrionis erystalprotein3A CTAB;十六炕基三甲基澳化铵(cetyltrithylammoniumbromide) DNA;脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid) dATP;脱氧腺苷三磷酸(deoxyadenosinetriphosphate) dC'TP;脱氧胞苷三磷酸(deoxycytidinetriphosphate) dGTP;脱氧鸟苷三磷酸(deoxyguanosinetriphosphate dNTP;脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleosidetriphosphate UTP;脱氧尿苷三磷酸(deoxyuridinetriphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamt inetetraaceticaeid) EPSPS:5-莽草酸-3-磷酸合成酶基因(5-enolpyruvylshilkimatc-3-phosphatesynthasegene) G.AG56;一种醉溶蛋白基因 oneoY-gliadingenes G L.uA3;大米谷蛋白基因(rieeglutelingene) GOX草甘麟氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene) LAT52:花粉特异蛋白LAT52基因 L.ectin:植物凝集素基因 NPT I ;新霉素-3'-磷酸转移酶基因(neomycin-3'-phosphotransferasegene) PAT:草丁麟乙酰转移酶基因 phosphinothricinacetyltransferasegene PCR:聚合酶链式反应(polymerase chainreaction ly PL.D;磷脂酶D家族基因 DhosDholip ipase fam gene PNM:6-磷酸甘露糖异构酶基因( phosphomannose-isomerasegene promoterfromcaulifowermosaicvirus) CaMV35S;花椰菜花叶病毒35S启动子(35S fromamo pFMV35S:玄参花叶病毒35S启动子(35Spromoter odifiedfigwort mosaicvirus from DNOS;来源于农杆菌的胭脂碱合成酶基因启动子promoterof nopalinmesynthase gene teriumtumefaciens Agrobac pSSuAra:来自拟南芥的小亚基启动子(the smallsubunitpromoter ofArabidopsis)
GB;/T19495.4一2018 TA29来源于烟草的花哉特异性TA29基因的发育调节启动子(deelbopmcnalyregxwauted pro moterfromantherspecifieTA291 genefromNieotianatabacum) pUbi;玉米泛素基因的启动子(promoterofmaizeUbiquitin SAH7;类拟兰芥属同源序列7的棉花内源基因(sinapisarabidopsishomolog7gene) SDS:十二烧基磺酸钠(se sodiumdodeeylslfate) SPS,蔗糖磷酸盐合成酶基因(s sucrosephosphatesynthasegene Tag:DNA聚合酶TagDNApolymerase) TE:三胫甲基氨基甲烧盐酸盐、乙二胺四乙酸二钠缓冲液(Tris-HC1,EDTAbufer) tE9:为来源于豌豆二磷酸核酮糖梭化酶基因的终止子 Tris:三(胫甲基)氨基甲婉[t tris(hydroxymethyI aminomethane] g7:谷氨酰胺转移酶7基因(transglutaminase7gene) NOs;来源于农杆菌的胭脂贼合成酶基因终止子(terminatorofnopalinesynthasegenefrom Agrobacteriumtumefaciens tOCS;章鱼碱合成酶终止子(terminatorofoetopinesynthase mosaicwiru、35teminator t35S:花椰菜花叶病毒终止子(Cauliflouer" UDG;尿唁哧DNA-糖基酶(uracilDNAglycosylase) UGPase:马铃薯UDP葡萄糖焦磷酸化酶基因(UDPglucosepyrophosphorylasegenefrom Solanumtadberosum UNG酶;尿密唁-N-糖基化酶(uracilN-glycosylase wx012;小麦蜡质基因(waxywheatgenes) 2ssIb玉米淀粉合成酶b亚基[theendosperm=speeificss(starchsynthase)I] 18srRNA;真核生物核糖体小亚基18S基因(18SribosomalRNA 方法原理 提取样品DNA后,通过实时荧光PCR技术对样品DNA进行筛选检测,根据实时荧光PCR扩增 结果,判断该样品中是否含有转基因成分
对外源基因检测结果为阳性的样品,或已知为转基因阳性的 样品,如需进一步进行品系鉴定,则对品系特异性片段进行实时荧光PCR检测,根据结果判定该样品中 含有哪(些)种转基因品系成分
仪器设备和试剂 5.1仪器设备 5.1.1实时荧光PCR仪
5.1.2样品粉碎仪或研磨机 5.1.3天平;感量0.01g
5.1.4水浴锅或恒温孵育器 5. 冷冻离心机
1. 5.1.6高压灭菌锅
5.1.7祸旋振荡器 5.1.8生物安全柜 5.1.9pH计
5.1.10核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计
5.1.11微量移液器(2AL10AL、.100L,200AlLl000AL
GB/T19495.4一2018 5.2主要试剂 除特别说明外,所有试剂均为分析纯或生化试剂,实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格
5.2.1实时荧光PCR预混液 为TaqDNA聚合酶(5U/L)、PCR反应缓冲液、MgCL.(3mmol/几一7mmol/L),dNTPs(含 dATP,dUTP,dCTPdGTP)、UNG酶等混合配制的溶液
5.2.2ROX 荧光校正试剂(50×,使用时稀释至1×)
5.2.3引物和探针 5.2.3.1筛选检测引物探针 筛选检测基因的引物和探针参照附录A中表A.l的序列合成,加超纯水配制成100mol/L储备 液,实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10mol/L
5.2.3.2品系特异性检测引物探针 根据需要检测的转基因植物品系,参照附录B中表B.1的序列合成引物和探针,加超纯水配制成 00mol/储备液,实时荧光PCR扩增的引物和探针工作液浓度为10Mmol/I. o 检测步骤 6.1取样和制样 按照GB/T19495.7中规定的方法执行
6.2样品DNA的提取与纯化 按照GB/T19495.3的方法或采用具有相同效果的植物基因组DA提取试剂盒进行DNA提取
每个样品应制备2个测试样品提取DNA(提取平行重复)
6.3DNA浓度测定和定量 按照GB/T19495.3中规定的方法执行
6.4实时荧光PCR检测 6.4.1转基因成分筛选检测基因的选择 对于未知是否为转基因产品的样品,按照表1选用筛选基因进行检测 表1转基因筛选检测基因选用 物种 选用基因 内源基因，CaMV35S，pFMV35s，tNOS,BAR,PAT，GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4 大豆及其加工品 EPSPS,tE9 内源基因,pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTI,BAR,PAT,(GOX,CP4-EPSPS,CTP2-CP4 玉米及其加工品 EPSPS,Cry3A,CaMV35S,PMI,CryIA(b),CRYIAe) eEactin )pRe
GB;/T19495.4一2018 表1(续 物种 选用基因 内源基因,p(CaMV35s,pFMV35S,tNOs,NPTI,BAR,PAT,GoX.,CP4-EPsPs.cTP2-CP4 油菜及其加工品 EPsPs,pNOs,psSuAra,pTA29,CaMV35s,E9,Ocs, S,tg？7 水稻及其加工品 内源基因,CaMV35S,tNOS,BAR,CryIAb),CRYIA(e 内源基因，CaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTI，BAR,PAT,CP4-EPSPS,pUbi,tE9 棉花及其加工品 CryIA(b),CRYIA(e 马铃薯及其加工品 内源基因CaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTIl,CP4-EPSPS.Cry3ApNOS 亚麻及其加工品 内源基因,caMV35s,pFMV35s,tNGs,NPI 甜菜及其加工品 内源基因,CaMV35S,pFMV35S,tNOs,NPTl,PAT,CP4EPsPs,cIP2CP4EPsPs 首及其加工品 内源基因,pFMV35Ss,cTP2-CP4-EPSPS,tE9y 番茄 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT,CRYIA(e' 苹果 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT 菊苣 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,BAR,NPT 剪股颖 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,CP4-EPSPS 35s,pFMV35s,tNOs,NPT 烟草 CaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT 李子 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT 甜瓜 木瓜 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT pCaMV35s,pFMV35S,tNOS.CP4-EPSPs 小麦 茄子 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPTI,CRYIAe 校树 pCaMV35S,pFMV35S,tNOS,NPT ll 6.4.2实时荧光PCR反应体系 实时荧光PCR反应体系配制见表2
每个样品设置2个平行重复
表2实时荧光CR检测体系 名称 储液浓度 终浓度 10×PCR缓冲液 0× MgCl 25mmol/1 2.5mmol/1. NTP(含dUTP) 2.5mmol/1 0.2mmol/1 0.075U/ UNG酶 5U/L /l 上游引物 10Amol/I 见表A.l、表B.1 下游引物 10Amol/I 见表A.1、表B.1 10Amol/1 探针 见表A.l、表B.1 Taq酶 5U/L 0.05U/L
GB/T19495.4一2018 表2(续 名称 储液浓度 终浓度 DNA模板 50ng250ng 超纯水 补足至25Al 注1:可选用含有PCR缓冲液、Mg(Cl,dNTP和Ta酶等成分的基于Taqman探针的实时荧光PCR预混液进行 实时荧光CR扩增
注2;ROX荧光试剂仅在具有Rox校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加,否则用超纯水补足
注3;反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整
6.4.3实时荧光PCR反应程序 实时荧光PCR反应参数为:50C/2min;95C/10min;95C/15s,60笔/60s,40个循环
注:95C/10min的专门适用于化学变构的热启动Ta酶
以上参数可根据不同型号实时荧光PCR仪和所选 PCR扩增试剂体系不同作调整 6.4.4仪器检测通道的选择 将PCR反应管或反应板放人实时荧光PCR仪后,设置PCR反应荧光信号收集条件,应与探针标 记的报告基团一致
具体设置方法可参照仪器使用说明书
6.4.5实验对照的设立 实验设置如下对照 阳性对照,为目标转基因植物品系基因组DNA,或含有上述片段的质粒标准分子DNA 阴性对照,相应的非转基因植物样品DNA; 空白对照,设两个,一是提取DNA时设置的提取空白对照(以双蒸水代替样品),二是PCR反 应的空白对照(以双蒸水代替DNA模板)
结果判定 7.1质量控制 下述指标有一项不符合者,需重新进行实时荧光PCR扩增
-空白对照:内源基因检测Ct值>40,外源基因或品系特异性检测Ct值之>40 -阴性对照;内源基因检测Ct值<30,转化事件特异性检测Ct值>40 阳性对照;内源基因检测Ct值<30,转化事件特异性检测Ct值<35
7.2结果判定 测试样品外源基因检测Ct值>40,内源基因检测Ct值<30,则可判定该样品不含所检基因或 品系
测试样品外源基因检测Ct值<35,内源基因检测Ct值<30,判定该样品含有所检基因或品系
测试样品外源基因检测Ct值在35一40,应调整模板浓度,重做实时荧光PCR
再次扩增后的外源 基因检测C值仍在35~40,则可判定为该样品含有所检基因或品系
再次扩增后的外源基因检测Ct 值>40,则可判定为该样品不含所检基因或品系
GB;/T19495.4一2018 结果表述 结果为阳性的,表述为“检出×××外源基因”或“检出×××转基因品系” 结果为阴性的,表述为“未检出×××外源基因”或“未检出×××转基因品系” 对于核酸无法有效提取的样品,检测结果为“未检出核酸成分” 防污染措施 检测过程中防止交叉污染的措施按照GB/T27403和GB/T19495.2中的规定执行
0最低检出限 各基因片段的实时荧光PCR扩增的最低检出限(LOD)为0.01%
GB/T19495.4一2018 附 录 A 资料性附录 转基因成分筛选检测实时荧光PCR引物和探针 转基因成分筛选检测用引物探针序列见表A.1
表A.1转基因成分筛选检测实时荧光CR引物和探针序列信息表 终浓度 产物大小 序号 适用范围 基因/品系名称 引物/探针序列(5'-3 nmol/1 bp cctgagaaacggctacea 400 18srDNA 65 植物内源基因 400 cgtgtcaggattgggtaat FAM-tgcgcgcctgctgccttcct-BHQ1 200 400 ggtcgtcctcctaaggcgaaa 99 HIMGI/Y 400 cttcttcggcggtcgtccac FAMeggagccacteggtgccgcaaett-BHQ1 200 油菜内源基因 ggccagggtttccgtgat 200 CruA cegtcgttgtagaaccattgg 200 101 -BHQ1 FAMagtcettatgtgctcacttetggtgea1 200 300 Ggtcgtttcccatctcttcctcc aadh1l 300 135 ccactccgagaccctcagtc FAM-aatcagggetcattttctcgctcetca-BHQ1 200 玉米内源基因 500 ctcccaatcctttg tgacatctgc 2SSIb tcgatttctctcttggtgacagg 500 151 FAM-agcaaagteagagcgctgcaatgea-TAMRA 200 cetcctcgggaaagttacaa 150 15o 74 Lectin R gggcatagaaggtgaagt FAM-ccctegtctcttggtegegccctct-BHHQ1 50 大豆内源基因 200 cacctttctcgcaccaattgaca R L.eetin-KVM 200 104 caaactcaacagcgacgac FAM-ccacaaacacatgcaggttatcttgg-BHQ1 200 agaceacgagaacgatatttge 400 L.AT52 R 400 92 番茄内源基因 ttettgccttttcatatccagaea FAM- t-BHQ1 200 l-ctctttgcagtcctcccttgggct- 200 cacctttctcgcaccaattgaca 水稻内源基因 SPS 200 104 tcaaactcaacagcgacgac FAM-tcegagccgtecgtgegtc-BHQ1 200
GB;/T19495.4一2018 表A.1续 终浓度产物大小 序号 基因/品系名称 引物/探针序列5'-3' 适用范围 nmol/1 bp 200 tggtgagCgttttgcagtct PLD 10 64 ctgatccactagcaggaggtce 200 FAM -BHQ1 200 ftgttgtgctgccaatgtggcctgl 水稻内源基因 200 tggtgagCgttttgcagtct 67 1 ctgatecactagcaggaggtcce GOS 200 200 FAMtgtwtgceatwswctwBHQl 400 ggacatgtgaagagacggagc UGPase R 88 12 400 马铃薯内源基因 cctacctctacccctccgc FAM-ctaccaccattacctcgcacetcctca-BHQ1 200 350 agtttgtaggttttgatgttacattgag 13 SAH7 250 l15 棉花内源基因 gcatctttgaaccgcctactg FAMaaacataaaataatgggaacaaccatgacatgt-BHQ1 175 150 gacctceatattaetgaaaggaag 14 GLuA3 150 121 甜菜内源基因 gagtaattgetccatcctgttca FAM-ctacgaagtttaaagtatgtgcegctc-BHQ1 100 caacaattttctcagccccaaca 200 15 GAG56 200 121 小麦属内源基因 ecttgcatgggttcacetgtt FAM-ttceegcagccccaacaacegcBHQ1 200 500 gtcgcgggaacagaggtgt 16 wx012 500 102 小麦种内源基因 ggtgttcctccattgcgaaa FAM-caaggeggccgaaataagttgcc-BHQ1 200 400 gatcagtgaacttcgcaaagtac 90 AIalfa-Ace 400 首藉内源基因 Ccaacgacgtgaacactacaac FAMtgaatgctectgtgatetgcceatgc-TAMRA 200 F 500 ccatgcggatcctccca 18 cHY 500 74 木瓜内源基因 R catcgtagccattgtaacactagctaa FAMttccettcatccattcecaetettgaga-BHQ1 200 转基因大豆、玉 100 gcctctgccgacagtggt 米,油菜、棉花 82 19 CaMV35S l00 水稻、番茄、马 aagaCgtggttggaacgtcttc 铃薯、番木瓜等 FAM-caaagatggacceccacccacg-BHQ1 100 外源筛选基因
GB/T19495.4一2018 表A.1(续) 终浓度产物大小 序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5'-3') 适用范围 nmolI bp 转基因大豆、油 400 cgaagaettaaagttagtgggcatet 菜、马铃薯、番 pFMV35S 400 79 茄、玉米、棉花 20 ttttgtctggtccccacaa 和首等筛选 FAM-t -BHQ P 200 -tgaaagtaatetgtcaacatcgagcagctgg 检测 转基因大豆、玉 400 atcgttcaaacatttggca 米、水稻、油菜 NOS 400 165 attgcgggactctaatcata 棉花、小麦、 、番 ,马铃薯,番木 你 AeatcegcaagaecsgcacaggBHQ1 FAM- 200 瓜等筛选检测 转基因油菜、棉 400 aggatctcgtcgtgacccat 花、玉米,甜菜 NP " 番茄,马铃薯、 22 400 183 gcacgaggaageggtea 番木瓜等筛选 FAM-eacccagccggccacagtegat-BHQ！ 200 检测 400 acaagcacggtcaacttcc 转基因油菜、玉 米、小麦、棉花、 23 BAR 400 175 actcggccgtccagtcgta 水稻,大豆等筛 选检测 FAMeegagcegcaggaacegeaggag-BHQ1 200 400 gtcgacatgtctccggagag 转基因油菜、 玉米,棉花,大 21 PAT 400 191 gcaaccaaccaagggtatc 豆,甜菜等筛选 检测 200 FAM-tggccgeggtttgtgatategttaa-BHQ1 400 gtcttcgtgttgctggaaccgtt 转基因油菜,玉 G(ox 121 米,甜菜等筛选 25 400 gaactggcaggagcgagagct 检测 FAM -BHQ1 200 -tgctcacgttetctacactcgcgctcg！ 100 gcaaatcctctggcct gcctttcC 转基因油菜、大 豆、玉米、棉花 26 CP4-EPSPS R cttgcccgtattgatgacgte 100 l46 马铃薯,甜菜、小 麦等筛选检测 FAM-tcatgttcggcggte 200 esege发BHQn Tccggttacgaggttctt 400 转基因玉米 86 Cry3A 400 马铃薯等筛选 ccatagatttgagCgtcctta 检测 200 FAM-acctatgcteaagetgccaacaccc-BHQ1 340 gtgacettaggcgaettgaac 转基因油菜、 DNOS 34o 79 28 cgcgggtttctggagtttaa 马铃薯 FAM-egcaataatggtttctgacgtatgtgettagcBHQ1 400 10
GB;/T19495.4一2018 表A.1(续》 产物大小 终浓度 序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5'-3' 适用范围 nmol/L bp 340 ggcctaaggagaggtgtggaga 转基因油菜、 25 pSSuAra R 95 340 对拟南芥是 ctcatagataaC aacgataagattcatggaatt 内源基因 FAM-cettatcggettgaaccgctggaataa-BHQ 400 gaagetgtgetagagaagatgtttattc 340 转基因油菜、 30 340 PpTA29 gctcgaagtatgcacatttagcaa ll7 对烟草是内 源基因 BHQ1 FAM 400 -agtccagccacccaccttatgcaagtc 340 gagtagataatgccagcctgttaaac 转基因棉花、 31 pUi 340 76 对玉米是内 acgcgacgctgctggtt 源基因 FAM-egtcgacgagtctaacggacaccaace-BHQ1 400 340 ggggtttcttatatgctcaacacatg 转基因玉米、 32 tCaMV35S 340 118 tcaccagtctctctctacaaatctatcac 油菜 FAMaaaccctataagaaccctaattcccttatctggga-BHQ1 400 200 转基因玉米、大 tgagaatgaacaaaaggaccatatca 豆、油菜、棉花、 33 87 tttttattcggttttegetatcg E9 200 对豌豆是内源 FAMtcattaactettctccatccattccatttcacagt-BHQ1 200 基因 340 cggteaaacetaaagactgattaea tO0cs 34 R cgctcggtgtcgtagatact 340 85 转基因油菜 FAM -BHQ1 400 ltcttattcaaatttcaaaagtgccccaggg- 340 atgcaagtttaaattcagaaatatttcaa g" 97 35 340 转基因油菜 atgtattacacataatatcgcactcagtct FAMactgattatatcagctggtacattgcegtagatg-BHQ1 400 Ccgggtgaatcagegttt 200 36 5g PMI Gccgtggcctttgacagt 200 转基因玉米 -BHQ1 200 FAM-tgecgccaacgaateaccgg 400 Ggcgactggatcaggtaca 转基因大米、玉 37 CryIA(b) 400 75 米,棉花等外源 tggggaacaggctcacgat 筛选基因 FAMcegccgegagetgaccetgaccgtg-BHQ1 200 400 CggaaatgcgtattcaattcaaC R 71 38 CRYIA(c 400 ttctggactgCgaacaatgg 任选其- FAM-acatgaacagcgccttgaccacagc-BHQ1 200 转基因水稻、 400 gaccetcacagtttggacattg 玉米、棉花 39 CRYIA(e) R 400 93 atttctctggtaagttgggacact FAMtcccgaactatgactccagaacctaccetatcc-BHQ1 200 1
GB/T19495.4一2018 表A.1(续) 终浓度产物大小 序号 基因/品系名称 引物/探针序列(5'-3') 适用范围 nmolI bp 34o tcgaggtcattcatatgcttgag 转基因玉米 10 pRice-Eaetin 95 340 对大米是内 ttttaactgatgttttcacttttgacc 源基因 FAMagagagtcgggatagtccaaaataaaacaaaggta-BHQ1 400 gggatgacgttaattggctctg 375 转基因大豆、玉 R 375 88 CTP2-CP4-EPSPS ggctgcttgcaecgtgaag 米 ,棉花、首瘤 -BHQ1 FAMcacgccgtggaaacagaagacatgace1 150 12
GB;/T19495.4一2018 附录 B 资料性附录 转基因植物品系特异性实时荧光CR检测引物探针 转基因植物品系特异性检测用引物探针序列见表B,1
表B1转基因植物品系特异性实时荧光PCR检测引物和探针序列信息表 终浓度 产物大小 作物 引物/探针序列(5'-3' 品系名称 nmol/L bp ttcattcaaaataagatcatacatacaggtt 150 GTs40-3-2 R 150 84 ggcatttgtaggagccacet 50 FAM- -MGBNFQ ccttttccatttggg-N F 150 tcccgctctagcgcttcaat R MON89788 150 139 tcgagcaggacctgcagaa P FAM-etgaaggegggaaacgacaatetg-TAMRAN 50 gcaaaaaagcggttageteet 400 A2704-12 R attceaggetgegcaaetgtt 400 64 I -TAMRA FAMeggtccteegategcctcc 200 F 400 gctatttggtggcatttttcca A5547-127 R 400 75 cactgcggccaacttacttct FAM-ccgcaatgtcataccgtcategttgt-TAMRA 200 800 cgtgttctctttttggctagc R 93 大豆 DP305423 500 gtgaccaatgaatacataacacaaacta FAM-tgacacaaatgattttcatacaaaagtcgaga-TAMRA 220 F 750 gtcgaataggctaggtttacgaaaaa DP356043 75o 99 tttgatattcttggagtagacgagagtgt T FAM-etctagagatccgtcaacatggtggagcac-TAMRA 200 F 600 cgtttcccgccttcagtttaaat R 89 MON87701 600 tggtgatatgaagatacatgcttagcat P FAM-tcagtgtttgacacacacactaagcgtgce-TAMRA 250 aacagaagtttccgttgagetttaagae 400 C127 400 88 cattegtagcteggatcgtgtae FAM -TAMRA l00 -tttggggaagctgtcccatgccc？ F 450 ttcccggacatgaagccatttac R 450 86 MON87705 acaacggtgccttggcccaaag p FAMaagagactcagggtgttgttatcactgcgg-TAMRA 250 13
GB/T19495.4一2018 表B.1续 终浓度产物大小 作物 品系名称 引物/探针序列(5'-3') nmol/1. bp E 600 catactcattgctgatccatgtagatt R MO87769 600 gcaagttgetcgtgaagttttg FAM-cccggacatgaagccatttacaattgac-TAMRA 200 F 400 agatttgatcgggctgcagg R 70 大豆 FG72 400 gcacgtattgatgaccgcatta FAMaatgtggttcatccgtett-MG;BNFQ 200 300 catacteattgctgatceatgtag R MON87708 300 91 agaacaaattaacgaaaagacagaacg FAMt -TAMRA 150 I-tcccggactttagctcaaaatgcatgta 150 cgttatgctatttgcaactttagaaca GA21 R 150 112 gcgatcctcctcgcgtt FAM-tttctcaacagcaggtgggtccgggt-TAMRA 50 atgaatgacctcgagtaagcttgttaa 150 NK603 108 aagagataacaggatccactcaaacact 150 FAMtggtaceacgcgacacactceactc-TAMRA 50 200 tgtgtggccatttatcatcga 68 Bl1 200 cgctcagtggaacgaaaactc FAM-ttccatgaccaaaatcccttaacgtgagt-TAMRA 150 300 ggccgtgaacgagctgtt 82 R gggaagaagcctacatgtttctaa Bt176 300 200 FAMagcaaccagateggccgacaccTAMRA 玉米 E 300 tcgaaggacgaaggactctaacgt R MON810 92 gccaccttccttttccactatctt 300 FAM-aacatcctttgccattgcccagcTAMRA 180 150 gtaggatcggaaagcttggtac MON863 R 150 70 tgttacggcctaaatgctgaact FAM-tgaacacccatccgaacaagtagggtca-TAMRA 50 acaagcgtgtcgtgctccae 400 R T25 400 102 gacatgatactccttccaccg FAMt -TAMRA 200 -tcattgagtegttccgccattgtcg1 Tgttactagatcgcagatcctct 400 R CBH351 400 96 ctagaaggcaa aattctaattgatc p FAM-gtcgacetgcaggcatgcaaggaattccatt-TAMRA 200 14
GB;/T19495.4一2018 表B.1续 终浓度产物大小 作物 品系名称 引物/探针序列(5'-3' bp nmol/1 F 300 tagtettcggccagaatgg R 58 Tc1507 300 ctttgccaagatcaagcg P FAMtaactcaaggccctcactccg-TAMRA 150 250 gggataagcaagtaaaagcgctc R 86 59122 250 ccttaattctccgctcatgatcag FAM-tttaaactgaaggcgggaaacgacaa-TAMRA 200 600 gcgcacgcaattcaacag MIR604 300 76 ggtcataacgtgactcccttaattct TAMRA 200 FAM- -aggcgggaaacgacaatctgatcatg" 50 tcatcagaccagattctcttttatgg 3272 R 900 95 cgtttcccgccttcagttta FAMaetgctgacgcggccaaacactg-TAMRA 200 gggttcagtctgcgaatgtt 150 LY038 R aggaattcgatatcaagettatcga 150 lll P FAcgagcsgagttatgggtcgacgg-TAMRAN 50 F 450 ttctccatattgaccatcatactcatt R 77 玉米 MON89034 450 cggtatctataatacgtggtttttaaa FAMatcceeggaaattatgtt-MGBNFQ 100 150 gagcaggacctgcagaagct R ceggagttgaecateea 95 MO88017 150 50 FAMtcccgccttcagtttaaacagagtcgggt-TAMRRA F 500 gtgtgtatgtctetttgcttggtett R 98140 gattgtcgtttcccgccttc 500 80 FAM-ctctatcgatccccctctttgatagtttaaact-TAMRA 200 300 gcgcggtgtcatctatgttactag MIR162 R 300 92 tgccttatctgttgccttcaga FAM-tctagacaattcagtacattaaaaacgtccgcca-TAMRA 150 350 cacgaaccattgagttacaatG DAs40278 350 98 ggttcattgtattctggetttg I FAM TAMRA 150 -cgtagctaaccttcattgtattccg" F 600 cacgttgaaggaaaatggattg R 82 MON87460 600 tcgcgatcct tcctcctcaaagaC P FAM-agggagtatgtagataaattttcaaagcgttagacggc-TAMRA 250 15
GB/T19495.4一2018 表B.1续 终浓度产物大小 作物 品系名称 引物/探针序列(5'-3' nmol/1. bp E 150 cccattcgagtttctcacgt R 72 MON531 150 aaccaatgccaccccactga 50 FAM-ttgtccetccacttettctc-TAMRA 150 ggagtaagacgattcagatcaaacac R 87 MON1445 150 atcgacctgcagcccaagct FAM-atcagattgtegtttcccgcettcagtt-TAMRA 50 gttaetagatcggggatatce 150 MO15985 R 150 82 aaggttgctaaatggatggga FAM a-TAMRA 50 FccgctctagaaetagtggatctgcactgaaT 500 ggctttggctaccttaagagagtc MON88913 R 500 94 caaattacccattaagtagccaaattac FAMaactateagtgttgactacat-MGBNFQ 100 cagatttttgtgggattggaatte 400 400 79 LlCotton25 caaggaactattcaactgag FAM-ctacagtactcggcegtcgacgc-TAMRA 200 棉花 400 caaatacacttggaacgacttcg GHB614 400 119 gcaggcatgcaagcttttaaa FAM-ctccats cceatggegategctaegttetagaatt-TAMRA 200 350 ctcattgctgatccatgtagatttc R ggacaatgetgggetttgtg 281-24-236 450 111 FAMttgggttaataaagtcagattagagggagacaa-TAMRA 175 E 400 aaatattaacaatgcattgagtatgatg R 3006-210-23 90 actctttctttttctccatattgace 400 FAM-tactcattgctgatccatgtagatttcccg-TAMRA 150 400 agcgcgcaaactaggataaatt T304-40 R 400 78 cctagatcttggga gataacttgaaaaga FAM-tcgcgcgcggtgtcatctatctcTAMRA 200 ccagtactaaaatccagatcatgca 400 GBH119 R 400 90 gaaattgegtgaetcaaattce FAM -TAMRA 200 -cetgcaggtcgacggccgagtac 400 agagactggtgatttcagCggg R 水稻 TT51-1(Bt63 400 119 gcgtccagaaggaaaaggaata p FAM-atctgceccagcactcgtccg-TAMRA 200 16
GB;/T19495.4一2018 表B.1续 终浓度产物大小 作物 品系名称 引物/探针序列(5'-3' bp nmol/1 F 400 agetgggtaatagegaagagg R 88 LLRice62 400 gctaacgggtgcatcgteta P FAM-cgcaccgattatttat cacct-TAMRA 200 tatacttttagtccacct 400 tctaggatccgaagcagatcgt R 68 LLRice601 400 ggagggCgCggagtgt FAM-ecacctcccaacaataaaagcgectg-TAMRN 200 400 ccgacgggaggaagac 114-7-2 400 69 cgtttcccgccttcagttta TAMRA 200 FAM- -cggaggeggcgtcaaacactg" 水稍 400 gcttggatcagattgtcgttt Kefeng6 R 400 154 gtcagataaactgattggtctgat FAM-egacaaaagatcaggatttgggCIIPSE 200 atattctgaagtggcctgt 400 400 R Kefeng8 egaccatgatgctgttctgc 171 P FAMcgttattatgagatgeg'gatetcacceatgetg-TAMRAN 200 F 300 tccgcaatgtgttattaagttgtctaa R 78 KMD1 900 ccgatatgcctgcccatct FAMegtceaattgtttacaccacaatatateeeg-TAMRA 100 150 ccatattgaccatcatactcattgct R GT73(RT73 150 108 gcttataCgaaggcaagaaagga 50 FAMttcccggacatgaagatcatcetcetTAMRA F 400 gttagaaaaagtaaacaattaatatagccgg R MS8 130 400 ggagggtgtttttggttatc I FAMaatataatcgacggatccccgggaattc-TAMRA 200 400 acgctgcggacatctacatt 油菜 MS R 400 187 ctagatcggaagctgaagatgg FAM-etcattgctgatccacctagccgactt-TAMRA 200 ctaagggaggtcaagatgtage 400 RF1 400 113 egggcctaaettttggtgtg I FAMd -TAMRA 200 etcatcatcetcacccagtcagcatca F 200 gggtgagacaatatatcgacg R RF2 200 104 gggcatcgcaccggtgag P FAM-caceggccaaattcgetcttagccgt-TAMRA 200 17
GB/T19495.4一2018 表B.1续 终浓度产物大小 作物 品系名称 引物/探针序列(5'-3') nmol/1. bp E 400 cataaaggaagatggagaettgag R RF3 400 139 agcatttagcatgtaccatcagaca FAM-egcacgcttatcgaccataagccca-TAMRA 200 400 ctaacttttggtgtgatgatgctga Oxy-235 R 400 124 cgatagatggtggtgtgagtcttg FAMagetgatggcaagttaatetccccgaagtcg-DABBCYL 200 caatggacacatgaattatgc 400 R T45 400 123 gactctgtatgaactgttegc t-TAMRN FAMt 200 tagaggacctaacagaactcgccgt 油菜 400 gcggttctgtcagtt Topas19/2 R 400 95 cgaccggcgctgatatatga FAM-tcccgcgtcatcggcgg-TAMRA 200 gttettctcttcatagctcattacagtttt 600 73496 600 84 caaacctceatagagtteaacatcttaa 250 FAMtagtagatcaggatattetg-\MGBNFQ 450 tcccttgaaccttattttatagtgcaca MON88302 450 101 tcagattgtcgtttcccgccttca FAM-tagtcatcatgttgtaccacttcaaacact-BHQ1 200 300 gtgtcaaaacacaatttacagca R tccecttaatttctecgcteatga 马铃薯EH92-527-1 300 134 160 FAMagattgtegttteecgeetteagtt-TAMRA E 800 agcgcgcaaactaggataaa R Fp967 105 亚麻 accttccggctcgatgtcta 800 FAM-cgegegcggtgtcatctatg-BHQ 100 400 tgggatctgggtggctctaact 甜菜 H7-1 R 400 108 aatgctgctaaatcctgag FAM-aaggcgggaaacgacaatct-TAMRA 100 gacgagtacaaggagacgee 400 174 木瓜 R 400 HuanongNo.l gttgtcactgaagcgggaag FAMt e-BHQ1 200 -tggctgctattggggaatcaactacl 18
转基因产品检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法GB/T19495.4-2018
实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）是一种利用聚合酶链式反应技术检测转基因产品的方法。它通过特异性引物和探针识别目标基因序列，利用荧光信号表示出PCR扩增产物的数量。
GB/T19495.4-2018是中国国家标准中关于PCR检测方法的指南。该指南描述了转基因产品检测所需的一系列步骤，包括样品准备、DNA提取、PCR扩增反应和结果分析等。在这些步骤中，实时定量PCR技术被广泛用于定性和定量检测转基因产品。
在进行PCR检测之前，需要对样品进行准备。样品的制备要求严格，以确保检测结果的准确性和可重复性。一般情况下，样品可以是食品、种子或土壤等。在收集样品时，必须避免任何可能导致污染的情况，例如使用已经接触过转基因产品的工具或容器。
接下来，需要进行DNA提取。DNA提取是将目标DNA从样品中纯化出来的过程。常用的DNA提取方法有CTAB法、快速法、商业化试剂盒法等。其中，商业化试剂盒法是最为常见的，它具有操作简便、高效、成本低等优点。
在得到纯化的DNA后，就可以进行PCR扩增反应了。PCR是利用特异性引物和聚合酶对目标DNA序列进行扩增的技术。在PCR扩增反应中，需要加入引物和探针。引物是指与目标DNA序列互补的短链DNA片段，探针则是带有荧光物质和荧光猝灭物质的双标记DNA片段。在PCR扩增反应过程中，聚合酶会复制目标DNA序列，并将探针与引物结合，释放出荧光信号。
最后，需要对PCR扩增产物进行结果分析。常用的分析方法包括比较Ct法、绝对定量法和相对定量法等。其中，比较Ct法是一种简单、快速的方法，只需要计算目标基因的Ct值（即阈值周期数）并与内参基因进行比较即可得出结果。绝对定量法和相对定量法则需要使用标准曲线来计算目标基因的绝对量或相对定量值。
总的来说，实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法是一种高效、精确、快速的转基因产品检测方法。GB/T19495.4-2018为PCR检测提供了详细的指南，对于保障转基因产品质量和监管具有重要意义。
