国家标准 GB/T29394一2012 柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定 DeteetionandideniffeationofXanthomonasa.xonopodispw.Citri 2012-12-31发布 2013-06-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/T29394一2012 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271)提出并归口本标准起草单位;全国农业技术推广服务中心,四川省植物检疫站、重庆大学本标准主要起草人:王福祥、宁红、谭家兴、项宇,郭迪金、王中康
GB/T29394一2012 柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定范围本标准规定了柑桔溃疡病菌(XYanthomonasaromoodispv.Citri)的田间症状和实验室病原形态鉴定,免疫学和PCR检验的技术要求本标准适用于芸香科植物检疫中柑桔溃疡病菌的检测和鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T50402003柑桔苗木产地检疫规程术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3 显症植株diseasedplant 受柑桔溃疡病菌侵染,并已经表现症状的寄主植物 2 3. 无症带菌植株aymptomatplhmt 受柑桔溃疡病菌侵染,但并没有表现症状的寄主植物疑似症状suspiciouslesionm 部分符合柑桔溃疡病典型症状描述或与典型症状描述相近似的症状柑桔溃疡病菌基本信息中文名:柑桔溃疡病菌学名;Xd anthomonasa.roopodispv.CiriVauterinetal1995 异名;X.camestrispv.Citri(Hasse)Dye1978 病害英文名:citruscanker,Bacterialcankerofcitrus 属于黄单袍杆菌科,黄单袍杆菌属柑桔溃疡病远距离传播主要是通过人为的引种,商品的流通带病苗木,接穗和果实等繁殖材料是该病传播的载体田间传播则是通过风雨、昆虫和农事操作等柑桔溃疡病菌的相关资料参见附录A 方法原理对于已形成柑桔溃疡病典型症状样品,由于典型症状易识别,且近似症状的病原菌为真菌(参见附
GB/T29394一2012 录B),通过菌溢检查和革兰氏染色法,可直接进行鉴定;对于有疑似症状的样品,通过病原分离培养和接种试验可进行检验鉴定;间接ELISA检验主要用于疑似症状、不显症样品的检验鉴定;PCR检验主要用于以上两种方法均不能确定时的检验鉴定,有条件的实验室也可直接用于疑似症状、不显症植株的检验鉴定仪器及用具症状及病原形态鉴定仪器及用具 6 天平、高压灭菌锅,超净工作台、培养箱、生物显微镜,体式显微镜、解剖刀接种棒,培养皿、烧杯,载玻片、盖玻片、吸管等 6.2ELISA检测仪器及用具 d 天平、,高速台式离心机、打孔器、微量移液器一套、移液器、酶标板、酶标仪等 6.3CR检测仪器及用具高速台式离心机、PCR扩增仪,PCR反应管,水平电泳仪,凝胶成像系统、微量移液器一套试剂及材料除非另有说明,在本标准中仅使用确认的分析纯试剂和蒸僧水或去离子水或相当纯度的水 7.1症状及病原形态检测试剂与材料无菌水H.O. 7.1.1 7.1.2革兰氏染色液 7.1.3蔗糖蛋白胯培养基PSA 7.2ELISA检验试剂与材料 7.2.1样品提取液;取1.15g磷酸氢二钠(NaHIPO),0.2g氯化钾(KCI),0.2g磷酸二氢钾(KHPO),8g 氯化钠(NacCl).0.2g叠氮化纳CNaN,),用100ml蒸溜水溶解,并调整p值到7.4 7.2.2洗涤液;取1.15g磷酸氢二纳(NaeHPO).0.2g氯化钾(KCI),0.2g磷酸二氢钾(KHPO, g氯化钠(NaCI),0,5g吐温-20,用1000ml蒸僧水溶解,并调整pH值到7.4. 7.2.3封闭液取5g无脂奶粉,用100mL样品提取液溶解 7.2.4包被液;取2.3只碳酸氢纳(NaHco.)I.59只氯化钠(NaCl),0.2区叠氮化钠(NaN,),用 1000mL蒸馏水溶解,并调pH值到9. 9.6 7.2.5抗体稀释液;取2.5g脱脂奶粉,加100m洗涤液溶解 7.2.6抗体;兔抗柑桔溃疡病菌抗体球蛋白 7.2.7酶标抗体;市售碱性磷酸酶标记的羊抗兔抗体球蛋白 7.2.8底物缓冲液;用80nml 灭菌蒸憎水将0.01只氯化镁(MgCl6H,O),0.02只叠氮化钠 NaN,)、9.7mL二己醇胺(CH.CH,OH)溶解后,调pH值到9.8,定容到100mL 7.2.9底物溶液;将5mg对硝基苯磷酸盐(C,H,NO,)溶解于5ml底物缓冲液中底物溶液制备需在孵育结束前10min内,避光条件下制备 7.2.10终止液:将12g氢氧化钠(NaOH),用100mL蒸溜水溶解
GB/T29394一2012 7.3 PCR检验试剂与材料 7.3.1灭菌超纯水ddH.O 7.3.2PCR缓冲液[×10] 7.3.3引物(primer): 上游引物(XAeF);5’-ACGAGAAAGAACTTCGCCCC-3’ 下游引物(XAcR);5’-TCTGACCACATcCGCATAGGA-3';用双蒸水稀释至50Mmol/L 7.3.4dNTP[25 l/L] mmo 7.3.5Mg(Cl[25mmol/1] 7.3.Taq椭[5u/l] 7.3.7 Marker:100bpDNAladder(<1500bp) 7.3.8制样液;含0.3%亚硫酸销(Na.so.)的水溶液 7.3.9电冰缓冲液TBE[5X];在1L水中加人Ti狱;4鼠,朋酸27.5g,20 mL0.5mol/LEDTA pH8.0),使用时稀释为1×TBE工作液 7.3.10琼脂糖凝胶[2%]:在1×TBE工作液中加人2%的琼脂糖,融化后在每100mL琼脂糖溶液中加人市售了L.DNA荧光染料(coavew).怜却至七倒人插人梳子的制胶情中,冷却凝固后点样电泳 7.3.11样品缓冲液L.oadingBuffer 方法 8.1症状及病原形态鉴定 8.1.1症状识别在寄主植物特别是柑桔类植物生长期,按GB/T5040-2003中第5章的要求,对苗圃和果园逐园、逐株进行田间症状目测踏查按要求采集有典型症状和疑似症状的柑桔溃疡病样本进行室内检验鉴定柑精溃疡病典型症状参见附录B 调运检疫和市场检疫发现符合附录B描述典型症状和疑似症状的寄主样本,取样送实验室检验 8.1.2菌溢检查切取具有典型症状和疑似症状病斑的病健交界处小块组织,平放在载玻片上的水滴中,加盖玻片在低倍显微镜下检查,观察有无菌溢现象如果有菌溢出现,再进行革兰氏染色 8.1.3革兰氏染色检查到菌溢的载玻片将植物组织移去,水滴干燥后通过火焰固定,再用革兰氏染色法染色.观察染色反应 8.1.4分离培养鉴定田间或其他检疫过程中取回的具有柑桔溃疡病疑似症状的样品,在无菌条件下取病健交界处组织约(2mm一3mm)×(2mm一3mm),经表面消毒后放人0.2mL无菌水中,用灭菌玻璃棒捣碎,在室温下浸泡5min~10min,将悬浮液在蔗糖蛋白陈培养基上划线,28C培养2d~4d,观察病原菌形态特征和培养特性,柑枯溃疡病菌形态特征和培养特性见附录C
GB/T29394一2012 8.1.5致病性鉴定将分离培养得到的纯培养菌株,用针刺涂抹法接种到健康的甜橙类柑桔新梢叶片上,在温度28C 30、相对湿度95%100%的条件下培养7d~10d,参见附录B观察发病症状 8.2间接ELISA检验 8.2.1取样疑似样品直接取样检验,无症样品田间取样方法见附录D 8.2.2程序柑桔溃疡病菌间接ELISA检验程序见附录E 8.3PCR检验取样 8.3.1 疑似样品直接取样检验,无症样品田间取样方法见附录D 8.3.2程序柑桔溃扬病菌PCR检验程序见附录F 结果判定 9.1症状及病原形态鉴定田间症状符合附录B描述的柑桔溃疡病典型症状特征,解剖镜检有菌溢现象,革兰氏染色呈阴性，病原菌为柑桔溃疡病菌如不能确定,进一步进行分离培养,分离培养物形态特征和培养特性同附录 C,致病性鉴定产生典型症状,病原菌为柑桔溃疡病菌 9.2间接ELISA检验 9.2.1目测观察在阳性对照反应孔为桔黄色、阴性对照反应孔无色的前提下,样品反应孔中三个重复均显示为黄色,样品为阳性,即带有柑桔溃疡病菌;样品反应孔没有颜色变化,样品为阴性,即不带柑桔溃疡病菌 9.2.2用酶标仪测定光密度值在阴性对照反应孔的光密度值(OD)<0.1、阳性对照反应孔OD值大于厂家设定阳性OD值的前提下,样品反应孔OD值大于阴性对照孔OD值的2倍,判定为阳性反应,即样品带柑桔溃疡病菌;否则判定为阴性,即样品不带柑枯溃疡病菌 3 9 CR检验在阴性对照无扩增条带、阳性对照出现一条278bp特异性条带的前提下,供试样品出现与阳性对照相同大小的特异性扩增条带,样品判定为阳性,即带有柑桔溃疡病菌;供试样品未出现与阳性对照相同大小特异性条带,样品判为阴性,即不带柑桔溃疡病菌
GB/T29394一2012 1 结果报告将实验室检验鉴定结果填人《植物有害生物样本鉴定报告>见附录F) 11 除害处理检验过程中使用的有关试料和用具,在使用完毕后应进行消毒和除害处理;经检疫鉴定后的样品应在一80C至一20保存1个月,以备复验,谈判和仲裁,保存期满后,进行灭活处理
GB/T29394一2012 附录A 资料性附录柑桔溃疡病菌其他信息 A.1分布亚洲的阿富汗,孟加拉,印度、巴基斯坦,斯里兰卡、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾,越南、缅甸、尼泊尔,老挝,柬埔寨,泰国、日本、韩国、朝鲜,马尔代夫、阿拉伯联合酋长国、也门;美洲的阿根廷,巴西,巴拉丰,乌拉丰,美国、墨西哥、伯利兹、多米尼加、海地、马提尼克、瓜德罗普;非洲的加蓬、马达加斯加、科摩罗、,科特迪瓦、毛里求斯、莫桑比克、留尼汪;大洋洲的巴布亚新几内亚,斐济、关岛,马里亚纳群岛、密克罗尼西亚群岛等国家和地区均有分布尤以亚洲国家发病最为普遍 A.2寄主植物该病菌主要侵染芸香科野生的和栽培植物在经济上造成经济损失最大的是柑桔自然侵染主要发生在柑桔属植物上,也发生在金桔上 A.3危害情况柑桔溃疡病是柑桔重要病害之一,为国内外检疫对象可危害叶片、枝叶和果实,苗圃发病,苗木生长不良,素质低下,出圃延迟;成年结果树发病,常引起大量落叶、落果,甚至枯梢,降低树势;未脱落的轻病果形成木栓化开裂的病斑,严重影响果品的外观和品质,降低了商品价值
GB/T29394一2012 附录 B 资料性附录柑桔溃疡病及柑桔疮痂病症状特征 B.1柑桔溃疡病 B.1.1叶片症状病斑初时针头大、黄白色、油溃状、扩大后叶的正反面都隆起、破裂,呈海绵状,灰白色,后病部木栓化,表面粗糙,呈灰褐色火山口状开裂病斑多近圆形,周围大多有黄色晕圈和融圈,老叶病斑黄色晕圈不明显 B.1.2枝条症状病斑近圆形或椭圆形,黄褐色,表面粗糙、隆起、无黄色晕环,几个病斑常可以愈合成片干燥情况下,溃疡病斑海绵状,木栓化、隆起,表面破裂;潮湿时溃疡迅速扩大,表面完整,边缘油溃状抗性品种在病健交界处形成愈伤组织层,通过用刀切去外部软木塞状物质而留下粗糙表面在暗绿色健康组织里可见明亮至暗褐色病斑,变色区大小,形状、深浅均有变化 B.1.3果实症状病斑与叶片上的相似,但火山口状开裂更显著,木栓化程度更高,坚硬粗糙,幼果期有时可见黄色晕圈,病部只限于果皮上,很少发展到果肉果实生育前期发生的病斑多隆起,中,后期发生的则较扁平 B.2柑桔疮痂病受害叶片仅一面出现隆起的近圆锥形病斑,另一面凹陷病斑较多时,叶片扭曲畸形病斑周围仅有黄色晕圈而无袖圈果实受害后常长出许多散生或群生的瘤状突起,疮痂易脱落
GB/T29394一2012 附录c 规范性附录柑桔溃疡病菌形态特征和培养性状 C.1形态特征菌体短杆状,两端钝圆,大小为(1.5Am一2.0m)×0.5m一0.7pm),极生单鞭毛,有荚膜,无芽抱,革兰氏染色阴性,好气 C.2培养特性病菌生长适温为25C30C,最低为5C10C,最高为35C一38C,致死温度为55C一60C min 在蔗糖蛋白陈培养基(PSA)上,菌落初呈淡黄色,圆形,全缘隆起,表面光滑,周围有粘稠状白 \0 色环带在牛肉汁蛋白培养基上,菌落圆形,蜜黄色,全缘,有光泽,表面稍隆起,粘稠状
GB/T29394一2012 附录 D 规范性附录柑桔溃疡病菌间接EL.ISA及PCR检验取样方法 D.1取样方法采取五点取样法,采摘嫩梢叶片,每株分东南西北四个方位采集将采集的标样按取样点分别装人纸袋内,并用图标记每个样点的位置,为避免交叉感染,取样人在完成每个样点的取样后应将手和取样工具进行消毒 D.2取样数量每20张叶片为1个样品 D.2.1成年树面积在3000m以内的果园,每600m抽取3个样品;面积在3000m~12000m以内的果园，每600m抽取2个样品;面积在12000m'以上的果园,每600m抽取1个样品 D.2.2种苗面积在600m'以内的苗圃,抽取3个样品;面积在600nm以上的苗圃,每600m”抽取2个样品 D.3样品存放采集的样品在2C~8C条件下保存应不超过1周,若需长期保存,应置于一70C以下,冻融不超过2次
GB/T29394一2012 附录 E 规范性附录柑桔溃疡病菌间接ELISA检验程序 E.1制样 E.1.1植物样品将供试样品剪成3cm小片,装在小塑料袋中,按照供试样品质量(g):样品提取液体积(mL)= 1:6的比例加人样品提取液,用试管底部轻压叶片,静置浸泡5nmin 取1mL样品浸出液于离心管中 10000r/rmin离心2min,弃上清液用样品提取液1mL悬浮沉淀，经10000r/min离心2min.弃上清液;重复3次 E.1.2病原菌分离物用接种环挑取一环病原菌菌液,加人1m样品提取液中混匀,经10000r/min离心2min,弃上清液;重复3次 E.2包被 E.2.1加样在制备好的样品中每管加人200ML包被液混合均匀,取100L加人酶联板各反应孔中,每个样品设3次重复设置阳性对照,柑桔健康组织浸泡液和包被缓冲液为阴性对照 E.2.2封闭将酶联板置于37笔的恒温箱中至酶联板反应孔中的样品完全干燥在每个反应孔中加人2001 4L 封闭液,置于密封且可保湿的容器中,25C恒温孵育30n min E.2.3洗板将反应孔中的液体倒出,用洗涤液加满每个反应孔,静置1 min一2min后,将洗涤液倾出,重复洗涤2次洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上,吸干反应孔中的水分 E.3结合抗体 E.3.1加抗体每孔加人10A用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的抗体,置于保是容器中,25笔孵育1 E.3.2洗板在每个反应孔加人洗涤液,倒出,再加人洗涤液,静置3min后将洗涤液倒出再重复2次洗板完成后将酶联板倒置于干净吸水纸上,吸干反应孔中的水分 10o
GB/T29394一2012 E.4结合酶标抗体 E.4.1加酶标抗体每孔加人100AL用抗体稀释液按市售产品要求进行稀释的酶标抗体孵育方法同E.3.1 E.4.2洗板同E.3.2 E.5显色每孔加人100L底物溶液 25避光孵育30min一60min,至阳性对照显色 E.6终止反应显色后在每孔中加人50L终止液 E.7结果记录 E.7.1目测观察反应孔无颜色变化为阴性,记录为“一”;反应孔黄色为阳性反应,记录为“十”,依色泽的逐渐加深记录为“十十”和“十十十” E.7.2用酶标仪测定光密度值在405nm波长下,测定和记录反应孔OD值 11
GB/T29394一2012 附录！规范性附录柑桔溃疡病菌CR检验程序制样 F.1 F.1.1无症样品取无症叶片样品10一20片,放人自封式塑料袋中,加人制样液振荡混匀后,置于25C一28C摇床上振荡培养3h,吸取浸泡液2mL，经8000r/min离心5nmin 弃去上清液,以试管底部约200AL残存液,振荡混匀后作为待测模板 F.1.2疑似样品将可疑病斑1~2个浸人0.2nm制样液中,用灭菌尖头捣碎后,室温浸泡15min,静置上清液直接作为待测模板,亦可按常规方法提取DNA后作为模板 F.1.3病原菌分离物用接种环挑取少量纯培养菌株的菌悬浮液(约1×10CFU/mL),在离心管中用0.5mL制样液稀释混匀后作为待测模板 r.2CR检测 F.2.1检测体系柑桔溃疡病PCR检测体系见表F.1.体系总体积25L/管表F.1柑桔溃疡病菌PCR检测体系每管加人量检测试剂终浓度 4l 10×PCR缓冲液 2.5 50mol/I引物对 0,25Amol/L 0.125 25mmol/L.dNTPs 0.2mmol/I 0.2 25mmol/IMgCl 2mmol/1 5U/alTaq酶 U/25l ddH.O 17.075 模板DNA 25 总体积 F.2.2PCR反应依次将R缓冲液、引物对.dNTP,MgCl.、Tuq雕.ddH,O和待测模板按照表F.1体系浓度要 12
GB/T29394一2012 求加人PCR反应管,混合均匀后放人PCR扩增仪 PCR反应程序为:95C4min(1个循环);94 30s,58C30s,72C30s(35个循环);727min,4下保存每次检验时同时设阴性对照和阳性对照管 F.3电泳取出反应管,将PCR产物8l与样品缓冲液2Al混合,加人琼脂糖凝胶的点样孔中,同时设 Marker作为片段大小标准在1×TAE电泳缓冲液中,80V电压下,电泳401 min F.4凝胶成像观察与记录取出琼脂糖凝胶放人凝胶成像系统观察,拍摄样品PCR扩增条带,记录观察结果,电子文档存档备查 13

柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定GB/T29394-2012

柑桔溃疡病菌是一种革兰氏阴性菌，属于杆菌科细菌。该病害在柑桔的多个部位都可以引起病变，包括果实、叶片、花朵等。柑桔溃疡病的感染会导致柑桔果实变形、凹陷或坑洞，并且影响果实的品质和市场价值。

检疫检测标准

为了有效防控柑桔溃疡病的传播和扩散，我国制定了GB/T 29394-2012《柑桔溃疡病菌检疫检测鉴定方法》，该标准规定了检测柑桔溃疡病菌的方法和要求。

样品采集：对于可见感染病征的样品，应在病征周围采集取样；对于不可见感染病征的样品，应在显微镜下选择健康部位进行取样。样品应保持完整，避免受到污染。
检测方法：GB/T 29394-2012标准规定了PCR法、传统培养法等多种检测方法。其中，PCR法具有灵敏度高、特异性好、快速等优点，已成为最常用的检测方法之一。
结果判断：根据PCR反应产物大小和特异性判断细菌是否存在。同时，可以通过传统培养方法观察细菌生长情况以及形态特征等来确定结果。

检测与鉴定流程

柑桔溃疡病菌检疫检测与鉴定流程通常包括以下步骤：

样品采集：按照标准要求采集样品。
提取DNA：使用DNA提取试剂盒等方法，提取细菌的DNA。
PCR扩增：根据标准要求，使用PCR反应体系对细菌DNA进行扩增。
结果分析：根据PCR扩增产物大小和特异性，判断样品是否存在柑桔溃疡病菌。
鉴定：如果检测结果为阳性，则需要进一步进行鉴定。传统鉴定方法包括生理生化特性、形态特征等，也可以通过16S rRNA序列分析、MALDI-TOF质谱分析等现代技术进行鉴定。

通过检测和鉴定，可以及时准确地发现柑桔溃疡病菌，对于防控该病害的传播具有重要意义。同时，检测和鉴定也是保障柑桔贸易安全的必要手段。在实际工作中，应该采取多种方法，结合现代技术和传统方法，开展柑桔溃疡病菌的检测和鉴定，为柑桔产业的健康发展提供有力支持。总之，柑桔溃疡病菌的检疫检测与鉴定是保障柑桔生产和贸易安全的重要措施，GB/T 29394-2012标准为此提供了科学规范的指导。我们应该加强对该标准的学习和运用，结合实际情况，积极开展柑桔溃疡病菌的检测与鉴定工作，为柑桔产业的健康发展保驾护航。