国家标准 GB/T34331一2017 黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法 TestmethodofCueumbergreenmotlemosaicvirus ytransmissionelectronmicroscopy 2017-10-14发布 2018-09-01实施国家质量监督检验检疫总局发布国家标准化管理委员会国家标准
GB/34331一2017 前言本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由全国微束分析标准化技术委员会(SAC/TC38)提出并归口本标准起草单位;浙江大学、浙江省植物保护检疫局、浙江省农业科学院本标准主要起草人:洪健、黎军英、吴建祥,周雪平、王荣洲,谢礼、宋西娇
GB/T34331一2017 引言黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cu4 ,cGMMV)是侵染西瓜,黄瓜、甜瓜、葫 ucumnbergreenmottlemosaicuirus, 芦等葫芦科作物的重要检疫性病毒病原,被列人《进境植物检疫性有害生物名录》该病毒侵染西瓜引起的褪绿斑驳病,给西瓜产业造成严重威胁典型的cGMMV为直径18nm,长度 300nmn 的刚直杆状粒子,在病毒分类学上归属于植物杆状病毒科(Virgau iridae、烟草花叶病毒属 Toaoirus s)附录A) 应用透射电子显微镜可观察其形态结构以及在细胞内的分布特征,是辅助于血清学检测和分子生物学检测的重要形态学诊断依据为了正确指导黄瓜绿斑驳花叶病毒形态学检测诊断工作,有必要制定该病毒的透射电子显微镜检测方法国家标准
GB/34331一2017 黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法范围本标准规定了应用透射电子显微镜对黄瓜绿斑驳花叶病毒进行形态学检测的技术要求和规范本标准适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的检验检疫与鉴定规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GB/T28071一2011黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 sN/T2122一2015进出境植物及植物产品检疫抽样方法 SN/T2964！一2011植物病毒检测规范术语和定义下列术语和定义适用于本文件 3.1 病毒virus -种由核酸和蛋白质外壳组成,具有侵染活性并能够自我复制的细胞内寄生病原生物 3.2 病毒粒子irionm 复制、装配完善的成熟病毒颗粒 3.3 负染色negatite stain 利用高密度的重金属盐染色液(如磷钨酸、醋酸铀等)染色后,将微小的试样颗粒包围起来,在暗背景下显示试样的形态及微细结构 3,4 超薄切片utrathinseetion 应用超薄切片机将树脂包埋的生物试样切成厚度为50nm~100nm的薄片,经电子染色后用于透射电镜观察 3.5 免疫电子显微术immunoeleectronmicrosce copy 利用抗原抗体特异性结合的原理,以抗体捕获抗原或胶体金标记的抗体为探针在透射电镜或扫描电镜超微结构水平上定位、定性及半定量显示抗原的技术方法仪器设备、试剂和材料、环境条件 4.1仪器设备 4.1.1透射电子显微镜
GB/T34331一2017 4.1.2超薄切片机 4.1.3玻璃制刀机 414超薄切片钻石刀. 4 1.5高速离心机正置光学显微镜 A6 4i7 研钵 41 微型研磨器 4.1.9涡旋振荡仪 4.2试剂和材料 4.2.1戊二醛(分析纯. 4.2.2四氧化俄(结晶体. 4.2.3丙酮(分析纯 42.4乙醉(分析纯》. 4,2.5环氧树脂包埋剂 42.6醋酸铀(分析纯) 442.7柠檬酸铅(分析纯)》 42.8瞬鹌酸(分析纯 442.9亚甲基蓝 4.2.10cGMMV多抗血清 4.2.11PCR检测离心管(0.5ml,1.5mL) 4.2.12Paraflm膜 4.2.13包埋管 4.2.14硅胶包埋板 4.2.15覆Formvar膜的电镜铜网 4.3环境条件超薄切片机、透射电镜应安装在独立的房间,工作环境应符合以下要求超薄切片机;相对湿度小于60%,温度(20士5),电源电压稳定(220士22)V,满足防震要求透射电镜;相对湿度小于60%,温度(20士5)C,电源电压稳定(220士22)V,具备仪器专用地线,接地电阻值参照仪器说明书的要求试样 5 5.1试样来源 5.1.1西瓜、黄瓜、甜瓜和葫芦等葫芦科植物的种子 5.1.2田间受cGMMIV侵染的葫芦科植物的叶,茎,花、根等新鲜材料人工接种cGMIMV的鉴别寄主和繁殖寄主植物 5.1.3 5.2取样要求 5.2.1进出境植物检疫的取样按照SN/T2122一2015的规定执行 5.2.2 田间作物取样及试样处理按照SN/T2964一2011的规定执行
GB/34331一2017 5.3试样预处理 5.3.1组织粗汁液试样:将呈现明显斑驳花叶症状的植物组织1g与1mL0.05mol/L磷酸缓冲液 pH值7.0)混合,在研钵或微型研磨器中研磨,过滤或离心后获得粗汁液种子剥皮去仁后,将种皮于液氮中研磨制备组织粗汁液,也可以在适当温度和光照条件下使其发芽后再制备获取组织粗汁液磷酸缓冲液的配制参见附录B 5.3.2提纯病毒试样:将分离提纯的CGMMV用双蒸水或0.01mol/几的磷酸缓冲液(pH值7.0)稀释至适合电镜清晰观察的浓度 5.3.3超薄切片试样;采集呈现明显斑驳花叶症状的感病植物叶片,取病叶的退绿黄化边缘部位供超薄切片前处理之用 5.4电镜试样制备 5.4.1负染色技术 5.4.1.1悬滴法;以慑子夹持铜网,用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在覆膜的铜网上,然后用滤纸片从铜网边缘吸掉多余液体,待液体干燥前,采用2%(w/w)磷钨酸负染色液(pH值6.8)进行负染色,染色时间1min一2min,干燥后待检负染色液的配制参见附录B 5.4.1.2漂浮法;在培养皿内铺上Parafl膜,用移液器吸一滴病毒试样悬液滴在Parafilm膜上;将铜网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上静置1min~2min a,然后夹起铜网,用滤纸片从铜网边缘吸除多余液体,再将铜网膜面朝下放置于在2%(u/)磷鸽酸负染色液滴(pH值6.8)上进行负染色,染色时间 min2min 1,干燥后待检 5.4.2免疫电子显微术(免疫吸附法 5.4.2.1在培养皿内铺上Parafilm膜,用移液器吸一滴1:10l;100倍稀释的CGMMV多抗血清滴在Paraflm膜上;将铜网膜面朝下放置于多抗血清液滴上,在培养皿中保湿15min 5.4.2.2用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液(pH值7.0)连续滴洗铜网,洗除多余抗血清 5.4.2.3用滤纸片吸掉余液后,将铜网膜面朝下放置于病毒试样悬液滴上,在培养皿中保湿反应30min 如种子的病毒含量低,反应时间可延长至数小时或过夜) 5.4.2.4反应结束后用20滴0.05mol/L的磷酸缓冲液、30滴双蒸憎水先后连续滴洗试样饷网 5.4.2.5用滤纸片吸除余液后,以2%(w/w)磷钨酸(pH值6.8)负染色.干燥后待检 5.4.3超薄切片试样制备 5.4.3.1前固定;将疑感染cGMMV的植物组织切成1mm×1nmm×3mm的小块,置于0.1lmol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制的2%~3%(u/o)戊二醛固定液进行前固定,在4C下固定2h 戊二醛固定液的配制参见附录B 5.4.3.2 漂洗:用0,lnmdl儿确酸缓冲液(pH值7.2)充分漂洗三次,每次I0nin一15min. 5.4.3.3后固定;经过漂洗后的试样置于0.1lmol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)配制的1%(w/z)四氧化俄固定液后固定,在4C下固定1h一2h;再用相同缓冲液充分漂洗三次,每次10min15min 四氧化俄固定液的配制参见附录B. 5.4.3.4脱水:采用50%、70%、80%、90%、95%、100%(u/u)的乙醇进行梯度脱水,各浓度脱水时间为 10min~15min 然后用纯丙酮脱水2次,每次30min. 5.4.3.5浸透与包埋:试样脱水后在纯丙酮包埋剂(1:1)浸透1h,再(1:3)浸透3h,然后在纯包埋剂中浸透12h以上用包埋管或硅胶包埋板进行试样包埋推荐采用Spurr's低黏度包埋剂或Epon812包
GB/T34331一2017 埋剂两种包埋剂的配制参见附录B 5.4.3.6聚合;包埋后的试样在包埋聚合器或恒温烘箱内进行加温聚合 5.4.3.7修块:聚合后的包埋块修成易于超薄切片的形状 5.4.3.8定位;包埋块在超薄切片机上用玻璃刀进行半薄切片,切片厚度为0,5m~1m,经1%(w/u) 亚甲基蓝染色后在正置光学显微镜下进行病变细胞定位 5.4.3.9超薄切片;修块和定位后的包埋块在超薄切片机上用玻璃刀或钻石刀切成超薄切片,切片厚度 50nm 100nm， ,用电镜专用铜网捞取超薄切片 5.4.3.10染色;采用2%w/w)醋酸铀乙醉溶液和柠檬酸铅在室温下对超薄切片进行双重染色,醋酸 min30min， nmin10min，铀染色时间15 ,柠檬酸铅染色时间5" 干燥后待检染色液的配制参见附录B 透射电子显微镜检测步骤 6.1按照透射电镜操作程序开机,抽真空至正常工作状态,调整仪器至最佳工作状态 6.2推荐加速电压范围:60kV80kV 6.3推荐放大倍率范围4000倍 20000倍 6.4悬液病毒试样的透射电镜观察;低倍率(4000倍左右)下选择负染色剂着色的电子密度较大斑点或斑块,观察样品全貌逐步提高放大倍率,寻找具有典型杆状形态特征的病毒粒子,图像精细聚焦后用cCD相机记录并储存(或者用电子底片进行拍照) cGMMv粒子的典型形态参见附录c 6.5超薄切片试样的透射电镜观察;电镜低倍率模式(50倍~1000倍)寻找切片,切换到正常放大模式观察病变的细胞逐步提高放大倍率,仔细观察细胞超微结构是否异常 cGMMV杆状病毒粒子分散或聚集分布在细胞质内,病毒聚集体中的病毒粒子呈整齐平行排列,细胞核及细胞器一般无特殊变化 cGMMV感染的细胞图像精确聚焦后用cCD相机记录并储存(或者用电子底片进行拍照) CGMMV粒子在感病细胞超薄切片中的典型形态参见附录c 血清学和分子生物学验证必要时.按照GB/T28071一2011的规定进行cGMMV的血清学检测和分子生物学检测.以验证电镜检测结果的可靠性检测结果发布 8 检测结果报告应包括以下信息: 检测报告的唯一编号 a 试样名称; b 送样人姓名、单位和地址; 小试样的接收日期检测仪器及其工作条件; 检测结果和必要的说明; 检测人签字; 8 检测报告负责人的签字; h 检测报告的页码发布检测报告的实验室名称和地址; J
GB/34331一2017 k5 检测报告的日期除害处理 CGMMV检测过程中使用的有关材料和用具,在使用完毕后应进行消毒和除害处理种子试样应保存在4C冰箱内,叶片和果实试样应保存在一20以下冰箱或冻干保存三个月备查,保存期满后进行灭活处理,以防病毒扩散
GB/T34331一2017 附录 A 资料性附录) 黄瓜绿斑驳花叶病毒相关资料学名:Cueumbergreenmottlemosaicvirus 缩写:cGMIM 中文名:黄瓜绿斑驳花叶病毒寄主范围 A.1 CGMMV在自然界主要侵染西瓜(Ctrullwslanatus)、甜瓜(Cucumi、melo)黄瓜(Cwcwmisxati D vws)、南瓜(Cucwurbitamoschaa)、葫芦(Lagenariasieraria、丝瓜(Luffacyindrica 、苦瓜(Mo mordlicacharantia)等胡芦科植物 A.2病害症状黄瓜;病株新叶出现黄色小斑点,之后出现花叶并带有浓绿色凸起,植株矮化,果实在病轻时只发生谈黄色圆形小斑点,病重时出现浓绿色瘤状突起变成畸形,果实严重受损西瓜;病株幼叶出现不规则的褪绿色或谈黄色,呈斑驳花叶状,病叶绿色部分隆起叶面凸凹不平,叶缘向上翻卷,叶片略变窄细叶片老化后症状减轻成熟期病果表面出现浓绿色略圆的斑纹,果肉变成暗红色和纤维化,呈丝瓜瓢状,俗称“血果肉”,味苦不能食用甜瓜:病株茎端新叶出现黄斑或花叶随叶片老化症状减轻抓瓜;病株叶片出现花叶,有绿色突起,脉间黄化,叶脉呈绿带状 A.3传播 CGMMV通过接触传播,也可以通过种子传播,嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之- 植株一旦发病,如果未进行灭杀处理,土壤也可以带毒,带毒土壤可以成为病害发生的侵染源蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播该病毒 A.4地理分布 CGMMV于1935年在英国首次被发现和报道目前在英国希腊、罗马尼亚、匈牙利、印度、沙特阿拉伯丹麦、德国俄罗斯、保加利亚、捷克、巴西、爱尔兰、摩尔多瓦、瑞典、芬兰、韩国、朝鲜、以色列、波兰、日本,巴基斯坦,大陆及台湾地区均有分布 A.5病毒粒子形态典型的病毒粒子为刚直杆状,直径为18nm,长度为300nm A.6基因组结构病毒基因组为正义单链RNA,全长约6.4kb,分别编码129kDa/186kDa,29kDa和17.4kDa4个
GB/34331?2017 ?5'?3'???η? A.7λ(?:???ICTV??β?,2012) uiriae" (Family);??Virgau (Genus);???To/h boUrs (Species);???Brugmansiamildmotleuirus(BMMV) mottlemosaiczuirus(CFMMV) ????? motlemosaicvirus(CGMMV ???? uC4mnber uirus(FrMV ?Fra agiba17 ???? ForPierceuirus(HLFPV ???Hibisc4s Singaporeir4sHLSV greemotllemosaiczuirus(KGMMV ????? ?Obuudla wirus(ObPV ??Olontoglossum1ringspouirus(O)RSV ??Paprikamilanottleuirus(PaMMV ??Peper mnottleuir4s(PMMoV ???Rehmannia zuirus(ReMV ???? mosaicuir4s(RMV) ?Samomn virus(sO) b1t1 puslowerbreakuirus(SFBV ????S/reptar 黨?Sunn-hemmosaicirus(sHHMV ??Tobaccolatentirus(TLV) ????Tobaccomildgrenmosaicirus(TMGMv) ???Tobaccomosaicirus(TMV) ??Tomnatomosaicirus(ToMV) ?Turnieinrelearingirus(TvCVv ??Ulucusmildmottlevirus(UMMV) ???wasabimotlevirus(wMoV ???Youcaimosaiexir4s(YoMV С????Zwucehinigreenmolemosaievirus(ZGMMV)
GB/T34331?2017 B ? ?? ?? B.1??? B.1.10.2mol/??? A?0.2nmol/?? NaH,POH.O 27.60g 31.21 NaHPO2H.O 8 ??1000mL,? B?0.2mol/?? NaHPO2H,O 35.61g Na,HPO12H.O 71.64g ??1000mL,? B.1.20.1mol/L?? B.1?A?B?,0.2nmol/L???,1??? 0.lmol/L???????????? B.1?pH????? pHH? 6.4 6.8 7.6 6,6 7.0 7.2 7,4 7.8 A? 3.5 62.5 51.0 39.0 28.0 19.0 13.0 8.50 B? 26.5 37.5 49.0 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 B.2??? B.2.1??? ????B.2 B.20.1mo/L??????? 0.2mol/1??/ml 50 50 50 50 50 50 50 12 16 20 25%???/mL 10 ??/ml 100 100 100 100 100 100 100 ?? 5.0% 1,0% 1.5% 2.0% 2.5% 3.0% 4.,0% B.2.2??? B.2.2.12%? ??(0.5g)??,ò?,???,
GB/34331一2017 人洁净棕色广口玻璃瓶内,加上25mL双蒸憎水,用洁净玻璃棒捣破安瓶然后用石蜡将广口玻璃瓶严密封口,贴上标签,置于干燥器中,4C下避光保存 B.2.2.20.1mol/儿磷酸缓冲液配制的四氧化镀固定液取等量的0.2mol/L磷酸缓冲液(pH值7.2)与2%四氧化俄贮存液混合,现配现用 B.3包埋剂配方 B.3.1环氧树脂Sspurr's低黏度包埋剂环氧树脂Spurr'、低黏度包埋剂配制见表B.3 表B.3环氧树脂Spurr's低黏度包埋剂配制表配方标准偏硬性硬性软性快速聚合缓慢聚合 ERL. -4206 10.,0g" 10.0g 10.0g 10.0g 0.0g 0.0g ERI-4221 DER-736 6,0g 5,0g 4.0g 7.0g 6.0g 6.0g NSA 26.0g 26.0g 26.0g 26.0g 26.,0g 26.0g DMAE 0.2ml 0,4ml 0.4ml 0.4ml 0.4ml 1.0ml 聚合时间70C/h 16 混合时间/d 34 3~4 34 注1:按上述比例将前三种成分混合均匀,再加DMAE催化剂搅拌配好的包埋剂在低温和防潮状态下可保存数月该包埋剂嗜氧,聚合时包埋管需要加盖在70亿温度下聚合8h即可完全聚合此包埋剂不易受溯注2:ERL4206是Vinylcyclohexenedioxide的简称它的黏度低,聚合块硬度大目前ERL-4206停产后由ERL 221作为替代品,它的黏度稍大于ERL-4206 使用ERL-4221时,需要适当增加DER-736的比例以得到硬度适中的包埋块 DER-736是Diglyeidyletherofpolypropyleneglycol的简称它属于脂肪族,有低黏度性质,可调节包埋块的硬度 NsA是Nonenylsuceinieanhydride的简称它是一种特殊的硬化剂,应避免暴露在潮湿的大气中,以防环氧或肝链的水解作用. DMAE是2-Dimethylaminoethanol的简称它是催化剂,增加催化剂的比例,可以缩短聚合时间 B.3.2环氧树脂Epon812包埋剂环氧树脂Epon812包埋剂配制见表B.4 表B.4环氧树脂Epon812包埋剂配制表 10mL 20mL 30mL 50mL 总量 40ml Epon812 10g 15 20g 25g 5g g DDSA 4.4 1.1g 2.2g 3.3g 5.5g MNA 3.9" 7.8g 1l.7g 15.6g 19.5g DMP-30 0.15ml. 0.30ml. 0.45ml. 0.60ml 0.75ml
GB/T34331一2017 注1:按上述比例配好各成分,充分搅拌30min,驱除气泡包埋样品分别在37,45C,60C下聚合12h,12h、 24 h或直接在60C温度下聚合 48h 此包埋剂易受溯,应在干燥器中保存聚合后的样品包埋块注2:Epon812是环氧树脂单体 DDSA是十二烧基琥珀酸酥(Dodeeenylsuceinic.anhyd dride)的简称它是一种可得到软性包埋块的长链脂肪族分子 MNA是甲基内次甲基二甲酸(Methylnadieanhydride)的简称,又称六甲酸瞥它有两个链环,能获得较硬的包埋块 DMP-30是2,4,6-三(二甲基氨基甲基)苯酚[2,4,6-Tridimethylaminomethyl)pheno]的简称它能加速固化过程 B,4染色液配方 B.4.12%磷钨酸负染色液称取1.0g磷鸽酸,用50nml.双蒸僧水配制成2%(w/)的水溶液,用1mol/INaOH调pH值至 6.7一6.8,过滤后4C下保存备用 B,4.2醋酸铀负染色液低盐的病毒提纯试样也可用2%(w/)醋酸铀水溶液进行负染色,具有更高的图像分辨率称取 1.0g醋酸铀,用50ml双蒸僧水配制成醋酸铀负染色液,呈淡黄色pH值4.2,室温下避光保存备用 B.4.3超薄切片染色液 B.43.1醋酸铀染色液;称取1.0只醋酸铀,用50mL50%(u/w)的乙醇配制成2%(w/)醋酸铀乙醉溶液,呈淡黄色,室温下避光保存柠檬酸铅染色液;称取稍酸铅1.33g、柠檬酸三钠1.76g,放人50m容量瓶中,加人预先煮沸 B.4.3.2 过的双蒸溜水30mL.混合后摇荡30min.混悬液呈乳白色.加1molLNaOH溶液8mL后混悬液逐渐变澄清,pH值为12,再加双蒸馏水定容至50mL,封闭瓶口 0
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黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法GB/T34331-2017详解

一、标准背景

黄瓜绿斑驳花叶病毒是一种常见的植物病毒，在黄瓜、西瓜、甜瓜等作物中广泛分布。为了减少病毒对农业生产的损害，需要开发出有效的检测方法。GB/T34331-2017就是针对黄瓜绿斑驳花叶病毒所制定的透射电子显微镜检测方法的标准。

二、适用范围

GB/T34331-2017适用于黄瓜绿斑驳花叶病毒的透射电子显微镜检测方法。该方法适用于对病毒颗粒的形态、结构、大小等特性进行观察和分析。

三、主要内容

GB/T34331-2017标准主要包含以下内容：

术语和定义：列出了与黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测相关的术语和定义。
设备和试剂：介绍了进行透射电子显微镜检测所需的设备和试剂。
样品处理：详细描述了样品的采集、制备和保存方法。
操作步骤：详细列出了进行透射电子显微镜检测的具体步骤，包括样品制备、透射电子显微镜观察等。
结果判定：对透射电子显微镜观察图像的解释和判定进行了说明。
结果报告：规定了透射电子显微镜检测结果的报告格式和内容。

四、标准意义

黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法GB/T34331-2017是对该病毒检测方面的标准化，有利于规范检测流程和提高检测水平。严格遵循该标准，可以有效地保障农业生产的正常进行，减少黄瓜绿斑驳花叶病毒对作物造成的损害。

五、总结

GB/T34331-2017黄瓜绿斑驳花叶病毒透射电子显微镜检测方法的标准化，不仅有助于提高检测效率和准确性，也方便了不同地区、不同企业之间的交流和合作。我们应该认真学习和遵守该标准，保障农业生产健康发展。