海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法

海洋石油勘探开发污染物生物毒性第2部分：检验方法

国家标准 GB/T18420.2一2009 代替GB/T18420.22001 海洋石油勘探开发污染物生物毒性 第2部分:检验方法 Biologiealtoxieityforpollutantsfrommarinepetroleumexploration andexploitation一Part2 Testmethod 2009-03-11发布 2009-11-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T18420.2一2009 目 次 前言 范围 规范性引用文件 术语和定义 原理 采样,送样和样品保存 -- 实验生物 设施和设备 试验程序 试验结果分析和判断 l0 质量控制 11检验报告 附录A 资料性附录 生物毒性试验结果原始记录表 附录B(规范性附录) 生物毒性试验结果判定流程图 附录c(资料性附录 LC和EC的计算方法 附录D(资料性附录)Spearman-Karber计算法和TrimmedSpearman-Karber计算法 附录E(资料性附录 正态性检验和方差齐性检验 19 附录F(资料性附录 Dunnett's检验和Steel's多对 秩检验 22 附录G(资料性附录)生物毒性检验报告表 26 参考文献 21
GB/T18420.2一2009 前 言 《海洋石油勘探开发污染物生物毒性》分为两个部分: 第1部分:分级; 第2部分检验方法 本部分为第2部分 本部分代替GB/T18420.2一2001《海洋石油勘探开发污染物生物毒性检验方法》 本部分与GB/T18420.2一2001相比主要变化如下 -将“96h换水式生物毒性试验”的术语和定义修改为“静水式生物毒性试验”的术语和定义 2001年版的3.2,本版的3.1),增加了“半数有效浓度”的术语和定义(本版的3.4); 在“采样、送样和样品保存”一条中增加了关于“基液”的内容(本版的5.l.1和5.1.2.2); 在“实验生物”一章增加了4种实验生物及其相关内容(本版的6.1~6.4); -增加了“基液”和“合成基钻井液”的贮备液配制方法(本版的8.1.2.1.3和8.1.2.2); 增加了以生长作为观测指标的生物毒性试验方法的相关操作(本版的8.4.6.2.2); 修订了“结果的有效性”的部分内容(2001年版的10.1,本版的9.1); 在附录中增加了部分数据处理和结果计算的方法示例,以及生长毒性试验的原始记录表(本版 的附录A一附录F). 本部分的附录B为规范性附录,附录A,附录c,附录D,附录E、附录F,附录G为资料性附录 本部分由国家海洋局提出 本部分由全国海洋标准化技术委员会(SAC/Tc283)归口 本部分起草单位;广东省实验动物监测所,国家海祥局南海分局 本部分起草人;黄韧、魏社林、吴进孝、郑偻晶、王颖,王国栋、周锦 本部分所代替标准的历次版本发布情况为 -GB/T18420.2一2001
GB/T18420.2一2009 海洋石油勘探开发污染物生物毒性 第2部分检验方法 范围 本部分规定了海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的部分污染物在生物毒性检验中 采用的试验方法,以及试验方法中有关样品的处理、实验生物,试验程序,结果判定、质量控制等要求 本部分适用于海洋石油勘探开发作业中使用或生成后并排人海洋的钻井液、基液、钻屑和生产水的 生物毒性检验,本部分限定外的污染物的生物毒性检验可参照使用 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本部分的引用而成为本部分的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本部分,然而,鼓励根据本部分达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本部分 GB17378.3海洋监测规范第3部分;样品采集、贮存与运输 GB17378.4一2007海祥监测规范第4部分:海水分析 术语和定义 下列术语和定义适用于本部分 静水式生物毒性试验satebhuetealtwsitetytst 试验期间内不更换试验溶液,进行观察、测定生物异常或死亡效应的试验 3.2 无可见影响浓度noobservedeffeeteoneentration(NoEC) 实验生物暴露在一组不同浓度的试验溶液一定时间后,通过观察实验生物的不良影响,并比较试验 组与对照组统计分析结果,判定出对实验生物无显著影响的最大浓度 3.3 半数致死浓度halrlethalconeentratonm ILC0 在一定观察期内,造成50%的受试生物死亡的毒物浓度 [GB17378.7一2007,定义3.10 3 半数有效浓度halreffteetiveconcentration EC 定观察期内,引起50%受试生物产生某一特定效应,或者是实验生物的某效应指标被抑制 在- 半时的毒物浓度,以ECa表示 原理 海洋生物的各种生理活动受海洋环境影响,通过观察测定实验生物在一定试验期间内接触试验物 质后的异常或死亡效应,得到海祥石油勘探开发污染物对实验生物有明显影响的具体浓度
GB/T18420.2一2009 采样,送样和样品保存 5.1样品的采集 5.1.1采样数量 采样量:钻井液5L,基液5L,生产水5L;采样量应足够供3次重复试验的用量 5.1.2采样地点 . .1.2.1钻井液样品从排放口或泥浆池采集 5.1.2.2基液样品采自贮存基液 5.1.2.3生产水在排放点的排放口采样 5.2包装、运输和贮存 5.2.1包装 采送样品应用惰性材料制成的容器密封包装,如聚乙烯塑料桶 5.2.2运输 按照GB17378.3的规定贮存和运输样品,受检样品应在48h内送达生物毒性实验室 5.2.3标签 所有样品容器上应标明样品名称、钻井代号、油井代号、生产或使用者、采样人、采样时间,采样方 式,采样数量等 样品送达实验室后送样人应填写送样表,样品接受人应检查样品标签和包装是否完整,并对样品进 行编号,签字和记录存档 5.2.4贮存 生产水样品应贮存于4C8C,其他样品应贮存在阴凉处 实验生物 6.1实验生物的种类 6.1.1仔虾;明对虾(Feneroenaewschinensis),斑节对虾(Peaeusmoodon)、长毛明对虾(Fen neropenaeusenicillatus)、脊尾白虾(Palaemoncarincauda),凡纳滨对虾(Lilopenaeusannamei)五种 虾的仔虾 6.1.2卤虫(Artemia) 6.1. .3 蒙古裸腹蚤(Moinamongolica 6.1.4裸项栉虾虎鱼(CenogobiusAymnauchen 实验生物来源及品质 6 2 6 .2.1仔虾 仔虾宜实验室自繁饲养,也可自货源稳定、信誉好的苗种场购买 仔虾购人后应在实验室驯养48h 后用于毒性试验,自繁饲养的仔虾应驯化24h后用于毒性试验 应选活力好,体色透明的仔虾用于 试验 6.2. 卤虫 2 可实验室自繁收集卤虫,也可购买商品卵孵化;按1.0g/L的比例取适量卤虫卵加人稀释水中,在 25C、盐度3035,光照2000lx一3000lx的环境条件下充氧孵化 应取同一批次孵出的无节幼体用 于毒性试验 蒙古裸腹潘 宜实验室自繁收集 6.2.4裸项栉虾虎鱼 宜实验室自繁收集
GB/T18420.2一2009 6.3实验生物饲养条件 6.3.1仔虾 仔虾饲养的适宜条件见表1 表1仔虾实验室饲养条件 饲养条件 长毛明对虾仔虾 脊尾白虾仔虾 明对虾仔虾 斑节对虾仔虾 凡纳滨对虾仔虾 水温/c 2225 2729 2629 2428 2330 盐度 2533 28~33 2530 2228 828 6 3 pH 7.6~8.2 7.6~8.2 7.68." 7.9~8. 8.08. 6.3.2卤虫 在水温22C一27c、盐度3035、自然光照的条件下培养,每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单 胞藻 6.3.3蒙古裸腹潘 在水温22C27C,盐度26~30、自然光照的条件下培养,每天投喂盐藻、扁藻或小球藻等单 胞藻 6.3.4裸项栉虾虎鱼 实验前1周采收受精卵并置于水温27C一28C、盐度25一32、pHH7.6一8.2条件下充气孵化,收 集初孵仔鱼并记录孵出日期,同一批收集的仔鱼孵出时间间隔不能超过24h 仔鱼的饲养条件为水温 25C- 30C,盐度2030,自然光照,2日龄投喂轮虫,15日龄后可投喂卤虫幼体或轮虫 实验生物开始试验的日龄和观测指标 6 6 4.1仔虾;小于仔虾期10dP期)的仔虾,以死亡做观测指标 卤虫;卤虫卵孵化20h~24h的幼体,以死亡或生长做观测指标 6 4. .2 o 4. .3 蒙古裸腹蚤:I龄幼体,以死亡做观测指标 裸项柑虾虎鱼;3日一10日龄的仔鱼，以死亡做观测指标 6. 4 6.5实验生物的质量控制 6.5.1实验生物应健康正常,驯养阶段的死亡率应小于10% 5.2应进行标准毒物对实验生物的24h急性毒性试验,建立各批次实验生物的24hLC范围,本试 6 验所用标准毒物为分析纯的十二烧基硫酸钠(sodiumdodeeylsulfate,SDS). 设施和设备 设施 饲养实验生物的水池或水族箱等 7.1 可控照明装置 饲养实验生物的控温,充氧循环清洁海水的设备,包括制冷和加热的控温设备、充气设备、循环 水设备,水过滤设备等 试验容器及溶液体积 7.2.1仔虾试验浴液体积应为1000mL,试验容器可采用玻璃水槽等玻璃容器 7.2. 卤虫无节幼体试验溶液体积应为100mL,试验容器可采用烧杯等玻璃容器 2 7.2. 蒙古裸腹蚤试验溶液体积应为l00ml L,试验容器可采用烧杯等玻璃容器 3 裸项栉虾虎鱼仔鱼试验溶液体积应为200mlL,试验容器可采用烧杯,水槽等玻璃容器 环境因子测定的试剂和仪器 溶氧仪、盐度计,pH计,温度计 也可采用分光光度法测定溶解氧含量,测定的试剂和仪器应符合 GB17378.4一2007第32章的规定
GB/T18420.2一2009 7.4其他 高速搅拌器、显微镜、胶头滴管、量简、手抄网、酶标板或者小离心管等 试验程序 8.1检验样品的准备 稀释水的准备 稀释水应清洁、无毒、水质稳定且对实验生物适宜,宜使用取自清洁无污染海区水质稳定的海水作 为稀释水 若条件不许可,可使用人工配制海水,配制成与纳污水体相同的盐度后使用 8.1.2贮备液的配制 8.1.2.1钻井液贮备液的配制 8.1.2.1.1水基钻井液 按体积比取1份钻井液加人9份稀释水,2000 r/min~3000r/min搅拌15min,然后加水稀释为 试验组的最高浓度,继续搅拌5min,静置60min后取上层悬浮液作为贮备液 8.1.2.1.2 油基钻井液 按体积比取1份钻井液加人9份稀释水,2000r/min一3000r/min搅拌15h至絮状,然后加水稀 释为试验组的最高浓度,继续搅拌5min,静置60nmin后,避开表面油膜,取水相部分作为贮备液 合成基钻井液 8.1.2.1.3 按8.1.2.1.2的规定配制 8.1.2.2基液贮备液的配制 按8.1.2.1.2的规定配制 8.1.2.3生产水贮备液的配制 取一定体积的生产水加人稀释水中,2000r/min搅拌15min,配制成预定浓度的贮备液 8.2组织固定液的配制 8.2.1固定液的使用 固定液用于以生长做观测指标的生物毒性试验中生物个体的组织固定 固定液可采用中性甲醛固 定液(3%5%)或鲁哥氏液 8.2.2中性甲醛固定液(3%~5% 以pH7.27.4的磷酸缓冲液为溶剂配制,配制后应密封并保存在阴凉处,保存时间不超过一个 月 3%中性甲醛固定液配方:蒸溜水925mL,加人无水磷酸氢二钠6.5g,及磷酸二氢钠4.0g,充分溶 解后加人甲醛(40%)溶液75mL 5%中性甲醛固定液配方;燕僧水875mL,加人无水磷酸氢二钠 5g，及磷酸二氢钠4.0g,充分溶解后加人甲醛(40%)溶液125mL 8.2. 3 鲁哥氏液 鲁哥氏液又称碘液,配制方法;取6g碘化钾溶于20ml蒸僧水中,搅拌到完全溶解后,加人4g 碘,等碘充分溶解后,加人801 mL燕僧水,贮存在棕色试剂瓶内 8. 3 预备试验 宜选用2种或2种以上的实验生物进行试验 以死亡率为观测指标的预试验应尽量确定出全部死 亡和无死亡的浓度范围,以生长为观测指标的预试验应确定出能引起50%以上低于100%)作用效果 和50%以下(高于0%)作用效果的浓度范围 具体操作按照8.4 正式试验 8.4.1试验浓度设置 用贮备液和稀释水配制试验溶液,参考预试验结果设定5个等比浓度组和1个空白对照组,等比系 数不宜大于2.0,每个试验组应设4个重复,每个容器应放10个实验生物个体 如果样品毒性较低,则 应保证试验死亡数据至少能满足计算LC或EC的最低要求
GB/T18420.2一2009 8.4.2实验生物移入 8.4.2.1仔虾 用手抄网在驯养池中随机选择实验生物并及时放人试验容器内 弃用跃出或损伤的生物 在试验 操作过程中,应在30min内完成分放实验生物 8.4.2.2卤虫 用胶头滴管在驯养容器随机吸取卤虫幼体,然后小心移人试验容器 尽量减少分放实验生物的时 间,尽量减少生物移人过程中对各浓度组试验溶液的稀释 8.4.2.3蒙古裸腹蚤 按照8.4.2.2规定的方法操作 8.4.2.4裸项栉虾虎鱼仔鱼 按照8.4.2.2规定的方法操作 充气要求 当试验溶液的溶解氧饱和度低于60%时,应对试验帝液进行轻微充气,充气气泡为0个/amin四 如浓度组进行充气,同样对照组也应充气 100个/min 试验的环境因子 试验过醒中水温变化范围 试验适宜的环境条件为;水温23C~28C,盐度20~35,pH7.6~8.6 不应超过2C,盐度变化范围不宜超过2,pH值变化范围不宜超过0.4 8.4.5饲喂 8.4.5.1仔虾宜饲喂卤虫无节幼体,每个仔虾每天饲喂10个卤虫无节幼体 8.4.5.2卤虫幼体和蒙古裸腹逼饲喂扁藻、小球藻等单细胞藻类，藻液离心后饲喂(离心转数 3000r/min一4000r/min)，避免加人藻液引起试验溶液体积的明显改变 .4.5.3裸项楷虾虎鱼仔鱼宜饲喂轮虫,每条仔鱼每天投喂500个轮虫,每个试验容器投喂体积不超 8. 过0.2ml 4.6观察和记录 8 8.4.6.1仔虾 毒性试验持续时间为96h,每24h观察实验生物,移去死亡个体,将死亡个体数记录在原始记录表 内,见表A.1 轻触无反应或在体视显微镜下观测心脏停止跳动均可判定为死亡 8.4.6.2卤虫 8. .4.6.2.1以死亡为观测指标的毒性试验,持续时间为96h,每24h观察实验生物,移去死亡个体,将 死亡个体数记录在原始记录表内,见表A.1 沉到容器底部的幼体在15s内仍不能游动者,即认为已 死亡 .4.6.2.2以生长为观测指标的毒性试验,持续时间为72h 72h时用吸管吸出存活个体置于酶标 o 板或离心管中,加人鲁哥氏液或中性甲醛固定液(3%5%)固定后,吸出卤虫置载玻片上,在4倍物镜 下用目镜测微尺观测体长,或使用显微镜摄像系统的软件进行体长测量,卤虫体长为尾凹到头部的最长 距离 将体长观测值记录在原始记录表内,见表A.2 8.4.6.3蒙古裸腹蚤 毒性试验持续时间为72h,每24h观察实验生物,移去死亡个体,将死亡个体数记录在原始记录表 内,见表A.1 沉到容器底部的蒙古裸腹蚤在15s内仍不能游动者,即认为已死亡 8.4.6.4裸项栉虾虎鱼仔鱼 毒性试验持续时间为96h,每24h观察实验生物,移去死亡个体,将死亡个体数记录在原始记录表 内,见表A.1 体色不透明或身体弯曲,且用胶头滴管轻吹无反应的判为死亡个体 8.4.6.5环境因子的测定和记录 每次试验溶液配制后应测定并记录各项环境因子,如溶解氧、pH值、水温、盐度等,结束试验时宜
GB/T18420.2一2009 相应地测定并记录这些环境因子 测定值记录在原始记录表上,参见附录A 试验结果分析和判断 9 结果的有效性 试验溶液的溶解氧饱和度应达到60%以上 以卤虫作为实验生物的试验,对照组的死亡率不超过 10%;以仔虾及仔鱼作为实验生物的试验,对照组的死亡率不超过20% 试验结果的判定 试验结果判定流程 试验结果判定流程见附录B. 9.2.2以死亡为观测指标的生物毒性试验 在大于或等于生物毒性容许值的试验浓度组未出现实验生物死亡,直接判定为大于生物毒性 容许值 当小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡,通过概率单位法、图表法等方法计 rkahr法计算Lc.值和置信区间 算ILC值 概率单位法、Spearman-karber法和TrimmedSpearma1 作为受检物的生物毒性结果,计算方法参见附录C和附录D. 在小于生物毒性容许值的试验浓度组出现实验生物死亡,通过计算NoEC值辅助判定受检 ,参见附录E,如符合正态检验和方差齐次检 物的生物毒性 对试验结果进行正态分布和方差齐次检验 验则采用附录F的参数检验方法(Dunnett's检验)判定NOEC值 如不符合正态检验或方差齐次检验 则采用附录F的非参数秩检验方法(Steel's多对一检验)判定NOEc值 以生长为观测指标的生物毒性试验 9.2.3 通过线性内插法计算EC,以C值作为受检物的生物毒性结果,计算方法参见附录C;可以通过 计算NOEC值来辅助判定受检物的生物毒性,按9.2.2.3规定的方法计算 质量控制 10 10.1批间和批内质量控制 10.1.1每批次试验必须同时进行标准毒物的2！生物毒性试验,通过比较IC值评价实验生物质量 的稳定性 10.1.2保证试验过程试验环境因子的稳定性,即试验期间的水温变化不应超过2C,盐度变化不宜超 过2,pH变化范围不应超过0.4,溶解氧饱和度应大于60% 原始记录 10.2 原始记录应完整,包括采样的时间和地点,试验时间、样品的保存方法,采样和试验人员签名,试验 所用的方法和技术,质量控制记录、试验的原始资料、仪器校准和维修记录,试验报告等 检验报告 11 检验报告应包括检验报告表和试验报告 检验报告表包括;送样单位,送样人、送样时间、样品名称、样品编号、样品接受人、检验依据的标准、 试验结果、出具检验结果的生物毒性试验室签章等 生物毒性检验报告表的格式参见附录G 不同试 验的检验报告应分别撰写 试验报告包括;受试样品表观描述;稀释水、贮备液和试验溶液的配制;试验所用仪器设备;实验生 物介绍;对照组和各个浓度组死亡数;用浓度反应曲线或方程表示的试验浓度与实验生物反应的关系; 检验人签名
GB/T18420.2一2009 附录A 资料性附录 生物毒性试验结果原始记录表 表A.1为生物死亡毒性试验结果原始记录表 表A.2为生物生长毒性试验结果原始记录表 表A.172h/96h静水式生物死亡毒性试验原始记录表 样品编号 受试物质 送样单位 送样日期 实验生物: 试验日期: 检验依据 样品表观性状: 对照组 mg/ 组2 组1: mg/L 时间 项目 B B 存活数 水温 0h 盐度 pH Do mg/L 存活数 本" 24h 盐度 存活数 水温 48 盐度 存活数 水温 72h 盐度 存活数 不想" 盐度 96h pH! DO mg/1
GB/T18420.2一2009 表A.1续) 受试物质: 样品编号 送样单位: 实验生物 送样日期 试验日期 检验依据 样品表观性状: 组3 mg/I 组4: mg/1 组5 mg/1. 时间 项目 D B 存活数 水 0h 盐度 pH O mg/几 存活数 水温 24h 盐度 存活数 水温 48h 盐度 存活数 水温 72h 盐度 存活数 水温 盐度 96h pH DO mg/L 检测人: 复核人:
GB/T18420.2一2009 表A.272h生物生长毒性试验原始记录表 受试物质: 样品编号 送样单位: 实验生物 送样日期 试验日期 检验依据 样品表观性状: 对照组 试验组l mg/1. 试验组2 mg/1 时间 项目 D B 水温 盐度 0h pH DO mg/1 本 24h 盐度 48h 盐度 秃" 盐度 pH DO m 72h 体长 mm
GB/T18420.2一2009 表A.2(续) 受试物质: 样品编号 送样单位: 实验生物 送样日期 试验日期 检验依据 样品表观性状: 试验组3 mg/I 试验组4: mg/1. 试验组5 mg/1 时间 项目 B D B 水温 盐度 0h pH DO mg/1 本 24h 盐度 48h 盐度 秃" 盐度 pH IO m 72h 体长 mm 10 检测人: 复核人: 10
GB/T18420.2一2009 B 附 录 规范性附录 生物毒性试验结果判定流程图 图B.1、图B.2、图B.3为生物毒性试验结果判定流程图 在小于毒性容许值(含毒性容许值 否 结果判定 试验组生物出现死亡 存活数据进行反正弦转换 概率分析 香 正态性(Shapiro-.wilk's检验 cC的计算 否 方差齐性(Bartlet's检验 95%置信限 Dunnett's检验 Steel's多对一秩检验 结果判定 NoEC值的确定 图B.1以死亡为观测指标的生物毒性试验结果判定流程 至少一个浓度组出现死亡 是 出现部分死亡(0<死亡率GB/T18420.2一2009 生长数据结果体长 正态性Shapiro-wilk's检验 线性内插法 方差齐性(Baurlket's检验 是 Dunnett's检验 EC的计算 Steel's多对一秩检验 结果判定 NoEc值的确定 图B.3以生长为观测指标的生物毒性试验结果判定流程 12
GB/T18420.2一2009 c 附 录 资料性附录 LC和EC的计算方法 C.1LC的概率单位计算法 C.1.1一组生物毒性试验的数据如下,将试验的原始数据进行浓度对数转换、死亡率查表转换为概率 单位,列表见表C.1计算表 表c.1计算表 浓度 实验生物数" 死亡数" 死亡率 浓度对数x 概率单位 % % ind ind 40 30 1.35 0,1303 4.48 0.2553 24 5,25 l.80 40 60 2.4o 0.3802 40 28 70 5.52 90 3. 20 0.5051 40 36 6.28 4.20 0.6232 40 40 100 对照 40 若对照组出现死亡时还要对各个试验组的数据进行校正,按式(C.1)进行(本例中无需进行此 步骤): C.1 "=(A一A)/(I一A) 式中: -经过校正的第i组的死亡率 加 观察的第i组的死亡率; -对照组的死亡率 C.1.2以表C.1中的浓度对数X为横轴,概率单位为纵轴做散点图,按照最小二乘法划出拟合直线 图C.1),标出概率单位为5时的浓度对数gLC,本例中lgLC=0.24,求反对数得LC.为1.74% 6.5 5.5 4.5 死亡概本 -线性(死亡概率) 图C.1浓度对数和死亡概率单位关系图 C.1.3求浓度-反应的回归方程 在直线上取距离较远的两个点如取概率单位4(y)和6(9),然后在图中读出相应的- C.1.3.1 0.035和.r=0.445,按式(C.2)计算斜率b,为4.878 C.2 =(y一/(r 一r 13
GB/T18420.2一2009 C.1.3.2将值和lgLC值代人式(C.3),计算得浓度-反应的回归方程 (C.3 y=Y十(.r一X) 式中: 任一浓度组的期望概率单位 概率单位5 概率单位为y时的浓度对数; 概率单位为5时的浓度对数 本例中 b=4.878，X=0.24 y=5十4.878(z-0.24) =4.878.r十3.829 C.1.4 检验 X 检验的公式 " =习(r一npP/np(1一p) C.4 x 式中: 实验生物数; 死亡数; -期望死亡率; -期望死亡数 n力 列出回归线检验表,见表c.2 本例中自由度为2,查表得戏ia=5.9,而回归线的尤=.396nfm>x,所以回归线符合检验 表c.2回归线的x检验表 P (r一np)9 np?" n(1一 n力 1p n一 0.1303 12 4.4649 29 1l.6 0.16 8.236 0.0194 40 0,255" 40 224 5.0742" 2.8 9,964 53 21.2 7.84 0.7868 0.380" 40 28 5.6839 75 30.0 2.0 4.00 7.500 0.5333 0,5051 40 36 6.2932 90 36.0 3.600 1.3396 c.1.5求lgLC的均数的标准误 C.1.5.1按式(C.5)求标准差S,为0.205 1/b c.5 S c.1.5.2按式(C.6)求均数的标准误S,为0.0265 S =s/ C.6 式中: 死亡概率单位在4~6范围内所用的动物数 C.1.6求IC的置信限;按式(C.7)求出lgI.C的95%置信限的对数值,为0.1881~0.2919,然后 取反对数得LC的95%置信限为1.5421%1.9584%， 95%置信限=lglC0士1.96×S C.7) C.2EC的线性内插计算法 C.2.1以某个生产水样品对卤虫生长的毒性试验为例,说明EC的计算方法,试验结果见表C.3 该 14
GB/T18420.2一2009 试验共设五个浓度组和一个对照组,每个浓度组设六个重复处理,每个重复下10只卤虫,将一个重复下 的10只卤虫体长取平均值,即得该重复下的平均体长 如果某个重复下出现死亡个体,则将存活个体 的体长总和除以10,即为该重复下的平均体长 C.2.2平均值平滑处理 C.2.2.1以线性内插法计算EC需满足的前提是,随浓度增加,各浓度组观测值(体长)递减 因此在 计算Bc,之前,需对各浓座组的平均值进行平滑处理 处理前的平均值以Y表示,处理后的平均值以 M，表示 C.2.2.2本例中,>Y,则M=,接着比较Y和Y,YGB/T18420.2一2009 EC，=C;,[M×1一户/100)一M]×(C1-C/(M,一M,)C.8 式中 样品对卤虫生长的抑制百分数; -试验组中样品抑制百分数小于50的最高浓度组的编号 第组的浓度; 第(j+1)组的浓度; M 第j组的平滑平均值; M1 第(j+1)组的平滑平均值 RCn=C ，+[M×(1一50/100)一M]×(C -C;/M一M. =400+[1.259×1一50/100)一1.14钉×(800一400)/0.262-1.144) =633.56 同样方法还可计算出样品产生25%抑制效果时的浓度ECn: BC=C +[M×(1一25/100)一M]×(C -C/M 一M =400十[1.258×1一25/100)一1.14]×800一400)/(0.262一1.144) 490.93 16
GB/T18420.2一2009 D 附 录 资料性附录 SpearmanKarber计算法和Iimmedspearmu-kKarber计算法 D.1Spearman-karber计算法 D.1.1原理和适用范围 -Karber计算法属于非参数分析法,用于估计容许值分布的均值,当分布对称时相当 Spearman- 于估计其中值 当处理和校正过的试验数据满足最低浓度组(除去对照组之外)的死亡比例为0、 最高浓度组的死亡比例为1.0,并且至少有一组在0一1.0之间时,适用本方法计算LCa及其 95%置信限 D.1.2数据平滑处理和校正 首先观察试验数据是否满足;死亡率随着受试物浓度的升高而升高即户,<<声声 指对照组的 死亡率,，指最高浓度组的死亡率) 如果不是就要按式(D.1)对数据进行平滑处理,当力<力-,时 D.1 加-1=户=十户-1/2 式中: 经过处理的第i组的死亡率 办 其次,若对照组出现死亡时还要按式(D.2)对平滑处理后的数据进行校正 =一p)/(1一. D.2 式中: 经过校正的第i组的死亡率; 经过平滑处理的第组的死亡率; 经过平滑处理的对照组的死亡率 ！ D.1.3计算m及m的估计方差Vm) 依据式(D.3)计算m值,即lgL.C.;依据式(D.4)计算m的估计方差Vv(m) 1一p)(X十X)]? D.3) mm Vvm) (D.4 rwa一两)X.m-x.门/4(-" 式中: X -第i组浓度的以l0为底的对数值; 除去对照组外的试验组数; 第i组的受试动物数; \ 经过平滑处理和校正后的第i组的死亡率 m的95%置信限为;m士2.0×、Vm,取m值及其置信限的反对数即可求出IC及IC的置 信限 D.1.4示例 表D.1为一组96h毒性试验结果的原始数据以及平滑处理、校正后的数据结果,所有试验组的受 试动物总数均为20只 17
GB/T18420.2一2009 表D.196h毒性试验结果数据表 Spearman-Karber法 TrimmedSpearmanKarber法 试验组 浓度对数 死亡数 死亡数 % 平滑处理 校正 平滑处理 校正 ind ind 对照组 0.025 0.000 0.05 0.000 6,25 0.7959 0,025 0,000 0.05 0,000 12.50 1.0969 0.025 0.000 0.067 0,013 25.00 1.3979 0.025 0,000 0.067 0.013 0 50.00 1.6990 13 0.65 0.641 0.067 0.013 16 100.00 2.0000 20 1.00 1.000 0.08 0.032 依据数据求lgLC即m,以及vG n 1 [(0.0000-0.0000)×(0.7959+1.0969]/2十[(0.0000-0.0000)X 1.0969十1.3979]/2+[(0.6410一0.0000)×(1.3979十1.6990]/2十 [(1.0000一0.610)x(1.6990十2.0000]? =1.6565 Vm=0.0000×(1一0.0000)×1.3979-0.7959):/4×19十 0.0000×(1一0.0000)×(I.6990一1.0969)/4×19十 0.6410×(1一0.6410)×(2.0000一1.3979)?/4×X19 0.001098 依据值m和Vvm)确定95%置信限为:1.6565士2.0×0.001097=(1.5903,1.7228) 对所得值取反对数,LC0=10.665=45.3 LC的95%置信区间下限为10l.:m》=38.9,上限为107a》=52. 8 D.2IrimmedSpearman- 计算法 -Karber D.2.1适用范围 当试验数据不满足概率单位计算法及Spearman-Karber计算法时,方可采用TrimmedSpearman- Karber计算法 要求浓度组数据在经过平滑处理及校正后,至少有一组数据的死亡率在01.0之间 并且所有浓度组的死亡率数据区间包括0.5 由于本方法比较繁杂,建议适用电脑分析 D.2.2对试验数据的要求及处理方法同D.1.2 D.2.3在求LC及其95%置信限时,还需要计算Trim" D Trim= D.5 nma(A, 一 式中: -经过处理和校正后的最低浓度组(除去对照组之外)的死亡比例 k 除去对照组外的试验组数; 经过处理和校正后的最高浓度组的死亡比例 加 18
GB/T18420.2一2009 附 录 E 资料性附录 正态性检验和方差齐性检验 E.1Shapirwilk's检验 E.1.1原理和适用范围 Shapiro-wilk'、检验通过用一个指标对分布的偏度、峰度进行综合检验,该方法适用于小样本资料 的正态性检验,尤其是n<50时 在本试验中,一个样本指试验组中的一个重复,样本观测值指经过反 正弦方根变换的数值 E.1.2把一组96h毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和方差列表(表E.1). 表E.196h毒性试验存活数据表 试验组 对照组 tmg/1 重复 mg/L 32 64 128 256 512 8 0.9 0,9 0,7 A 0 0.4 B 1.0 0.8 1.0 0,9 0.9 0.3 原始数据 0.9 1.0 1.0 0.8 1.0 0.4 0.5 D 0.9 0.8 1.0 1.0 0.2 1.412 1.107 1.249 1.249 0,991 0.685 A B 1.412 1.107 1.412 1.249 1.249 0,580 反正弦 方根转换 1.412 1.249 1.412 1.412 1.107 0.685 1.249 1.107 1.412 1.412 0.785 0.464 D 1.331 1.183 1.371 1.254 1.109 0.603 平均值Y S 0.0089 0.0232 0.0066 0.o155 0.0767 0.0111 E.1.3将每个样本观测值减去其所属试验组的平均值,得到集中观测值并列表(表E.2),根据所得值 和式(E.1)计算D离均差平方和),D=0.4265 2 表E. 集中观测值表 浓度组 对照组 mg/L 重复 mg/I 32 128 256 512 64 0.081 -0.076 -0,122 -0.005 -0.118 0.082 B 0.081 -0.076 0.04 一0.005 0.140 -0.024 -0.082 0.229 0.041 一0.147 0.303 0.082 D -0.082 -0.076 0.041 0.158 -0.324 -0.139 19
GB/T18420.2一2009 D= E.1 (x-x" 式中 -样本数; 第i个样本观测值; X x -所有集中观测值的平均值 E.1.4将各个集中观测值由小到大排列(表E.3)Xw(na)则资料服从正态分布;若wGB/T18420.2一2009 = E.5 si)心 式中 各试验组的自由度,f=(n一1); 每个试验组的重复数; n 包括对照组在内的试验组数(1,2,,); S% 各试验组的方差; 校正系数 lnS]/1.1296 计算得B=[18ln(0.0237)-3 习 =[18X(一3.7424)一3×(一24.7378)]/1.1296 =6.064 E.2.3当多个样本满足方差相齐时.B值近似服从自由度为(k一1)的X分布 当自由度为5,显著性 水平为0.01时,查表得临界值为15.086 由于B=6.064,差异不显著,故方差相齐 21
GB/T18420.2一2009 附 录 资料性附录 Dumet'检验和site's多对一秩检验 F.1 Dumnett's检验 F.1.1原理和适用范围 Dunnet tt's检验通过比较各试验组均数和对照组均数来判定两者之间是否有统计学上的差异 本 分析方法适用于毒性试验的原始数据符合正态和方差齐次检验后的数据分析 把一组96h污染物的 毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、总和和平均值列表,见表F.1 表F.196h毒性试验存活数据表 试验组 对照组 rmg/L 重复 mg/I 128 256 512 32 64 0,7 0.8 0.9 0.9 0.4 B 1.0 0.8 1.0 0,9 0.9 原始数据 0.9 1.0 1.0 0.8 1.0 0.4 D 0.2 0.9 0.8 1.0 1.0 0.5 A 1.412 1.107 l.249 1.249 0.991 0.685 B 1.412 1.107 l.412 l.249 l1.249 0.580 反正弦 方根转换 1.412 1.107 1.412 0.685 1.249 1，412 1.249 1.107 1.412 1.412 0.785 0,464 D 总和T 5,322 4.733 5,485 5,017 ！ 438 2.413 平均值X 1.331 1.183 1.371 1.254 1！ 109 0.603 G=T l1.319 F.1.2建立ANOVA(方差分析)计算表,见表F.2 表F.2ANoVA计算表 方差来源 自由度 离均差平方和 均方MSs=Ss/ SS 1=5 SSB SB 组间 组内 N一力=18 SSw SW 总数 N一1=23 SST 表中各项的计算公式为 SSB -G/N F.1) 下" SST 一GP/N F.2 斗， SSW=SST一SSB F.3 SB2一 F.4 sSSB/力-1) 22
GB/T18420.2一2009 F.5 Sw”=SSw/(N一 式中: 试验组和对照组的总数; N 样本含量; 第i组 本例中: n=n=n=n=l=n=4 N=24 27.408 Sr SSB 习TF/n一c八N 131.495/4一27.408'/24 1.574 SST 三 ?-wN =33.300一27.408'/24 一2.000 ssw=SsT一sSB=2.000一1.574=0.4260 SB”=SSB/一1=1.574/( 1=0.315o - o Sw'=sSw/(N一)=0.426/(24一 =0.024 6 F.1.3'值的计算,按式(F.6)进行 按式(F.6)计算值 1=(Y一Y)/V/SW又用 F.6 式中: Y 对照组的平均存活率; 第试验组的平均存活率; Y 对照组的重复样; 77 试验组的重复样 71 数据代人式(F.6)为 t=(1.331一1.183)/、0.024又AIT=1.351 计算得各浓度组的值(表F.3) 表F.3值计算表 污染物浓度 mg/1 32 1.351 64 -0.365 128 0.703 256 2.027 512 6.646 23
GB/T18420.2一2009 F.1.4方差分析T介值表(见表F.4)使用举例 当a=0.05时,查表F.4可知 值为2.41 那么 4<2.4l，h,>2.4l,从而判定NOEC为256mg/L 表F.4方差分析(Dunnet'stest)介值表 a=0.05单侧检验 n l5 2.24 2.36 2.44 2.51 2.57 2.62 16 2 23 2.34 2.43 2.50 2.56 2.61 17 59 2.22 2.33 2.42 2.49 2.54 22 2. 18 2.21 2.32 .41 2.48 2.53 2 .58 19 2.20 2.31 2.40 2.47 2.52 2.57 20 2.19 2.30 2.38 2.46 2.51 2.56 F.2stel's多对一秩检验 F.2.1原理和适用范围 Steel's检验将各试验组和浓度组编秩后,通过比较各浓度组和对照组的秩和来判定两者之间是否有 统计学的差异 本分析方法适用于毒性试验的原始数据不符合正态检验和方差齐次检验后的数据分析 F.2.2分析步骤 F.2.2.1把一组96h污染物的毒性试验结果的原始数据、反正弦方根变换值、平均值和标准离差列 表,见表F.5 F.2.2.2把每个对照组和试验组的数据进行合并,然后将对照组和每个试验组的数据从小到大排序， 统一编秩(1,2,) 当数据相同时,秩次取位置序数的平均值;最后把所有排序结果列表,并计算每个 试验浓度组的秩和 见表F.6秩计算表 F.2.2.3本例检验水平a为0.05,试验组数(除对照组)为4,查表F.7,T =10,只有1个试验组的秩和值 等于T,,而其余试验组的秩和值均大于T.,所以本例中NOEC为10% 符合生物毒性容许值 表F.5平均值和标准离差计算表 试验组 对照组 % 重复 % 5.6 l0 1.0 1.0 1.0 1.0 0.8 B 1.0 1.0 1.0 1.0 0.8 原始数据 1.0 1.0 1.0 1.0 0.7 1.0 0.9 1.0 0,8 0.6 1.412 1.412 1.412 1.412 1.107 1.412 1.412 1.412 1.412 1.107 B 反正弦 方根变换 1 1.412 1.412 412 1 .412 0.991 1.412 1.249 1.412 1.107 0.886 D 平均值 1.412 1.371 1.412 1.336 1.023 离差 0.0 0.006 0.0 0.023 0.01 214
GB/T18420.2一2009 表F.6秩计算表 试验组 对照组 重复 10 1.8 3.2 5.6 1，4125,4.5.5,6.5 1，412(5 1，412(4.5 1，412(5 1.107(3.5 1.412(5,4.5,5,6.5) 1.412(5 1.412(4.5 1.412(5 1.107(3.5) B 1.412(5,4.5,5,6.5) 1.249(1 1.412(4.5 1.412(5 0,991(2 1.412(5,4.5,5,6.5 1.412(5) 1.412(4.5 1.107(1 0.886(1 16 18 16 1d 秩和 表F.7I介值表 试验组数(不包括对照组 重复样 l0 l0 18 17 17 16 16 16 16 15 27 25 24 24 26 25 24 23 33 37 36 35 35 34 34 33 49 46 45 48 47 46 45 44 63 60 58 62 61 59 59 58 10 77 79 76 75 74 74 73 72 97 95 93 92 91 90 90 89 12 116 114 112 111 110 09 108 108 25
GB/T18420.2一2009 附录 G 资料性附录 生物毒性检验报告表 表G.1所示为生物毒性检验报告表 表G.1生物毒性检验报告表 No 样品名称 产品出品日期 种 产品编号或批号 等 级 抽送)样表号 受检单位 检验类别 委托单位 样品数量 生产单位 抽(送)样日期 抽样地点 到样日期 来样方式 样品编号 检验依握 检 验 结 论 签发人: 签发时间: 26
GB/T18420.2一2009 参 考 文 献 [1 (GB17378.7一2007海洋监测规范第7部分;近海污染生态调查和生物监测 nieity [2]AsTMEl463-92Standardguidefor conductingstaticandflow-through acutetox tests mysidsfromm with thewestcoastoftheUnitedStates， [3 USEPATestmethod-method1007.0Mysid， survival， owth，andfe mysdopsisbahia， gro cunditytest [4]UnitedStatesEnvironmentProteetionAgeneyedited Shorttermmethodsforestimating thechronictoxicityofeffluentsandreceivingwaterstomarineandestuarineorganisms Washington USEPAOfficeofWater，2002. [E5] UnitedStatesEnvironmentProtectionAgencyedited Methodsformeasuringtheacutetox iicityofeffluentsandreceivingwaterstofreshwaterandmmarineorganismms. USEPAOf w.ashingtont ficeofWater，2002.