牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留量的测定液相色谱-串联质谱法

国家标准 GB/T22971一2008 牛奶和奶粉中安乃近代谢物 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determtnationofmetaholitersidwesofdipyrome nmilkandmilkpowder一LC-MS-MSmethod 2008-12-31发布 2009-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 国家标准化管蹬委员会国家标准
GB/T22971一2008 前 言 本标准附录A,附录B为资料性附录 本标准由国家质量监督检验检疫总局提出并归口 本标准负责起草单位;秦皇岛出人境检验检疫局、深圳出人境检验 检疫局 本标准主要起草人:沈金灿谢丽琪、肖陈贵、朱玉兰、熊贝贝、林燕奎、庞国芳
GB/T22971一2008 牛奶和奶粉中安乃近代谢物 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 范围 本标准规定了牛奶和奶粉中安乃近代谢物4-甲酰氨基安替比林(4-formmylanminoantipyrine)、4-乙酰 氨基安替比林(4-acet ylaminoantipyrine)、4-甲基氨基安替比林(4-methylaminoantipyrine)和4-氨基安 替比林(4-aminoantipyrine)的液相色谱-串联质谱测定方法 本标准适用于牛奶和奶粉中4甲膝氨基安替比林.4乙肤氨基安替比林、4甲基氨基安替比林和 4-氨基安替比林残留量的测定 本标准的方法检出限为:对于牛奶,4-甲酰氨基安替比林、4-氨基安替比林、4-甲基氨基安替比林 和4乙酰氨基安替比林均为5.04g/kg;对于奶粉,4-甲酰氨基安替比林、4氨基安替比林、4-甲基氨基 安替比林和4-乙酰氨基安替比林均为40.04g/kg 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款 凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本 凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第1部分:总则与定义 GB/T6379.12004,ISO5725-1:1994,IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度第2部分;确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.22004,ISO5725-2:l994,IDT GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682一2008,ISO3696;1987,MOD 原理 牛奶和奶粉中安乃近代谢物残留加人Tris溶液后用乙晴提取,提取液经正己熔脱脂净化,液相色 谱-串联质谱仪测定 4-乙酰氨基安替比林、4-甲酰氨基安替比林和4-氨基安替比林采用外标法定量， 4-甲基氨基安替比林采用内标法进行定量 试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水 甲醇;色谱纯 4.1 4.2异丙醇 4.3乙睛:色谱纯 4.4三羟甲基氨基甲炕(Iris) 4.5乙酸铵;色谱纯 4.61.0mol/LTris溶液:准确称取12.1g三羚甲基氨基甲婉,用水定容至100m 样品定容溶液:甲醇-水(119)
GB/T22971一2008 4.85mmol/儿乙酸铵溶液:准确称取0.385g乙酸铵,用950mL水溶解,用乙酸将溶液调至pH3.0. 再加水定容至1000mL 4甲基氨基安替比林(4-methylaminoantipyrinv e,CHN,0,CAs;519-98-2)、4-乙酰氨基安替比 林(4-acetylaminoantipyrine.CHN,O.CAS:83-15-8)、4-甲酰氨基安替比林(4-formylaminoanti yrine,C2H3N.O.,(CAS:1672-58-8)和4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine,CHNO,CAS:83-07-8)标 N 准物质;纯度>99% 10内标标准物质;4异丙基氨基安替比林(4-isopropylantipyrine,CHN,O),纯度>99% 4. 100mg/1标准储备溶液;准确称取适量的各种安乃近代谢物标准物质(4.9),用甲醇(4.1)配制 4.11 成浓度为100mg/I的标准储备溶液,避光一18C保存 4.121.0mg/L混合标准储备溶液吸取每种适量标准储备溶液(4.11),用甲醇稀释成1.0mg/L的 混合标准工作溶液,避光一18C保存 4.13100mg/L内标储备溶液;准确称取适量的内标标准物质(4.10)用甲醇(4.1)配制成浓度为 100mg/L标准储备溶液,避光一18C保存 4.141.0mg/L内标工作溶液;吸取适量的内标储备溶液(4.13),用甲醇稀释成1.0mg/ml的内标标 准工作溶液,避光一18C保存 4.15基质混合标准工作溶液;吸取适量的混合标准储备溶液(4.12)和适量内标工作溶液(4.14),用空 白样品提取液配成浓度为l.0g/儿L5.04g/L,10.0g/L,20.0g/L40.04g/L100g/I和内标浓 度为10.0g/L.的基质混合标准工作溶液 当天配制 4.16滤膜;0.2pm 仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪;配有电喷雾离子源(ESsI) 5.2旋转蒸发仪 5.3旋涡混匀器 5.4分析天平;感量0.lmg和0.01g . 5 移液器:10L~100L和100L1000L 5.6带刻度聚丙烯离心管;15ml和50mL,具塞 5.7低温离心机转逃大于5000r/mmm,可制冷到4C 5.8容量瓶;25mL 5.9鸡心瓶 试样的制备与保存 试样的制备 取不少于500g有代表性的牛奶或奶粉,充分混匀,分为两份,置于样品瓶中,密封,并作上标记 6.2试样保存 牛奶置于4C冰柜中避光保存,奶粉则在室温下置于干燥器保存 测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 称取5g试样,精确至0.01g,置于50mL带刻度的聚丙烯离心管(5.6)中,加人100L内标工作
GB/T22971一2008 溶液(4.14)和0.5mL1.0mol/L的Tris溶液(4.6),再加人10mL乙睛,旋涡混合1min,振荡提取 15min,4C下5000r/min离心5min,提取液转移至25mL容量瓶(5.8)中 再加人8ml乙睛,重复 上述操作,合并提取液,用乙定容至25mL,混匀 7.1.2奶粉 取12.5是奶粉.稍确至0.al发,置于10mL烧杯中,加适量3五c 50C水将其溶解,待冷却至室 温后,加水至总重量为100g,充分混匀后准确称取5g(精确到0.01g)样品于50ml.聚丙烯离心管中 按7.1.1步骤进行处理 7.2净化 取5.0mL提取液至干净的15mL离心管中,加人3.0ml乙晴饱和过的正已烧,旋涡振荡3min. 4C下5000r/nmin离心5nmin,弃去正己婉层 将乙睛层转移至鸡心瓶(5.9)中,再加人5.0mL异丙醉,在40C下旋转蒸发至近干 残渣加人 1.0mL样品定容溶液(4.7)溶解,混匀后过滤膜(4.16),供液相色谱-串联质谱测定 7.3空白基质溶液的制备 称取阴性样品5g(精确至0.01g),按7.1和7.2步骤操作 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下 色谱柱:C色谱柱,l.7pm,50mm×2.lmm(内径)或相当者; a b 柱温:40C; 进样量:10L c d)流动相,流速及梯度洗脱条件见表1 表1流动相、流速及梯度洗脱条件 时间/min 甲醇/% 流速/ml/min) 5mm nmol/儿乙酸铵溶液(pH3.0)/% 0.25 95 0.25 85 15 3.0 10 4.0 0.25 90 0,25 95 4.！ 5,5 0.25 95 7.4.2质谱参考条件 质谱参考条件如下 离子源电喷雾离子源， a b)扫描方式:正离子扫描; 检测方式:多反应监测(MRM):; 电喷雾电压:3000V; 碰撞气;氧气 辅助气流速:750L/h， 辅助气温度:350C; g h 离子源温度:l05C; 参考保留时间、定性离子对、定量离子对、碰撞能量及锥孔电压见表2.
GB/T22971一2008 表2安乃近代谢物测定的质谱参数 参考保留时间 定性离子对 定量离子对 碰撞能量！ 锥孔电压 化合物名称 m/:) m/:) eV mmin 28 232/104 21 2.76 232/104 4-甲酷氨基安替比林 232/83 21 28 204/159 12 30 2.95 204/159 +氨基安替比林 13 30 204/83 218/56 15 24 2.39 218/56 4-甲基氨基安替比林 13 218/97 24 13 32 246/228 2.79 246/228 4-乙肤氨基安替比林 32 246/104 22 30 4-异丙氨基安替比林 246/56 l16 3.28 246/56 13 30 内标 246/125 4.3液相色谱-串联质谱测定 7. 7.4.3.1定性测定 每种被测组分选择1个母离子,2个以上子离子,在相同实验条件下,样品中待测物质和内标物的 保留时间之比,也就是相对保留时间,与基质混合标准工作溶液中对应的相对保留时间偏差在士2.5% 之内;且样品中各组分定性离子的相对丰度与浓度接近的基质混合标准工作溶液中对应的定性离子的 相对丰度进行比较,偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度K K>50 20GB/T22971一2008 -样品溶液所代表最终试样的质量,单位为克(g) n 计算结果应扣除空白值 4甲基氨基安替比林结果按式(2)计算 1000 X= -× *是x一*尝x" 1000 式中: -试样中被测物残留量,单位为微克每千克(ug/kg); -基质标准工作溶液中被测物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL) -试样溶液中被测物的色谐峰面积; 基质标准工作溶液中被测物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的浓度,单位为纳克每毫升(ng/mL); 基质标准工作溶液中内标物的色谱峰面积; 试样溶液中内标物的色谱峰面积 -样液最终定容体积,单位为毫升(mL); 试样溶液所代表试样的质量,单位为克(g) 计算结果应扣除空白值 精密度 一般规定 本部分的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,重复性和再现性的值 以95%的可信度来计算 重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限",牛奶和奶粉中4种安乃 近代谢物的添加浓度范围及重复性方程见表4 表4添加浓度范围及重复性和再现性方程 单位为微克每千克 重复性限r" 再现性限R 化合物名称 添加浓度范围 4-甲酰氨基安替比林 5.050 gr=0.9814lg川一0.5435 lgR=0.9031lgm一0.5016 4-氨基安替比林 5,050 lgr=1.0221lgm一0.6365 lgR=0.9649lgm-0.5252 牛 奶 4-甲基氨基安替比林 5.050 lgr=0.8383lgm-0.4033 lgR=0.8449lg川-0.4098 4-乙酰氨基安替比林 5.050 lgr=1.0333lgm-0.6554 lgR=0.9731lgm-0.547 手-甲酷氨基安替比林 40.0400 lg 0,8907lgm一0,2969 lgR=0,9931lgm一0.515 lgr=1.l079 -0,8764 4氨基安替比林 gR=1.0879g朋一0.7730 40.0400 奶 lgm 粉 40.0400 lgr=0,8218lg川一0,1982 R=0.9789lgm朋一0.5250 小甲基氨基安替比林 e 4-乙酷氨基安替比林 40.0一400 lgr=1.1130lgm一0.8071 lgR=1.0793lgm一0.7428 注:m为两次测定结果的算术平均值 如果差值超过重复性限r,应舍弃试验结果并重新完成两次单个试验的测定 9 再现性 在再现性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过再现性限R,牛奶和奶粉中4种安乃 近代谢物的添加浓度范围及再现性方程见表4
GB/T22971一2008 附 录A 资料性附录 标准物质的多反应监测(MRM)色谱图 四种安乃近代谢物标准物质及内标物的多反应监测(MRM)色谱图.见图A.1 2.95minm 2.39min 2.76min 100% 100% 00% 204/159 218/56 246/228 书" 个行 2.00 2.00 4.00 4.00 2.00 4.0o min min lmin 4氨基安替比林(AA 4甲基氨基安替比林(MAA) 4-甲酰氨基安替比林(FAA 2.79min 3.28min 100% 100% 232/83 246/56 个羊 2.00 2.00 4.00 Hmin /min 4乙酰氨基安替比林(AAA) !异丙氨基安替比林(内标,.Is 图A.15.0g/儿安乃近标准物质及内标物的多反应监测(RM)色谱图
GB/T22971一2008 附 录 B 资料性附录 回 收 率 本方法对于牛奶中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据,见表B.1 表B.1牛奶中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据 安乃近代谢物名称 添加浓度/ug/kg 平均回收率/% 5.0 97.5 10,0 92.8 4甲酰氨基安替比林 20.0 96.0 50.0 91.9 5.0 96.7 88 6 10.0 4-氨基安替比林 20.0 83.7 50.0 85.5 5.0 80.4 84.7 10.0 4-甲基氨基安替比林 20.0 84.2 50.0 85.5 5.0 90.2 10.0 95.1 4-乙酷氨基安替比林 20.0 97.9 50.0 901 本方法对于奶粉中4种安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据,见表B.2 表B.2奶粉中安乃近代谢物的添加浓度及其平均回收率试验数据 安乃近代谢物名称 加浓度/4g/kg 平均回收率/% 40.0 81.2 80.0 97.5 4甲酰氨基安替比林 160.0 97.9 400,0 96.6 40.0 81.5 80.0 90. 8 4-氨基安替比林 98. 8 l60.0 400.0 92.7 40.0 78.4 80.0 88.1 4-甲基氨基安替比林 l60,0 98.4 400.0 96.1 40.0 79.7 80,0 93.6 1乙酰氨基安替比林 60.0 99.4 400.0 94.3